一种从全细胞催化液中提取4-羟基异亮氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从全细胞催化液中提取4-羟基异亮氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

4-羟基异亮氨酸((2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种新型胰岛素分泌促进剂，可用于治疗Ⅱ型糖尿病。L-4-羟基异亮氨酸是存在于胡芦巴属植物中的一种非蛋白氨基酸，这种氨基酸主要存在于胡芦巴种子中，约占该种子中游离氨基酸总含量的80％。传统中药胡芦巴应用于治疗晚期糖尿病、消化不良、胃溃疡、消化紊乱、肿瘤、痛经、体虚、过敏、神经衰弱、痛风和关节炎等。

除了从葫芦巴种子中提取分离，4-HIL的合成方法主要有化学-酶法和酶催化法。化学-酶法合成4-HIL的步骤复杂，中间副产物多且转化效率较低。并且，在分离提取4-HIL的过程中，需要使用氨水从离子交换柱上洗脱4-HIL，这将导致含氨氮废水的产生。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有的化学-酶法合成4-HIL时，步骤复杂、转化效率低，且分离提取时产生氨氮废水的问题。

[技术方案]

本发明提供了一种从全细胞催化液中提取4-羟基异亮氨酸的方法，所述全细胞催化液是将重组大肠杆菌细胞、底物、缓冲液混合，于28-32℃条件下，转化20-24h，得到全细胞催化液；将全细胞催化液进行超滤除去菌体、经离子交换法纯化4-HIL，采用离子交换法时以氢氧化钠溶液作为洗脱剂并利用电导率来判断收集液的终点，再经脱色、浓缩结晶、二次脱色、浓缩结晶得到4-HIL产品。

所述全细胞是重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，所述异亮氨酸双加氧酶来源于枯草芽孢杆菌。

所述全细胞催化液是按照下述方法得到的：将菌体细胞、底物、缓冲液混合，于28-32℃条件下，转化20-24h，得到全细胞催化液；转化体系中，菌体细胞的浓度是120-180g/L，异亮氨酸的浓度是80-100g/L、α-酮戊二酸的浓度是80-120g/L、Vc(用作还原剂)的浓度是8-12g/L、七水合硫酸亚铁(用作辅因子)0.3-1.0g/L。

从全细胞催化液中提取4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将全细胞催化液(转化液)利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；

(2)对清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是732阳离子交换树脂，待吸附饱和后，先用水洗4～8柱体积，然后，用1-2％的氢氧化钠溶液进行洗脱，收集折光≥0.1、电导率≤1000μs/cm的洗脱液；

(3)向洗脱液中添加12-15％的活性炭，于55-60℃脱色30min-60min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL粗品；

(4)向粗品中添加10-15倍质量的水，再加12-15％的活性炭，于55-60℃脱色30min-60min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL产品。

[有益效果]

本发明以全细胞作为催化剂，以异亮氨酸为底物，底物转化率可以达到98％，结合超滤和离子交换手段，产品中4-HIL的纯度可以达到99.5％。

本发明利用氢氧化钠替代氨水进行洗脱，因此，不会排放含氨氮的废水。

本发明利用电导率来准确判断洗脱液的收集终点。

具体实施方式

下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。

4-HIL的检测方法：HPLC；柱子：C18，波长254nm，流速0.8ml/min，流动相是甲醇：水：磷酸＝0.55:0.45:0.001，进样量10μl。

实施例1重组大肠杆菌细胞的培养方法

重组大肠杆菌细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达来源于枯草芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶。

试管种子培养基：蛋白胨(Oxoid)10g/L、酵母膏(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L，自来水溶解，定容后分装试管(4mL/管)，121℃灭菌20min。使用前加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。

摇瓶种子培养基：蛋白胨(Oxoid)10g/L、酵母膏(Oxoid)10g/L、NaCl 10g/L，自来水溶解，用NaOH调节pH至7.0。分装500mL摇瓶，每瓶100mL，121℃灭菌20min。使用前加入50μg/mL的卡那霉素。

发酵罐初始培养基：甘油5g/L、蛋白胨(Oxoid)5g/L、酵母膏(Oxoid)5g/L、Na

a、利用灭菌牙签挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到装有4mL种子培养基的试管中，37℃、200rpm摇床中振摇培养10h，OD

b、将步骤a得到得种子液按照7％的接种量接入发酵罐培养基去，将发酵罐温度和搅拌转速分别设置为37℃和400rpm，通气量调至1vvm(3L/min)。待发酵罐各参数稳定后，在火焰保护下将200mL种子液接入发酵罐中，发酵开始。随着细胞生长，溶氧(DO)下降，当DO降至30％以下时提高搅拌转速，至转速升高至500rpm。发酵过程中流加酸碱调节pH在7.0左右。发酵开始2h后每隔1h取样，检测发酵液中的细胞浓度(OD

c、放罐，离心收集菌体。

实施例2应用重组大肠杆菌全细胞合成4-HIL的方法

(1)称取异亮氨酸90g、α-酮戊二酸100.5g、VC10.6g、七水合硫酸亚铁0.45g，加自来水溶解，倒入5L发酵罐中，调节料液pH至7.0，加入离心后菌体用量150g，自来水补足至3L，加入泡敌0.5ml，转化条件：30℃，250rpm，1vvm通气量反应，反应24h，收集所得转化液。

实施例3 4-HIL的提取

(1)将实施例2得到的转化液利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；

(2)对7L清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是2L的732阳离子交换树脂(柱子型号2.5L*2串联、WA-2填料)，上样流速1.2L/h；吸附饱和后，用15L水洗，然后用1％的氢氧化钠溶液进行洗脱，收集得到折光≥0.1、电导率≤1000us/cm的洗脱液6L，其中，4-HIL的含量为3％；

(3)向洗脱液中添加15％的活性炭，于60℃脱色30min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL粗品120g；

(4)向100g粗品(含水量20％)中添加1L的水，再加15％的活性炭，于60℃脱色30min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL产品40g。纯化收率＝40g/100g×80％＝50％，纯度99.5％。

实施例4 4-HIL的提取

(1)将实施例2得到的转化液利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；

(2)对7L清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是2L的732阳离子交换树脂(柱子型号2.5L*2串联、WA-2填料)，上样流速1.2L/h；吸附饱和后，用10L水洗，然后用2％的氢氧化钠溶液进行洗脱，收集得到折光≥0.1、电导率≤1000us/cm的洗脱液；

(3)向洗脱液中添加12％的活性炭，于55℃脱色50min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL粗品；

(4)向粗品中添加12倍质量的水，再加12％的活性炭，于55℃脱色50min，抽滤、浓缩结晶，干燥得到4-HIL产品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。