一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物制剂制备的技术领域，具体涉及一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂及其制备与应用的技术领域。

背景技术

我国是世界第一养鸡大国，年养鸡总量超过40亿只份，新疆肉鸡存栏数4000万-5000万只，蛋鸡存栏数700-800万只。鸡大肠杆菌病居鸡细菌疾病之首，约占33％。我国每年因大肠杆菌病死亡鸡3107万多只，经济损失3亿多元。据不完全统计，鸡大肠杆菌病给鸡场造成的直接或间接经济损失占饲养成本的8％-11％。传统药物防治方法已经面临耐药性、用药成本升高以及污染环境等问题的挑战。另外，由于长期使用抗菌药，使产品存在药物残留，导致品质下降，很难满足绿色健康养殖的要求。

噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。利用噬菌体预防和治疗细菌性疾病引起了人们的关注。现今，噬菌体的运用越来越广泛。利用噬菌体治疗具有一些先天胜的优势：自身的繁殖能力强、裂解细菌的特异性较强、无耐药性、无残留等。现有技术中，鸡大肠杆菌病采用噬菌体制剂进行治疗具有良好的效果。但噬菌体治疗同时也有很多局限性，大多数噬菌体治疗的宿主谱较窄，并且噬菌体作为异源性物质在体内存留时间短，噬菌体能够刺激免疫系统产生抗体抑制杀灭细菌，但机体防御系统尤其是网状内皮系统能够使噬菌体被快速清除，同时在使用过程中不易掌握噬菌体的最佳治疗时间和使用剂量。合适的噬菌体制剂和恰当的给予噬菌体途径对于治疗不同部位细菌感染疾病效果相差很大。单噬菌体制剂相比，噬菌体鸡尾酒制剂可以防止在治疗过程中噬菌体抵抗菌株的产生。

本课题组前期对于，通过双层琼脂平板法分离得到7株鸡致病性大肠杆菌裂解性噬菌体，分别命名为Ecp1、Ecp2、Ecp3、Ecp4、Ecp5、Ecp6、Ecp7，并进行了简单混合饮水饲喂，测定了对于三黄鸡的相关生长性能，获得了较好的饲喂效果。在此基础上，为进一步提升噬菌体鸡尾酒制剂对于肉鸡养殖中的饲喂效果及凸显经济附加值，探寻效果更优的制剂。

发明内容

针对现有技术中存在现有的噬菌体制剂治疗鸡大肠杆菌病技术方案中混合噬菌体制剂成份复杂，且对于后期鸡肠道菌群的稳态易被破坏，生长情况受到影响的不足问题，为此，本发明利用致病性大肠杆菌裂解性噬菌体与益生菌组伍，制备治疗性微生态制剂，旨在预防治疗的同时提高产品的附加值。本发明的目的在于提供一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂，对于改善大肠杆菌噬菌体制剂治疗鸡大肠杆菌病对于肠道菌群的稳态易遭到破坏，生长情况受到影响具有良好的改善作用，能够显著稳定鸡肠道菌群的稳态，使接受治疗的鸡群在大肠杆菌病感染过程中成活率显著提升的同时，肠道健康发育，料肉比显著降低，对于降低养殖成本具有良好的效果。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明具体提供一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂，所述的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂包含大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6、混合益生菌及海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙、柠檬酸钠。

优选的，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:(1-3)

更优选的，所述的大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6混合体积比比例为1:1:1。

本发明中，采用的Ecp2、Ecp3、Ecp63株噬菌体，通过纯化培养，对其形成的噬菌斑及具体形态观察，并结合分子水平鉴定为常规的大肠杆菌噬菌体，噬菌体均为农业部允许使用的无害安全菌株，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述3种噬菌体的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。

所述的混合益生菌包含微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)。

优选的，微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)的发酵液活菌数比值为1:1:1:1:1:1。

本发明中，采用的微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)6株菌均为农业部允许使用的无害安全菌株，全部购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述6种菌的培养条件及培养基都可采用本领域常见报道获得。

进一步，本发明具体提供一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：

(1)将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

(2)将微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)分别活化培养，测定活菌数达到10

(3)向1.0L浓度为10g/L的海藻酸钠水溶液中加入10mL的步骤(1)中制备的混合噬菌体液体，噬菌体-海藻酸钠液体中海藻酸钠与噬菌体的配比满足20g海藻酸钠∶10

(4)向1.0L浓度为20g/L的海藻酸钠水溶液中加入10mL的步骤(1)中制备的混合益生菌液体，噬菌体-海藻酸钠液体中海藻酸钠与益生菌的配比满足20g海藻酸钠∶10

(5)将步骤(4)中制备获得的微球在成膜后用55mmol pH7.4的柠檬酸钠溶液进行液化处理，即制得鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂。

本发明提供经过上述制备工艺获得的一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂在肉鸡饲养中的应用。

所述的，一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂在肉鸡饲养中的应用，添加剂量为0.5ml/只。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明利用致病性大肠杆菌裂解性噬菌体与益生菌组伍，并结合特定的制备方法，制备获得治疗性微生态制剂，旨在预防治疗的同时提高产品的附加值，通过采用本发明提供的一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂，显著改善饲养过程中鸡群在大肠杆菌病感染情况，过程中成活率显著提升的同时，三黄鸡的成活率高达到99.20％，料肉比低至2.40，对于肉鸡养殖领域能够凸显经济效益。

(2)本发明提供的一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂，通过采用3株噬菌体与7种益生菌的组合，并结合特定含量的海藻酸钠和壳聚糖、氯化钙、柠檬酸钠进行包被，有利于混和噬菌体在肠道内缓慢释放与混合益生菌的定植，对于改善大肠杆菌噬菌体制剂治疗鸡大肠杆菌病对于肠道菌群的稳态易遭到破坏，生长情况受到影响具有良好的改善作用，在提升鸡群在抗大肠杆菌病感染过程中成活率显著提升的同时，肠道健康发育，饲喂过程中未出现泡沫盲肠粪便、橙色粪便和大滩盲肠粪便、"勾料"、"料粪"及足部病变等显著的肠道菌群紊乱的相关临床症状出现。制备的一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂对于肉鸡养殖领域具有巨大的潜在开发价值。

附图说明

无

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中采用的试剂有：LB培养基、海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙、柠檬酸钠。

本发明中采用的仪器设备有：单人双面洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；海尔4℃冰箱：山东青岛海尔集团；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；恒温培养震荡箱：上海智城分析仪器制造有限公司；台式离心机：德国Hettich；超速冷冻离心机：美国Thermo；KDM型可调温电热套：江苏南通加热设备有限公司；涂布器；恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；电子天平(JY1002上海精密科学仪器有限公司)；微孔滤膜(0.22μm)：上海兴亚净化材料厂(和过滤膜安装后进行高压后使用)；微量移液枪：美国eppendorf；培养皿；高压锅；游标卡尺等。

所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂

本发明具体提供一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂，所述的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂包含大肠杆菌噬菌体Ecp2、Ecp3、Ecp6、混合益生菌及海藻酸钠和壳聚糖、氯化钙、柠檬酸钠。

所述的混合益生菌包含微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)。

实施例二：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂的制备方法

本发明具体提供一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂的制备方法，具体的生产步骤如下：

(1)将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

(2)将微小乳酸菌(L.minor)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、肠乳杆菌(L.intestinalis)、嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)分别活化培养，测定活菌数达到10

(3)向1.0L浓度为10g/L的海藻酸钠水溶液中加入10mL的步骤(1)中制备的混合噬菌体液体，噬菌体-海藻酸钠液体中海藻酸钠与噬菌体的配比满足20g海藻酸钠∶10

(4)向1.0L浓度为20g/L的海藻酸钠水溶液中加入10mL的步骤(1)中制备的混合益生菌液体，噬菌体-海藻酸钠液体中海藻酸钠与益生菌的配比满足20g海藻酸钠∶10

(5)将步骤(4)中制备获得的微球在成膜后用55mmol pH7.4的柠檬酸钠溶液进行液化处理，即制得鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂。

实施例三：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂

将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

实施例四：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂

将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

实施例五：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂

将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

实施例六：一种鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂

将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

实施例七：不同噬菌体混合比例效果测定

将分离得到Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌体从-80℃冰箱取出，将相应的宿主菌用液体LB扩增繁殖8-12h，取菌液和噬菌体各1ml加入5ml装有LB液体培养基的试管中，37℃160r/min震荡培养8-12小时，测定噬菌体效价达到10

将采集的鸡粪样品用去离子水稀释制成悬液，加入氯仿，在10000r/min下离心10min。取上清液并用高压过的0.22μm滤膜过滤除菌，制成粪水滤液备用，取30mlLB液体培养基加入装有60ml粪水滤液的250ml锥形瓶中，再取45株经液体LB培养的鸡致病性大肠杆菌悬液1ml加入锥形瓶中，37℃振荡培养24h，10000r/min离心10min，用0.22μm的滤膜对上清液过滤除菌。取45个高压过的EP管，用微量移液器向每管分别加入新鲜培养的45株鸡致病性大肠杆菌悬液0.2ml，再加入处理后的液体0.2ml，操作时注意更换枪头，通过轻微振荡使其充分混匀，在室温下静置10-15min，使噬菌体混合液和宿主菌充分吸附。再将EP管中宿主菌和噬菌体的混合物加入到5ml已溶化的0.7％LB半固体培养基(温度在50℃左右)中，再次轻微振荡加以混匀，然后将其均匀地铺在1.8％的固体LB琼脂上，待其凝固后，于37℃恒温温箱中经过8-12h的倒置培养，然后对噬菌斑的生长情况进行观察。

通过观察发现，按照1:1:3、1:1:2、1:1:1体积比例混合的混合噬菌体液体对于鸡粪样品中纯化的大肠杆菌均具有裂解效果，其中按照1:1:1体积比例混合的混合噬菌体液体所产生的噬菌斑最大。

实施例八：鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂饲喂效果测定

基于上述实施例三至实施六，对于制备获得的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂饲喂效果进行测定。

(1)生长情况测定效果

饲养管理条件按照刘功成在《裂解性噬菌体与抗菌肽在肉鸡养殖中的应用分析》中相同的方案进行饲养管理及饲喂试验，设定氟苯尼考和氧氟沙星饲喂组、Ecp1作为单一噬菌体试验组、Ecp1-Ecp7的混合作为混合噬菌体试验组、实施例三至实施例六中制备获得的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂组1、组2、组3、组4，分别按照0.25ml/只，0.50ml/只，1.00ml/只的浓度梯度进行饲喂。测定饲养过程中的成活率及料肉比。测定结果如表1所示。

表1：饲喂效果测定结果

P>0.05表示差异性不显著；0.01

通过上述表1中测定结果所示，本发明提供的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂饲喂效果优于刘功成在《裂解性噬菌体与抗菌肽在肉鸡养殖中的应用分析》中提供的相关方案，制剂组1-4组在成活率及料肉比指标中均优于其它组；制剂1-3组饲喂效果优于制剂4组，可见不同的制剂制备流程对于鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂效果的发挥具有影响作用；制剂3组饲喂效果优于制剂1组和制剂2组，表明不同混合比例噬菌体对于料肉比和成活率具有影响作用，其中Ecp2、Ecp3、Ecp6的3株噬菌按照1:1:1体积比例混合获得饲喂效果最佳。在制剂3组饲喂量为0.5ml/只时，料肉比达到最低，显著低于其它各饲喂组。因此，采用实施例五中提供的技术方案制备获得的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂结合0.5ml/只的饲喂量，三黄鸡的成活率达到99.20％的最高水平，料肉比低至2.40。

(2)肠道菌群稳态情况观测效果

通过对上述试验组饲喂过程中，观测肉鸡肠道菌群失调主要临床症。测定结果如表2所示。

表2：肠道菌群稳态情况观测结果

通过上述测定结果，本发明提供的技术方案制备的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂饲喂组，均未出现泡沫盲肠粪便、橙色粪便和大滩盲肠粪便、"勾料"、"料粪"及足部病变，表明本发明提供的技术方案制备的鸡大肠杆菌治疗性微生态制剂对于维持肉鸡肠道菌群的稳态能够达到较好的效果，相对照而言，采用设定氟苯尼考和氧氟沙星饲喂组、Ecp1作为单一噬菌体试验组、Ecp1-Ecp7的混合作为混合噬菌体试验组均有部分肠道菌群紊乱的相关临床症状出现。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。