改造的CIK免疫细胞在治疗癌症中的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种改造的CIK免疫细胞在治疗癌症中的用途。

背景技术

CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。

CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1％―5％。CIK特点CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1％～5％，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。实验证明，扩增出的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而非CD3-CD56+NK细胞。同时发现在CD3+CD56-的T细胞中，除CD4-CD8-T细胞外，其余三种T细胞亚群(CD4-CD8+、CD4-CD8-、CD4+CD8+)均可通过体外多因子培养而获得CD56分子的表达，而由于CD4+CD8+细胞和CD4-CD8-细胞在正常人外周血中含量极低而间接提示此CD3+CD56+细胞绝大多数来源于外周血中CD4-CD8+T细胞。而由于CD4-CD8-T细胞在培养1个月后有近56％的T细胞同时表达CD56和CD3，表明其也是CIK细胞的重要来源。比较CD3+CD56+CIK细胞中表达CD8+和CD8-,的两群细胞其杀瘤活性没有显着性差异，提示CIK细胞的细胞毒性与CD3CD56表达成相关趋势，而与CD8的表达未表现出相关性。

CIK细胞能够通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：CIK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤：CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性：体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡：CIK细胞在培养过程中表达FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞凋亡。

由于外源性IL-2、IL-7、IL-12可以显着促进淋巴细胞的生长，研究表明IL-7对T细胞生长具有直接的作用。近年来，随着基因技术的发展，多种细胞因子基因的转染由于CIK细胞扩增对外源性细胞因子有依赖，因此通过基因转移方法将相关基因转入CIK细胞，不仅可减少外源性细胞因子的使用量，还可提高CIK细胞自身的抗瘤活性。比如将包含人IL-2基因片段的重组质粒用电穿孔法导入CIK细胞治疗转移性实体瘤，发现转染后细胞可分泌较高水平的IL-2。虽然转染前后CIK细胞表面各种膜蛋白表达并无显着变化，但体外检测转染后CIK细胞在增殖率和细胞杀伤活性上均高于未转染细胞。

但是目前高活性的外源性细胞因子基因已经是本领域普遍的追求，如陈曦等开发了高效低毒的新型IL-2突变体，但是针对IL-7的研究还不够多。因此，开发IL-7高效突变体是目前重要的研究方向。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种增强的IL-7的突变体以及含有所述突变体的CIK细胞。

一方面，本发明提供一种改进的增强的IL-7突变体mut3，其基因序列如下所示(SEQ ID NO：2)。

进一步的，本发明还提供一种转基因CIK细胞，所述细胞转染了SEQ ID NO：2所示的IL-7mut3突变体基因。

进一步的，本发明提供一种药物组合物，包含本文所述修饰的CIK细胞和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本申请还提供了通过给予有此需要的受试者有效抑制癌细胞量的本发明修饰的CIK细胞或本发明药物组合物来抑制癌细胞的方法。不受任何特定理论的约束，据信修饰的CIK细胞通过一种或多种CIK细胞功能抑制癌细胞：增强细胞毒性，刺激癌特异性T淋巴细胞增殖或IFN-分泌。

本发明药物组合物或修饰的CIK细胞的给药途径包括，但不限于，静脉内，肌内，皮下，口服，局部，皮内，透皮，皮下，胃肠外，直肠，脊柱或表皮给药。在一个实施方案中，修饰的CIK细胞通过静脉注射或输注给药。

本申请的药物组合物可以制备成注射剂，液体溶液或悬浮液，或适合于在注射前在液体载体中溶解或悬浮液的固体形式。

将本发明的修饰的CIK细胞配制成药物组合物，用于递送至哺乳动物受试者。CIK该药物组合物单独给药，和/或与药学上可接受的载体，赋形剂或载体混合。CIK合适的载体是例如盐水(例如生理盐水)，葡萄糖，甘油，富血小板血浆(PRP)等及其组合。CIK此外，该载体可含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂或助剂。CIK药学上可接受的载体可包含生理上可接受的化合物，其起到例如稳定，或增加或减少本申请的药物组合物的吸收或清除速率的作用。CIK生理上可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，洗涤剂，脂质体载体，或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。CIK其它生理上可接受的化合物包括润湿剂，乳化剂，分散剂或防腐剂。本申请的药物组合物还可以包括辅助物质，例如药理学试剂，细胞因子或其它生物反应调节剂。

修饰的CIK细胞或本发明的药物组合物可按计划在适合年龄的时间段内以单剂量治疗或以多剂量治疗给予，CIK受试者的体重和状况，CIK所用的特定组合物，CIK以及给药途径，CIK无论修饰的CIK细胞或本发明的药物组合物用于预防或治疗目的，CIK例如，CIK在一个实施例中，CIK本申请的修饰的CIK细胞或药物组合物每月给药一次，CIK每月两次，CIK每月三次，CIK每隔一周，CIK每周一次，CIK每周2次，每周3次，每周4次，每周5次，每周6次，每隔一天，每天)，每天2次，每天3次或每天4次。

所述药物组合物被配制为包含有效量的本发明修饰的CIK细胞，其中所述量取决于待治疗的动物和待治疗的病症。任何特定受试者的特定剂量水平取决于多种因素，包括特异性修饰的CIK细胞的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，给药时间，给药途径，排泄速率，药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。本申请的修饰的CIK细胞的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围为至少约1×10

本发明的药物组合物也可以联合治疗给药，即与其它试剂联合给药。例如，联合治疗可以包括本发明的组合物与至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂。在一个实施方案中，这样的治疗剂包括一种或多种抗炎剂，例如甾体药物或NSAID(非甾体抗炎药物)。优选的试剂包括，例如，阿司匹林和其它水杨酸盐，COX-2抑制剂，如罗非考昔(Vioxx)和塞来考昔(Celebrex)，NSAID如布洛芬(Motrin，Advil)，非诺洛芬(Nalfon)，萘普生(Naprosyn)，舒林酸(Clinoril)，双氯芬酸(Voltaren)，吡罗昔康(Feldene)，酮洛芬(Orudis)，双氟尼沙(Dolunisal)，萘丁酮(Relafen)，依托度酸(Lodine)，奥沙丙嗪(Daypro)和吲哚美辛(Indocin)。

在又一个实施方案中，药物组合物还包括这样的治疗剂包括一种或多种化学治疗剂，例如紫杉醇衍生物，紫杉萜，吉西他滨，5-氟尿嘧啶，阿霉素(阿霉素)，顺铂(铂醇)，环磷酰胺(细胞毒素，原细胞毒素，Neosar)。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以与化疗剂联合给药，所述化疗剂优选在患有乳腺癌，肺癌，胃癌，前列腺癌和/或卵巢癌或其它癌症类型的患者中显示出治疗功效。

其它按组织学类型分类的癌症，可能是根据本申请的治疗组合物的合适靶点，包括但不限于肿瘤肿瘤；未另外指明的癌(NOS)；癌，未分化，巨噬细胞和纺锤体细胞癌；小细胞癌，乳头状癌，鳞状细胞癌淋巴上皮癌；基底细胞癌毛基质癌；过渡细胞癌乳头过渡细胞癌；腺癌，胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌，合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉病，大肠杆菌；实体癌，类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌，疏色癌；嗜酸细胞癌；亲水性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌，颗粒细胞癌；滤泡性腺癌，乳头状和滤泡状腺癌；非胶囊化硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大腺腺癌；皮脂腺癌；宫颈腺癌；粘膜表皮样癌；膀胱癌，乳头状膀胱癌，乳头状浆液性膀胱癌；粘液性膀胱癌，粘液性腺癌；印章环细胞癌；浸润性导管癌；骨髓癌，小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌W/鳞状上皮化生；胸腺瘤；卵巢基质瘤；鞘瘤；粒细胞瘤；成纤维细胞瘤；Sertoli细胞癌；间质细胞瘤；脂细胞瘤；副神经节瘤；乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤，黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；巨色素性痣中的黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣；肉瘤，纤维肉瘤纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤，平滑肌瘤，横纹肌肉瘤，胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤，混合肿瘤肿瘤，莫来石混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤，间充质瘤；Brenner肿瘤；叶状瘤；滑膜肉瘤，间皮瘤；胚芽发育不良；胚胎癌，畸形瘤卵巢囊肿；绒毛膜癌；间皮瘤；血管肉瘤；血管内皮瘤；卡波西肉瘤；血管瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤，皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤，成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；Ewing′s肉瘤；牙源性肿瘤；成纤维细胞性齿肉瘤；成釉质细胞瘤；成纤维细胞纤维肉瘤；松质瘤；弦瘤；胶质瘤；室管膜瘤，星形细胞瘤，原生质星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；成纤维细胞瘤；成胶质细胞瘤，少突胶质瘤，少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤，神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤，成视网膜细胞瘤，嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤；神经纤维肉瘤；神经瘤；粒细胞瘤；恶性淋巴瘤，霍奇金氏病，霍奇金氏病；副肉芽肿淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，细胞大，扩散；恶性淋巴瘤，滤泡，真菌病；其它特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病，淋巴白血病，浆细胞白血病；红细胞白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病，嗜碱白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病，肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛状细胞白血病。

有益效果

本发明通过针对IL-7的空间结构分析筛选获得了特异性的高活性IL-7的突变体，将所述突变体基因导入到CIK细胞后能够显著的增强肿瘤杀伤作用，具有极好的应用效果。

附图说明

图1IL-7二级结构分析图

图2IL-7及突变体的生物活性结果图

图3IL-7基因相对表达量结果图

具体实施方式

为了更进一步的说明本发明的目的、技术方案和优点，我们结合以下具体实施例来阐述本发明，这些实施例仅为了更好的说明本发明专利，而不用于限制本发明范围。基于本发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性的情况下所得到的其他所有实施方式均属于本发明所保护的范围。

实施例1 IL-7突变的制备及活性鉴定

根据IL-7的蛋白质序列，采用蛋白质机器学习，根据IL-7结构信息分析了核心结构序列，从图1的结构可以看出，IL-7分子以α螺旋结构为主要构象，其结构内所含有的二硫键是IL-7分子生物活性必不可缺的。由于IL-7必须经过与其受体IL-7R相结合之后才能表现出生物学效应，针对所述结合的空间结构位点，通过计算机模拟，发现在蛋白的中间长螺旋位置提高碱性氨基酸的比例，能够提高IL-7与IL-7R结合的效率。具体的在SEQ ID NO：1的基础上，获得了SEQ ID NO：2-3二个突变体hIL-7mut3和hIL-7mut2。将所述序列通过生物合成并且在上游添加BglII酶切位点，在下游添加NotI酶切位点。

将所述SEQ ID NO：1-3合成的序列和pET32a(+)载体，分别用限制性内切酶Bgl II和Not I酶切得到带有互补粘性末端的目的基因和载体，用T4 DNA连接酶连接后转入DH5a中，涂布在固体LB培养基上(含有Amp抗性)。挑取阳性菌落经质粒PCR验证后，选取验证为正确的质粒进行测序(上海生工有限公司)，经测序确定重组质粒pET32a—hIL-7、pET32a—hIL-7mut3和pET32a—hIL-7mut2构建成功后，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选得到含有重组质粒pET32a—hIL-7、pET32a—hIL-7mut3和pET32a—hIL-7mut2的工程菌。

将到含有重组质粒pET32a—hIL-7、pET32a—hIL-7mut3和pET32a—hIL-7mut2的工程菌分别接种有氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃，摇床转速为180rpm的条件下进行过夜培养。过夜培养结束后，按照体积比V菌落：V培养基＝1:100的比例将其转入到加有抗生素的培养基中，在相同的条件下继续培养，待检测到菌落OD600值达到0.6上下时，向其中加入0.8mmol/L的IPTG诱导剂，在37℃恒温箱中振荡培养4h。取小量菌体，沉淀重悬于50mmol/L PB，pH 8.0中；超声裂解后进行超声破碎，离心，将上清和沉淀分别进行电泳，三个蛋白均是包涵体形式表达。

超声破菌后，得到包涵体，用bufferA(50mmol/L PB；2mol/L盐酸胍pH8.0)洗涤，然后溶解于bufferB[(6mol/L盐酸胍，50mmol/L PB，100mmol/L巯基乙醇(B—ME)pH8.0]lg：10ml中，待其完全溶解后，离心20000×g，30min，弃沉淀得到蛋白变性液。将蛋白变性液移入透析袋中，4h换液1次，梯度透析，最后换到50mmol/L PB，pH8.0的缓冲液中透析两次，20000g离心lh，弃沉淀得到复性的蛋白溶液。

将复性的蛋白溶液进行镍柱纯化。镍柱平衡：平衡溶液(50mmol/L PB，150mmol/LNaC1，pH8.0)；重组蛋白上样；洗脱：①用洗脱溶液1(20mmol/L PB，150mmol/L NaC1，50mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱杂蛋白，②用洗脱溶液2(20mmol/LPB，150mmol/L NaC1200mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白，过滤除菌，备用。

2E8细胞增殖法测定IL-7生物学活性：用缓冲液RPMI 1640+20％FBS+0.05mM2-巯基乙醇将前述制备的hIL-7、hIL-7mut3和hIL-7mut2稀释至1μg/mL后在96孔细胞培养板中进行梯度稀释，hIL-7标准品从invivogen公司购买采用同样条件稀释；完成稀释后以100μL/孔转移至新的96孔细胞培养板中；离心收集2E8细胞，用PBS清洗细胞2次，计数后用缓冲液RPMI 1640+20％FBS+0.05mM 2-巯基乙醇重悬至一定的浓度，以50μL/孔加入到装有不同浓度IL-7标准品或待测样品的96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2条件下培养细胞48h，加入5mg/mL MTT溶液20孔；37℃放置4h，然后加入MTT溶解液15OμL/孔，使用多通道移液器吹打孔内液体均匀，放入酶标仪中，以630nm为参比波长，测定OD570值，结果取2复孔的平均值，利用softMaxpro5.2软件，通过四因子回归进行曲线拟合以及样品活性计算。样品生物学活性结果如图2所示。

从图2的结果可以看出，与标准品相比，hIL-7活性稍弱，而hIL-7mut3突变体能够显著的提高促进2E8生长的速度在1000pg浓度下OD570nm达到了1.8，而hIL-7mut2突变体并没有展现较好的促生长作用，活性相对于标准品反而有所降低，这充分说明，并非任意的突变都可以提高相应的活性。

实施例2 CIK细胞的制备

取健康的外周血30ml，用人淋巴细胞分离液密度梯度离心(2000×g，20min)，轻轻吸取灰白色层单个核细胞，置于15ml离心管中，经生理盐水洗涤3次。用CIK培养基(含低浓度IL-2、IFN-γ、IL-12和anti-CD3)悬浮细胞，调整细胞密度1×10

细胞培养15d后，取一定数量细胞洗涤离心，用PBS调整细胞密度至1×10

表1 CIK细胞表型

从表1可以看出，分离获得的CIK细胞主要是CD3+或者CD3+CD16+CD56+细胞，说明培养的细胞已经是CIK细胞。

实施例3转基因CIK细胞的制备

将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别插入到pcDNA3.0质粒中，以空质粒pcDNA3.0作为对照。转化大肠杆菌DH5α后测序确认，用Endo-free Maxiplasmid Ex.traction Kit大提质粒。

应用方波电穿孔仪进行基因转染。将培养至第15天的实施例2制备的处于对数生长期的CIK细胞用无血清RPMI1640培养液洗涤两次，用转染缓冲液调整细胞密度为5×l0

RT-PCR检测IL-7基因转录转染后收集CIK细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，电泳鉴定并定量后，取8μg RNA于42％进行1小时的反转录反应，取反转录产物5μl为模板以IL-7上下游引物进行PCR扩增，具体反应条件为94℃，55s；57℃，50s；72℃,60秒，热循环32次，最后72℃延伸1O分钟。产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定.以对照为相对表达基础，结果如图3所示。

经RT—PCR检测证实CIK-hIL-7mut3和CIK-hIL-7细胞内确有IL-7mRNA转录(图3)，并且相对于对照，并且相对于对照，表达量均有5倍以上的提高。

实施例4 CIK细胞的杀伤实验

肺腺癌细胞株SPC-A-1的培养将在液氮中冻存的SPC-A-1复苏后用含10％IMDM的培养基培养至生长旺盛期，用0.25％胰酶消化，用IMDM培养液洗涤后，调整细胞数为5×10

第1组：SPC-A-1对照；

第2组：CIK-hIL-7+SPC-A-1(50：1)；

第3组：CIK-hIL-7mut3+SPC-A-1(50：1)；

第4组：CIK(空载体)+SPC-A-1(50：1)；培养48h。培养结束前4h加入MTT，用酶标仪在292nm处测OD值。杀伤活性＝[(1一实验组OD值一效应细胞OD值)/靶细胞OD值]×100。结果如表2所示。

表2 CIK细胞对SPC-A-1细胞杀伤活性

从表2的结果可以看出，CIK细胞中导入hIL-7后会增强对癌细胞的杀伤率，特别是导入突变的hIL-7mut3后，其杀伤率显著提高到(85.49±4.03)％。由于CIK细胞(cytokine—induced killer)因其具有NK细胞的非特异性杀伤作用，对肿瘤细胞的杀伤性无MHC限制的特点，以及强大的T淋巴细胞的抗瘤活性，也被称为NK细胞样T淋巴细胞，在肿瘤细胞免疫方面发挥着重要作用。特别是转入了hIL-7mut3的CIK细胞具有较好的肿瘤治疗的应用前景。

序列表

<110> 北京创世客生物技术有限公司

<120> 改造的CIK免疫细胞在治疗癌症中的用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtttcatg tgtctttcag gtatattttt ggcctgcctc cactgattct ggtgctgctt 60

cccgtggctt cctctgactg cgacatcgag gggaaagacg gcaagcaata cgagtcagtg 120

ctcatggtgt ctatcgatca gctgctcgac agcatgaaag aaatcggatc taattgtctg 180

aataacgaat ttaacttctt caagcgccat atctgcgatg ctaacaagga gggcatgttc 240

ctgtttaggg cagctaggaa actgcgccag ttcctgaaaa tgaactccac tggggatttt 300

gatctgcatc tgctcaaggt cagtgaaggc accacaattc tgcttaactg caccggacaa 360

gtgaagggcc ggaagcccgc ggcactgggg gaggcgcagc caacgaaatc actggaggaa 420

aacaaaagcc tgaaagagca aaaaaaactg aacgatctgt gcttcctgaa gcgactgctg 480

caagagatca agacgtgctg gaacaagatt ctgatgggaa ctaaggagca ctga 534

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtttcatg tgtctttcag gtatattttt ggcctgcctc cactgattct ggtgctgctt 60

cccgtggctt cctctgactg cgacatcgag gggaaagacg gcaagcaata cgagtcagtg 120

ctcatggtgt ctatcgatca gctgctcgac agcatgaaag aaatcggatc taattgtctg 180

aataacgaat ttaacttctt caagcgccat atctgcgatg ctaacaagga gggcatgttc 240

ctgtttaggg cagctaggaa actgcgccgc ttcctgaaaa tgaactccac tggggatttt 300

gatctgcatc tgctcaaggt cagtgaaggc accacaattc tgcttaactg caccggacaa 360

gtgaagggcc ggaagcccgc ggcactgggg gaggcgcagc caacgaaatc actggaggaa 420

aacaaaagcc tgaaagagca aaaaaaactg aacgatctgt gcttcctgaa gcgactgctg 480

caagagatca agacgtgctg gaacaagatt ctgatgggaa ctaaggagca ctga 534

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtttcatg tgtctttcag gtatattttt ggcctgcctc cactgattct ggtgctgctt 60

cccgtggctt cctctgactg cgacatcgag gggaaagacg gcaagcaata cgagtcagtg 120

ctcatggtgt ctatcgatca gctgctcgac agcatgaaag aaatcggatc taattgtctg 180

aataacgaat ttaacttctt caagcgccat atctgccgcg ctaacaagga gggcatgttc 240

ctgtttaggg cagctaggaa actgcgccag ttcctgaaaa tgaactccac tggggatttt 300

gatctgcatc tgctcaaggt cagtgaaggc accacaattc tgcttaactg caccggacaa 360

gtgaagggcc ggaagcccgc ggcactgggg gaggcgcagc caacgaaatc actggaggaa 420

aacaaaagcc tgaaagagca aaaaaaactg aacgatctgt gcttcctgaa gcgactgctg 480

caagagatca agacgtgctg gaacaagatt ctgatgggaa ctaaggagca ctga 534