一种FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化学技术领域，尤其是一种FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物及其在治疗/预防恶性肿瘤和白血病相关药物的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，其发病率及死亡率呈逐年递增的态势。据统计，2012年全球新增的恶性肿瘤患者为1400余万，到2018年已经超过了1810万，预计2030年全球恶性肿瘤病例将由2012年的1400万上升到2200万。鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是一种具有显著抗肿瘤活性的化合物。其抗肿瘤作用机制主要有：抑制微管蛋白、拓扑异构酶II、自由基作用、抑制血管增生等。但其水溶性较差、毒副作用较强且易产生耐药性的缺陷严重制约了它的临床应用。虽然许多药学工作者对鬼臼毒素进行了大量的结构改造，相继也发现了诸如依托泊苷、替尼泊苷等药物。然而，它们在临床应用时依然存在水溶性差、易产生多药耐药、严重的胃肠道功能紊乱等缺陷。因此，寻找更高效低毒、选择性更好的鬼臼毒素类衍生物显得尤为重要。

成纤维细胞激活蛋白α(Fibroblast Activation Protein，FAPα)是由肿瘤基质成纤维细胞表达的一种膜结合蛋白，它在超过90％的上皮癌(包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等)的基质活化成纤维细胞中表达，在正常组织仅短暂表达于愈合伤口中。因此，FAPα作为一种极具潜力的抗肿瘤靶标分子正受到越来越多的关注。多项研究表明，FAPα酶特异性底物(N-苄氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸，Z-Gly-Pro-OH)能激活FAPα酶，并特异性水解Gly-Pro序列后的脯氨酸和其他小分子形成的肽键，从而导致肿瘤细胞的行为发生改变，在肿瘤-宿主界面基质的降解以及重建中发挥着重要作用。由此可见，选择FAPα高表达的肿瘤基质作为肿瘤治疗靶标，比传统的细胞毒药物更有优势。

大量鬼臼毒素结构修饰研究表明，用非糖结构取替依托泊苷的C-4位糖基能够显著地克服依托泊苷所导致的抗药性。借助计算机辅助药物设计技术，筛选鬼臼毒素4-OH与FAPα酶特异性底物(N-苄氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸，Z-Gly-Pro-OH)之间的连接臂，发现采用氨基酸作为连接臂时，形成的虚拟分子与FAPα具有更多的结合位点。为进一步研究氨基酸作为连接臂在FAPα酶激活式鬼臼毒素抗肿瘤前体药物研发中的价值，采用不同的氨基酸将鬼臼毒素与FAPα酶的特异性底物(Z-Gly-Pro-OH)进行拼接，得到一系列的FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物，通过测试发现它们具有良好的抗肿瘤活性，可以被进一步开发研究，同时也可以为生物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是：提供一种FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物及其制备方法与应用，它是一类重要的药物分子类似物和医药中间体类似物，同时为生物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值，其合成方法非常经济简便，且收率较高。

本发明还发现该类化合物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。

本发明是这样实现的：FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物，该类化合物具有如通式(Ⅰ)所示的结构：

式中，R为色氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、生物素、乙二胺、硫脲、乙二醇、2,2'-二氯二乙醚、1,2-二(2-氯乙氧基)乙烷、氯乙酰氯、1,4-二(2-氯乙基)哌嗪、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丁二酰基、戊二酰基或丁烯二酰基；R

FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物及其制备方法：

将鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、各种N-Cbz-氨基酸或烷烃链按摩尔比为1:1.0～1:5.0的比例溶解在有机溶剂之中，在催化剂和缚酸剂作用下，反应生成中间体I，然后在催化剂条件下脱掉Cbz保护基得到中间体II，最后在催化剂和缚酸剂条件下得到FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物。

合成路线举例如下：

式中，R为氨基酸；R

所述的有机小分子碱性催化剂为4-二甲氨基吡啶或其它有机生物碱等，有机小分子碱性催化剂举例如下(但需强调的是本发明的有机小分子碱性催化剂不限于如下表示的内容)：

缚酸剂为三乙胺或其它有机生物碱等，缚酸剂举例如下(但需强调的是本发明的缚酸剂不限于如下表示的内容)：

缩合剂为N,N'-二环己基碳二亚胺或其它有机生物碱等，缩合剂举例如下(但需强调的是本发明的缩合剂不限于如下表示的内容)：

所述的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、甲苯、N,N'-二甲基甲酰胺、三氟乙酸、四氢呋喃等。

所述的反应温度为-20℃～80℃，反应时间为1.0～24.0小时。

FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物在治疗/预防恶性肿瘤相关疾病药物的应用。

通过采用上述技术方案，鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、各种N-Cbz-氨基酸或烷烃链按摩尔比为1:1.0～1:5.0的比例溶解在有机溶剂之中，在催化剂和缚酸剂作用下，反应生成中间体I，然后在催化剂条件下脱掉Cbz保护基得到中间体II，最后在催化剂和缚酸剂条件下得到FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物。该类化合物同时包含鬼臼毒素和FAPα酶的特异性底物(N-苄氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸，Z-Gly-Pro-OH)结构，具有潜在的生物活性，同时为生物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值，且通过体外抗肿瘤活性筛选发现，该类化合物对人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7具有很好的抑制作用，且优于阳性对照药依托泊苷，部分FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物对上述细胞的抑制作用可达依托泊苷的100倍以上。很有可能进一步开发成为新的防治肿瘤的药物。本发明操作方法非常经济简便，产物收率较高，溶解性较好，原料便宜易得，可进一步研究发掘其抗肿瘤活性。

附图说明

附图1实施实例化合物IIb核磁谱图数据。

附图2实施实例化合物IV核磁谱图数据。

附图3实施实例IIIa与FAPα蛋白的三维模拟结合图。

附图4实施实例IIIa与FAPα酶的分子对接图示。

附图5FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物的设计图示。

具体实施方式

本发明的实施例：在50mL的反应管中，依次加入鬼臼毒素(0.207g,0.5mmol)、N-Cbz-氨基酸(0.75mmol,1.5eq.)、DMAP(0.183g,1.50mmol,3.0eq)、无水二氯甲烷(10mL)，搅拌使其溶解，0℃冷却搅拌30min后，再加入DCC(0.155g,0.75mmol,1.5eq)，自然升温到室温反应，薄层色谱(TLC)监测，约2～3小时反应完全，加入乙酸乙酯(50mL×2)萃取，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，减压浓缩溶剂，得无色油状物(化合物I)，产物不经纯化直接用于下一部反应。

取上一步浓缩至干的油状化合物Ia(0.20g,0.287mmol)于100mL的茄形瓶，依次加入无水二氯甲烷(10mL)、PdCl

在50mL的反应管中，依次加入中间体IIa(0.207g,0.5mmol)、Z-Gly-Pro-OH(0.75mmol,1.5eq.)、DMAP(0.183g,1.50mmol,3.0eq)、无水二氯甲烷(10mL)，搅拌使其溶解，0℃冷却搅拌30min后，再加入DCC(0.155g,0.75mmol,1.5eq)，自然升温到室温反应，薄层色谱(TLC)监测，约3～4小时反应完全，加入乙酸乙酯(50mL×2)萃取，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，减压浓缩溶剂，得粗产品，采用硅胶柱分离纯化(洗脱剂：乙酸乙酯:石油醚＝2:1)，即得化合物IIIa。白色固体，三步总收率39.3％；核磁共振和高分辨质谱测试结果如下：

化合物IIIb至IIIh的制备方法同化合物IIIa，投料比与化合物IIIa相同，可得到化合物IIIb至IIIh，详见表1，但需强调的是本发明的化合物不限于表1所表示的内容。

表1为一种FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物的化学结构

化合物IIIb：白色固体，总收率46.5％；

化合物IIIc：白色固体，总收率51.7％；

化合物IIId：白色固体，总收率40.5％；

化合物IIIe：白色固体，总收率31.9％；

化合物IIIf：白色固体，总收率39.8％；

化合物IIIg：白色固体，总收率43.1％；

化合物IIIh：白色固体，总收率47.7％；

化合物IV：白色固体，总收率36.8％；

本发明的式(I)化合物具有重要的生物活性，通过MTT法体外对人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性试验表明：此类式(I)所示的结构的FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物对肿瘤细胞生长具有很好的抑制作用，且优于阳性对照药依托泊苷，很有可能进一步开发成为新的防治肿瘤的药物。但需强调的是本发明的化合物不限于人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7表示的细胞毒性。

药理实施例：化合物IIIa～IIIh、IV对人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7的体外抗肿瘤活性测试，采用MTT法，以HepG2为例。

将HepG2细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液溶解；溶解后把细胞转移到含有5mL培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rpm离心5min，弃上清；用含10％胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃、5％CO

化合物IIIa对HepG2、THP-1、Hela、MCF-7肿瘤细胞的IC

表2化合物IIIa～IIIh、IV对四种肿瘤细胞的抑制作用

采用分子对接模拟分析化合物IIIa与FAPα酶的结合作用(详见附图3)，发现化合物IIIa与FAPα酶的Tyr458(A)、Ala459(A)、Arg402(A)、Thr297(A)、Leu296(A)、Trp298(A)残基能形成氢键，其氢键长度分别为

研究结论：人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7是测试化合物体外对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明此类式(I)所示的FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物对人肝癌细胞HepG2、人髓系白血病单核细胞THP-1、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7具有较强的细胞毒性，部分药物明显优于临床肿瘤用药依托泊苷，部分FAPα酶激活式鬼臼毒素衍生物对上述细胞的抑制作用可达依托泊苷的100倍以上。经过后期抗肿瘤机制等一系列实验研究，该类化合物有可能进一步被开发称为临床使用的抗肿瘤药物。由此可见以上化合物具有开发成为抗肿瘤药物的潜力，且具有一定的经济和临床价值，值得我们继续深入研究下去。