睾丸特异性表达蛋白ARAP1在乳腺癌诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种乳腺癌细胞生长、侵袭和转移能力的标志物及其应用。

背景技术

雄激素受体（AR）在ER阳性乳腺癌中约有60%病例中表达，近年来，越来越多的研究表明AR的转录辅调节因子对AR下游基因表达的调控在抑制乳腺癌的增殖和内分泌耐药过程中十分关键。因此，鉴定和解析AR辅调节因子在AR介导基因转录中的表观遗传学机制越来越受到关注，对于进一步研究肿瘤治疗中潜能药物靶点也具有重要的科学意义。

女性乳腺癌是发生于女性乳腺上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率在2020年统计已超过肺癌位居第一，其致死率位居第二位。临床病人中按照分子分型，雌激素受体（ER）阳性乳腺癌占总体乳腺癌病例的75%。得益于ER表达为阳性，这类患者通常采用靶向ER-E2信号通路的新辅助内分泌治疗来缓解癌症的进展。临床研究发现，有近三分之一的病人呈现固有的内分泌治疗抵抗，有一半的病人在经历长期内分泌治疗后发生远处转移并恶性增殖。针对ER阳性乳腺癌的治疗终末期一般都存在着不可逆性的内分泌药物抵抗。

由于乳腺癌的高度异质性，不同病人和同一病人的不同时期的的治疗方案都存在着巨大差异，早期发现和分型乳腺癌十分重要。但是目前关于早期ER阳性乳腺癌的诊断相关分子标志物很少，导致对于判断ER阳性乳腺癌的疾病进展和预后很难从而耽误病情拖延。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的可以与雄激素受体AR相互作用的蛋白ARAP1，研究发现该蛋白在正常组织中只有睾丸组织表达。对其作用机制进行研究发现ARAP1可以显著下调AR的转录活性，且ARAP1沉默可以显著上调AR下游的抑癌基因。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用。

进一步地，所述ARAP1基因或其编码蛋白在乳腺癌细胞中呈现高表达。

进一步地，所述应用通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平；所述样本为组织、血清或细胞。

进一步地，所述应用中含有扩增ARAP1基因的特异性引物、与ARAP1基因核苷酸序列杂交的探针或与ARAP1蛋白特异性结合的抗体。

更近一步地，扩增ARAP1基因的特异性引物序列如下：

ARAP1-F：5’-AGAGTCCCAGGCAGGACAA-3’；

ARAP1-R：5’-GCAGAAGGCTGAGGAACACT-3’；

所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据上述任一所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌指ER阳性乳腺癌。

本发明还提供一种ARAP1基因的表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

进一步地，所述ARAP1基因抑制剂的靶向序列为：5’-TGGATTTGTACCATTCTTCT-3’。

进一步地，所述抑制剂包括含有上述所述靶序列的siRNA或shRNA。

进一步地，所述药物包含药学上可以接受的载体和/或赋型剂。

与现有技术相比本发明的有益效果。

雄激素受体（AR）在ER阳性乳腺癌中约有60%病例中表达，在ER阳性乳腺癌中AR可以改变ER在染色质上的定位从而直接影响ER下游促癌基因转录活性，进而发挥抑癌作用。雄激素作为已知的AR的配体也曾应用于临床ER阳性乳腺癌的治疗，提示我们雄激素和雄激素受体在ER阳性乳腺癌中其抑制癌症的作用。

与现有技术相比，本发明运用网络数据、蛋白免疫印迹实验、蛋白免疫共沉淀实验、GST-Pulldown实验、免疫荧光共定位实验、荧光素酶双基因报告实验、实时定量PCR实验、细胞生长曲线实验和细胞transwell实验等现代分子生物学技术。成功构建了靶向ARAP1基因干扰siRNA，在细胞水平检测了干扰ARAP1基因后对乳腺癌细胞生长和侵袭转移能力的影响，本发明提供的试剂盒，可用于检测乳腺癌生长增殖和侵袭转移能力，具有很好的实用性。

本发明首次发现了AR相互作用蛋白ARAP1与乳腺癌细胞增殖和侵袭转移有关，其表达量一定程度上反应乳腺癌的发生发展程度，为乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。

附图说明

图1ARAP1特异性表达研究。

图2 ARAP1与雄激素受体AR相互作用。

图3ARAP1下调AR介导的基因转录。

图4ARAP1的沉默可以促进癌细胞增殖。

图5 ARAP1的沉默可以显著促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种用于检测乳腺癌细胞生长和侵袭转移能力的分子标志物及其应用，具体如下各实施例所示。本发明中涉及的乳腺癌癌细胞系：MCF7，购于上海中科院细胞库。ARAP1抗体购自Cellsignaltechnology公司。实时定量PCR方法参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，测浓度后，按TaKaRa公司Prime ScriptRT Master Mix试剂盒进行反转录，按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因表达(ACTB为内参)。靶向ARAP1的siRNA及shRNA合成由吉凯公司购买。转染方法按Invitrogen公司LipofectamineRNAiMAX Reagent转染试剂说明书进行，q-PCR及Western blot方法检测表达及干扰效果。细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Cosar公司，事先进行饥饿培养。细胞划痕实验所使用12孔板购自Cosar公司。

实施例1细胞复苏、培养、转染及蛋白免疫共沉淀实验(co-IP)检测MCF7细胞株中ARAP1蛋白与雄激素受体AR蛋白的相互作用。

细胞复苏：从液氮取出MCF7细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在最短时间内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至事先准备好的5mLEP管(已事先加入0.9ml DMEM+10％FBS)中，800rpm离心5min。弃去上清，用1mL DMEM完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬，混匀，取5mL DMEM完全培养基加入培养瓶中，将重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液（0.25％胰酶+0.02％EDTA）1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mLDMEM完全培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟900rpm，离心5min，弃去上清，用1mLDMEM完全培养基重悬，混匀，取5mLDMEM完全培养基加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO

细胞转染：12孔板细胞密度约30％-50％时，将带有FLAG标签的ARAP1质粒作为实验组，取3个EP管，标记A、B、C，在A中加入5μg FLAG-ARAP1，在B、C中加入5μg FLAG-ARAP1+2μg AR，轻柔混匀，室温静置15分钟；将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的100mm培养皿的培养基中，放于37℃，5％CO

蛋白免疫共沉淀实验：将上述细胞用冰PBS清洗2遍后，用细胞刮收集至1.5mL离心管中，以每分钟900rpm，离心5min，弃去上清。使用500μL细胞裂解液（495mL TNE+5μL 100*蛋白酶抑制剂）冰上裂解细胞30min，然后使用超声裂解细胞，每管3次，每次5秒。以每分钟12000rpm，离心20min后将上清移入新的硅化离心管中。每管分出10%作为input，剩下450μL细胞裂解液预先进行pre-clear：加入40μL protein beads磁珠，4°旋转1小时。离心后弃beads，将上清移入新的硅化离心管中。每管加入80μLbeads，再加入FLAG抗体5μL，4°旋转过夜。第二天以每分钟1500rpm，离心5min后弃上清，用TNE洗beads3次，每次10分钟。最后使用2* LoadingBuffer 60μL重悬beads备用。

Western Blot：(1)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量大小配制8％的聚丙烯酰胺凝胶。将用于配胶的1.5mm玻璃板洗干净并晾干后对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，按说明书准备配胶试剂，先加分离胶，先快后慢，避免产生气泡，加至距上端1.5cm处时加无水乙醇密封，静置20分钟后弃去无水乙醇，用离子水清洗3次后加浓缩胶至顶端，插入梳子，注意不能有气泡产生，静置10分钟左右，可进行上样。(2)上样电泳：将制备好的样本按照一定顺序，每孔加20ul，每一组实验样本周边以预染的蛋白质Marker隔开，起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶以后，电压改为120v，约1.5h，当小分子蛋白拉开距离以后，停止电泳。(3)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醛中激活1min左右，再把PVDF膜覆盖于电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，至于电转槽中，恒流300mA，90min。(4)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配的封闭液(含5％的脱脂牛奶的1×PBST)中，摇床上室温2h。(5)封一抗：封闭结束后，配制含5％的脱脂牛奶的1×PBST稀释的一抗(抗FLAG抗体稀释2000倍，抗AR抗体稀释1000倍，各稀释2mL放离心管中)，在相应蛋白所在位置剪开，在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应一抗，摇床上4℃过夜或室温2h。(6)洗膜，孵二抗，洗二抗：取出PVDF膜，1×PBST摇床上洗3次，每次15min，将洗好的膜分别放在封抗体盒子中，配制含5％的脱脂牛奶的1×PBST稀释的二抗(二抗稀释5000倍，稀释2mL放离心管中)在封抗体盒子中分别加2mL稀释后的相应二抗，摇床上室温1h，摇床上用1×PBST洗3次，每次10min。(7)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液A、B液等比例混合(使用前配制)，将洗好的膜用吸水纸吸干多余的1×PBST，将膜的正面向上放置在发光板上，均匀的滴加显影液，凝胶成像系统拍照、保存。

结果如图2-A所示，MCF7细胞中ARAP1可以与AR相互作用。

实施例2实时定量PCR检测细胞株中ARAP1的mRNA干扰效果及对AR下游靶基因的影响。

细胞传代培养：将细胞密度约80％-90％的培养瓶中的旧培养液弃去，用预热的PBS冲洗1-2次，再向培养瓶内加入胰蛋白酶消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA)1mL，37℃消化2-3min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入1mL DMEM完全培养基终止消化，用移液枪轻柔反复吹打瓶底。将吹打好的细胞悬液收集至5mL离心管内以每分钟800rpm，离心5min，弃去上清，用1mL DMEM完全培养基重悬，混匀，取5mL DMEM完全培养基加入新的培养瓶中，将适量重悬细胞悬液转移至培养瓶，放于37℃，5％CO

细胞感染：6孔板细胞密度约30％-50％时，将shARAP1病毒作为实验组，shCtrl病毒作为对照组，按照吉凯基因病毒感染手册进行标准化操作感染细胞。24小时后换液，并使用终浓度为50nM嘌呤霉素进行筛选，待细胞生长至80%-90%密度后，按上诉方法将F3细胞接种到35mm培养皿中。细胞长满后即可进行下一步操作。

总RNA的提取：收集细胞后，参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，在该操作过程中需遵循无RNA酶操作，佩戴无菌手套和口罩。具体步骤如下：(1)需要用RL裂解液(已加入β-巯基乙醇)裂解细胞，并提前配置好70％乙醇，分开标记RL裂解液及70％乙醇以免混淆；(2)每个孔需要加入350μL配制好的RL细胞裂解液，用枪头的底部按照顺时针及逆时针方向轻轻划动，以充分裂解细胞，随即把裂解的溶液沿着侧壁缓慢滴到CS过滤柱上，并标记清楚，放入离心机中快速离心并收取滤液(2min，4℃，12000rpm)；(3)在滤液中缓慢加入70％乙醇，每孔约350μL，轻柔的混匀，混匀后的溶液转移到CR3吸附柱里，并放在对应的收集管中，再次离心(90s，4℃，12000rpm)并弃掉滤液，吸附柱重新放入收集管中；(4)沿着侧壁每个吸附柱中加入去蛋白液RW1 350μL，调整离心机转速12000rpm，温度为4℃，离心60s，弃掉滤液，吸附柱放到收集管中；(5)每个柱子中间悬空滴下DNaseⅠ工作液80μL，注意不要滴到侧壁，室温下静置15min；(6)每个柱子沿着侧壁缓慢加入去蛋白液RW1 350μL，4℃高速离心机，12000rpm离心60s，弃滤液，吸附柱重新放回收集管；(7)加入RW漂洗液500μL，静置置2min，离心并丢弃滤液(90s，4℃，12000rpm)，吸附柱放回到收集管中，重复该步骤1次，4℃高速离心机，12000rpm，离心2min，吸去滤液，打开吸附柱的盖子，静置大约4min，以便彻底清除吸附柱上的乙醇残留；(8)把晾干的吸附柱放到标好的RNase-Free 1.5mLEP管中，于每个柱子中心滴加30μL去离子水，室温放置2min后离心以便收取滤液(2min，4℃，12000rpm)，重复该步骤1次，以更多的获得RNA溶液。

紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/u)和纯度，用DEPC水调零，OD260/OD280在1 .8-2 .0之间，表明提取的RNA纯度好。

逆转录为cDNA (reverse transcript as ，rt) ：反应体系为:按TaKaRa公司PrimeScript RT Master Mix试剂盒进行反转录：5*PrimeScript RT Master MIX：2μL，所提总RNA：1μg；加ddH

实时定量PCR方法按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因的表达(ACTB为内参，ACTB-F：5’-CTCGCCTTTGCCGATCC-3’，见SEQ ID NO.1;ACTB-R：5’-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3’，见SEQ ID NO.2;UGT2B17-F：5’-CCCTGGATCGAGCAGTCTTC-3’，见SEQ ID NO.3;UGT2B17-R：5’-GCTCAGTAACTTTTGTGTGGGG-3’，见SEQ ID NO.4;NKX3.1-F：5’-TGAGCAAGCAAGGGACTGAG-3’，见SEQ ID NO.5;NKX3.1-R：5’-TCTCCCCTCTACCAGCTCAC-3’，见SEQ ID NO.6;SLC45A3-F：5’-CCCAGGCTCAGGGTTAACAG-3’，见SEQ ID NO.7;SLC45A3-R：5’-GTGGTTAGGGAAGCCGTTGA-3’,见SEQ ID NO.8)的反应体系为：17μL SYBR，14μL去RNA酶水，1μL Forward primer，1μL Reverse primer，1μLcDNA。反应程序为Holding Stage：50℃2min，95℃10min，Cycling Stage:95℃，15s，50℃，1min，Numberof Cycles:40。计算CT值，结果以柱状图呈现。

结果如图3-B所示，为q-PCR检测细胞株中干扰ARAP1 mRNA表达水平明显降低，所有的AR下游靶基因mRNA水平较对照组明显升高，说明ARAP1抑制AR介导的基因转录。

ARAP1是一种睾丸特异性抗原，只在正常睾丸和癌症中表达：申请人通过检测ARAP1在不同组织和其对应癌症中的mRNA表达发现ARAP1在正常组织中只有睾丸组织表达，提示ARAP1是一种新的睾丸特异性抗原（图1）。

ARAP1是一种与雄激素受体AR相互作用的蛋白质：申请人在乳腺癌细胞中进行了蛋白质免疫共沉淀和GST-Pulldown实验，结果显示ARAP1可以与雄激素受体AR相互作用，且直接作用区域在AR-碳末端。免疫荧光共聚焦实验显示ARAP1大部分处于细胞浆和细胞膜上，少数与AR共定位在细胞核（图2）。

ARAP1下调AR介导的基因转录：通过荧光素酶双基因报告实验显示ARAP1可以显著下调AR的转录活性，对AR介导的基因转录起抑制作用；而qPCR实验显示利用ARAP1沉默病毒可以显著上调AR下游的抑癌基因，提示我们ARAP1的沉默可以通过上调抑癌基因进而抑制癌症（图3）。

按照实施例1中的细胞转染方法转染siRNA敲低ARAP1显著降低乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移：细胞生长曲线显示ARAP1沉默后可以显著减慢乳腺癌细胞的生长，而ARAP1的沉默也可以显著促进乳腺癌细胞的侵袭和转移（图5）。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 睾丸特异性表达蛋白ARAP1在乳腺癌诊断和治疗中的应用

<141> 2021-10-26

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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agagtcccag gcaggacaa 19

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gtggttaggg aagccgttga 20