一种基因重组高活性降钙素原蛋白抗原的制备工艺

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，尤其是一种基因重组高活性降钙素原蛋白抗原的制备工艺。

背景技术

降钙素原（PCT）是激素降钙素（CT）的前体肽。在CT-mRNA翻译后，PCT被酶解成终产物为32个氨基酸的成熟CT。正常人的血清中的PCT含量极低，在被微生物感染后，CALC-I基因被诱导表达，促进PCT的分泌，8小时达到峰值。目前，PCT已被认为是全身性炎症反应综合征的标志物，可以指导治疗，减少抗生素的使用，诊断败血症，改善长期结果。

大肠杆菌作为优良基因工程菌，生长周期短，生产成本低，转化率高并且可以高表达目的蛋白，其表达水平远远高于其他表达系统。实现产品的产业化与成熟的重组产品的纯化工艺是息息相关，因此实现基因工程技术和蛋白工艺的有机结合，无疑会为重组高活性产品实现大规模生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术中的不足，提供一种基因重组高活性降钙素原蛋白（PCT）抗原的制备工艺，可制备工艺可大幅提高重组降钙素原蛋白（PCT）的产量和活性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基因重组高活性降钙素原蛋白抗原的制备工艺，包括以下步骤：

1）对PCT基因片段进行密码子优化；

2）表达质粒和表达菌株的构建：合成步骤1）优化后的基因片段，连接到表达载体上，获得PCT表达质粒，后将表达质粒转入大肠杆菌中构建表达菌株；本步骤中通过常规氯化钙法将重组PCT表达载体导入

3）基因重组PCT的发酵：将含有PCT基因的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养至OD600=3~4时，加入IPTG在25℃下诱导培养，得发酵液；

4）细胞的收集及裂解：将步骤1）的发酵液离心收集菌体，按质量体积比为1:15~20的比例加入裂解缓冲液，利用高压均质机在4℃下将细胞裂解，裂解结束后将匀浆液离心，收集上清液；

5）PCT的纯化：将步骤4）的上清液进行亲和层析纯化，得到融合SUMO标签的PCT，后利用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白，再次亲和纯化回收无标签的PCT蛋白。

进一步的，步骤1）所述的密码子优化采用密码子优化软件MaxCodon

进一步的，步骤（2）中表达质粒构建，具体步骤包括：引物设计与合成，PCR获取PCT基因片段，重组连接获取表达质粒，其中表达质粒为pSUMO。

进一步的，步骤3）中所述的发酵培养基为TB培养基，培养条件为：转速250-300rpm，罐压为0.03-0.05Mpa，初始通气量为1.5m

进一步的，所述TB培养基组分及各组分含量为：50ug/ml的卡那霉素，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油5g/L，K

进一步的，步骤4）中所述的裂解缓冲液为1×PBS，（pH6-8），0.5%-2% Triton X-100，1-2mM DTT，0.1-0.5mMPMSF，30-50 mM Imidazole。

进一步的，步骤4）所述的均质机的均质压力为800-900Mpa，并以菌液不在粘稠为结束标志。

进一步的，步骤5）中亲和层析纯化中使用的层析填料为NI-IDA，孵育时间80-90min，平衡缓冲液为1×PBS， pH6-8，30-50 mM Imidazole，通过改变咪唑浓度洗脱融合蛋白。

进一步的，步骤5）中酶切温度为4-30℃，底物与酶比例为1：400-800（m:m），酶切时间为1-3h。

进一步的，步骤5）中蛋白回收所用的填料为NI-IDA，孵育时间30-60 min，平衡缓冲液为1×PBS， pH6-8，通过收集流穿液得到无标签PCT蛋白。

本发明中所述PCT重组大肠杆菌是将PCT基因通表达载体转入大肠杆菌中获得的重组菌。

例如构建方法可以为：

以PCT的cDNA基因片段为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：95℃，5 min；(95℃ 30 s，60℃60s，72℃ 45s，30个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的PCT基因，将PCT基因和表达质粒分别用StuI和Hind III双酶切、连接转化至BL21(DE3)感受态细胞，使用StuI和Hind III双酶切鉴定重组质粒pSUMO-PCT，得到大小为5900 bp左右的条带，酶切结果表明，重组质粒pSUMO-PCT构建成功，参考《分子克隆》将重组质粒pSUMO-PCT通过氯化钙法导入

采用本发明中的技术方案的有益效果是：

本发明采用的宿主菌大肠杆菌生长周期短，生产成本低，转化率高并且可以高表达目的蛋白，其表达水平远远高于其他表达系统，为重组高活性产品实现大规模生产奠定基础。

利用欧凯生物最新开发的密码子优化软件MaxCodon

在破碎过程选择高压均质破碎，由于其可以低温控制，保持蛋白稳定结构，并且破碎率良好，处理量大。因此整个生产工艺简单、高效快速，生产成本低，对以包涵体形式存在的谷氨酰胺转氨酶生产提供了基础。

本发明解决了传统方法中蛋白表达量低，纯度和活性低的问题，传统的蛋白表达量一般是10-15mg/L，适合规模化生产，得到的PCT纯度好，质量稳定和活性高，可以达到20-25mg/L。

附图说明

图1为PCT蛋白的浓度与T值的反应线性图；

图2为PCT蛋白的浓度与T值的反应线性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明缓冲液中所述的百分比是体积比。

实施例1 本实施例说明PCT重组大肠杆菌的构建

1、设计合成带有

Primer1上游引物：5’-GGTCGTCAACAACTACATAC-3’；

Primer2下游引物：5’-GTTCGCCAGTTCCTTCTT-3’。

2、以PCT的cDNA基因片段为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：95℃，5min；(95℃ 30 s，60℃60s，72℃45s，30个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的PCT基因（参照Takara DNA片段纯化试剂盒说明书）和表达质粒pSUMO分别用StuI和Hind III双酶切、连接转化至BL21(DE3)感受态细胞，通过热击将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中。

3、将步骤2）的表达载体热击导入大肠杆菌后加入300ul LB培养基，于37℃恒温培养4h，后取80μL均匀涂布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培养基上，在37℃下培养12-24小时，即可获得产PCT重组大肠杆菌。

实施例2本实施例说明重组PCT大肠杆菌的发酵调控

将实施例1获得的重组菌株的平板上挑取单克隆接种在含LB培养基中37℃培养16h作为种液，种子液以1%接种量接种于含有7L TB培养液（含50ug/ml的硫酸卡那霉素，蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K

实施例3本实施例说明重组PCT蛋白的纯化

细胞破碎：取发酵后离心收集的菌体10g加入15倍体积（150ml）的1×PBS，pH7.4，20 mM Imidazole ，1% Triton X-100，1mM DTT，0.1 mM PMSF混匀后，缓慢流加到高压均质机中，压力控制在850Mpa，循环两次后将匀浆液在12500rpm，4℃离心15min，弃沉淀保留上清，

NI-IDA平衡：取5mL NI-IDA填料，用10倍柱体积平衡缓冲液1×PBS，pH7.4，30 mMImidazole平衡填料，

孵育：将填料与柱子混合，在4℃条件下孵育80min，

纯化：孵育结束，利用重力管和蠕动泵将填料和未结合杂蛋白分离，然后分别利用buffer1：1×PBS，pH7.4，30 mM Imidazole除杂，buffer2：1×PBS，pH7.4，50 mM Imidazole洗脱，buffer3：1×PBS，pH7.4，500 mM Imidazole洗脱，收集每个洗脱组分利用SDS-PAGE检测，最终得到的融合sumo标签的PCT蛋白。

实施例4本实施例说明无标签PCT蛋白的酶切和回收

融合蛋白的酶切：收集纯化得到的融合蛋白，按1：20（v：v）透析至5L 的1×PBS，pH7.4中4h，然后按照1：400（m:m）向透析结束后的蛋白中加入SUMO蛋白酶，在20℃条件下酶切2h，酶切结束将混合液12500rpm离心15min取上清进行回收。

NI-IDA平衡：取2mL NI-IDA填料，用10倍柱体积平衡缓冲液1×PBS，pH7.4平衡填料；

孵育：将填料与柱子混合，在4℃条件下孵育40min，

纯化：孵育结束，利用重力管和蠕动泵将填料和未结合杂蛋白分离，收集流穿液，利用SDS-PAGE检测，最终得到的无标签PCT蛋白。

实验：PCT蛋白活性评价，采用商业化的PCT含量检测试剂盒，用于检测PCT蛋白活性，将纯化后的PCT蛋白进行20K、40k、80K、160K、320 k、640 k、1280 k、5120 k梯度倍比稀释，然后测定其信号值（T值），并拟合浓度与T值间的二次函数曲线。

实验：PCT蛋白稳定性评价，采用商业化的PCT含量检测试剂盒，用于检测PCT蛋白活性，将纯化后的PCT蛋白4度放置240h，然后进行20K、40k、80K、160K、320 k、640 k、1280k、5120 k梯度倍比稀释，最后测定其信号值（T值），并拟合浓度与T值间的二次函数曲线。

表1 PCT蛋白的活性检测

表2 PCT蛋白的活性检测

实验结果：由表1、表2、图1和图2所示内容可知，测定PCT抗原，反应线性、反应梯度以及反应活性都能满足检测使用。

图1和图2中横坐标为PCT蛋白的浓度，纵坐标为T值。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。