一种用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。

背景技术

艾司西酞普兰近年来作为一线用药在临床上被广泛用于抑郁障碍，特别是重性抑郁的预防和治疗，对于广泛性焦虑障碍、社交恐惧、强迫症及躯体形式障碍也有较好的疗效。艾司西酞普兰在体内主要通过CYP2C19代谢为左旋去甲基西肽普兰(S-DCT)和左旋去二甲基西肽普兰(S-DDCT)，血浆中游离艾司西酞普兰为主要活性成分。CYP2C19突变可导致CYP2C19蛋白酶功能降低或缺失，慢代谢型患者服用艾司西酞普兰时，血药浓度与快代谢型患者相比显着升高，药物在体内蓄积，增加不良反应发生的风险，易引发QT间期延长以及心律不齐等不良反应。因此美国临床药物基因组联盟(CPIC)及荷兰药物基因组学工作组(DPWG)建议，对于慢代谢型型患者起始剂量减少为推荐剂量的50％，对于中间代谢型患者需适当降低给药剂量，并缓慢加量。

西酞普兰是选择性最强的五羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，已被广泛用于各种抑郁症的治疗。其通过抑制突触前膜对5-羟色胺再摄取延长和增加5-羟色胺的作用，从而起到抗抑郁作用。与传统的三环类抗抑郁药物相比，西酞普兰疗效更佳且毒副作用更小，是重症抑郁症患者的一线药物，对焦虑症等精神疾病亦有很好疗效。临床应用发现，西酞普兰药物疗效的个体差异非常大。其主要代谢酶CYP2C19编码基因多态性是导致西酞普兰/依他普仑疗效个体差异的最主要因素。根据CYP2C19不同基因型，可将人群分为快代谢型(EM)、中间代谢型(IM)、慢代谢型(PM)。研究发现，慢代谢型和中间代谢型个体药物代谢能力下降，服用常规剂量药物时血药浓度高于预期，毒副反应风险升高，尤其是慢代谢者，故慢代谢者在使用西酞普兰/依他普仑时须适当减少初始用量。

CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3所致。CYP2C19酶存在基因多态性,能引起个体和种族间现出不同代谢能力，使血药浓度呈现显著个体差异。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。

为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：

本发明的试剂盒针对CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物、阳性对照。

优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：

优选的，所述CYP2C19(681G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQID NO:2所示；所述CYP2C19(636G>A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:4所示。

优选的，所述的CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。

更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定

优选的，CYP2C19(681G>A)测序引物对应的测序区域为CYP2C19(681G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:7所示；CYP2C19(636G>A)测序引物对应的测序区域为CYP2C19(636G>A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:8所示。

优选的，CYP2C19(681G>A)和CYP2C19(636G>A)共用一个分配指令如序列表SEQ IDNO:9所示。

优选的，所述的扩增反应液，包括，CYP2C19(681G>A)和CYP2C19(636G>A)特异性扩增引物，还包括血液样品直接PCR预混液(2×)、海藻糖；

更优选的，反应液各组分浓度分别为CYP2C19(681G>A)前引物(0.2uM)，CYP2C19(681G>A)后引物(0.2uM)，CYP2C19(636G>A)前引物(0.25uM)，CYP2C19(636G>A)后引物(0.25uM)，PCR预混液(1×)，海藻糖(0.2％)；

优选的，所述的PCR预混液为Blood Direct PCR Master Mix(2X)，含有耐血的HemoTaq

优选的，为获得最高的检测灵敏度，20μl的PCR扩增体系中最大加入的血液量可以达到4μl，即20％体积。

优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的CYP2C19*2*3型基因组DNA，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。

优选的，所述的反应体积为20ul，反应条件为：预变性温度设为95℃，预变性时间设为5min，变性温度设为95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为58℃，退火延伸时间设为0s，扩增40个循环。

优选的，扩增所采用的PCR管密封薄膜，在PCR反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，PCR管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。

本发明还公开了一种采用上述试剂盒的西酞普兰、艾司西酞普兰剂量指导相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

a.将所述扩增反应液与4ul待测EDTA抗凝全血混合均匀进行PCR扩增；

b.将含链霉亲和素标记微珠的结合液与扩增产物进行混合；

c.加入洗涤缓冲液漂洗；

d.变性液处理得到单链产物；

e.加入洗涤缓冲液漂洗；

f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；

g.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物、ddCTP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；

h.焦磷酸测序；

i.确定CYP2C19的基因型。

本发明还公开了一种用于西酞普兰、艾司西酞普兰剂量指导试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)进行检测，以从基因层面指导西酞普兰、艾司西酞普兰剂量。

本发明建立一种简单、快速有效、价格低廉的CYP2C19检测基因多态性的方法。本发明的CYP2C19的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用血液直扩的方式，免去核酸提取的步骤，只需将样品与其他PCR必须的组分加入反应管中混匀即可。另一方面通过将PCR仪加热模块设计由加热底座和加热柱两部分组成，加热柱四周与底座相连中间与反应孔对应的，该加热模块在PCR扩增时伸入PCR反应管中，使反应液分散在加热柱和PCR管壁之间，从中间和四周同时变化温度，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为PCR的快速扩增提供了另一关键要素。第三方面采用双重PCR扩增CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)两个位点，同时一次反应进行两个位点的焦磷酸测序。该测序首先加CYP2C19(681G>A)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddNTP终止该测序反应。再加入CYP2C19(636G>A)测序引物和相应的dNTP进行测序。一次处理先后进行两个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。

与现有技术相比，本发明以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对西酞普兰、艾司西酞普兰剂量指导相关的基因多态性进行检测，为西酞普兰、艾司西酞普兰临床个性化用药给出基因角度的建议。

附图说明

图1是本发明提供的PCR反应管的结构示意图；

图2是本发明提供的CYP2C19*1*1型测序结果示例图；

图3是本发明提供的CYP2C19*3*3型测序结果示例图；

图4是本发明提供的CYP2C19*1*2型测序结果示例图；

图5是本发明提供的CYP2C19*1*3型测序结果示例图；

图6是本发明提供的CYP2C19*2*2型测序结果示例图；

图7是本发明提供的CYP2C19*2*3型测序结果示例图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1、试剂盒的制备

本发明的试剂盒针对CYP2C19(681G>A)、CYP2C19(636G>A)设计了特异性扩增引物和测序引物，用于扩增和焦磷酸测序检测。基于快速扩增技术设计引物是本发明的关键之一,基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。

(一)本实施例的引物序列如下：

(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：

(三)本实施例的检测试剂盒PCR反应液单人份配置体系如下：

PCR反应液各组分浓度分别为：CYP2C19(681G>A)前引物(0.2uM)，CYP2C19(681G>A)后引物(0.2uM)，CYP2C19(636G>A)前引物(0.25uM)，CYP2C19(636G>A)后引物(0.25uM)，PCR预混液(1×)，海藻糖(0.2％)；其中Easy-LoadTMBlood Direct PCR Master Mix(2X)购自上海钰博生物科技有限公司。

配置完成后200ul/管进行分装。

实施例2、焦磷酸检测

本发明中采用的仪器如下：扩增仪、焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。

(1)试剂准备(试剂准备室)

提前将试剂取出，并将PCR反应液涡旋振荡15秒，低速离心待用。。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按16μL/管分装至PCR反应管中。

(2)加样检测(样本制备间)

将EDTA抗凝全血、阳性对照和空白对照按4μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。

(3)PCR扩增(扩增间)

采用PCR仪进行扩增，反应体系为20μL，扩增条件：

(4)焦磷酸测序

1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物10μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；扩增所采用的PCR管密封薄膜，在PCR反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，PCR管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。PCR反应管的结构示意图如图1所示；

2)7,000×g离心1min，弃上清；

3)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管收集得到单链产物。

4)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min。

5)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶和3uL测序底物。

6)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、CYP2C19(681G>A)测序引物、CYP2C19(636G>A)测序引物、ddCTP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；

7)焦磷酸测序；测序结果如图2～7所示。

(5)结果判读

1)有效性判定：

本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为CYP2C19*2*3型。

2)结果判定标准

a.CYP2C19(681G>A)的DNA测序峰值图中，

G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为681GG型；

40％≦G的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为681GA型；

A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为681AA型；

b.CYP2C19(636G>A)的DNA测序峰值图中，

G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为636GG型；

40％≦G的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为636GA型；

A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为636AA型

(6)用药指导

不同代谢能力人群药物使用剂量方案如下：

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 菲思特（上海）生物科技有限公司

<120> 一种用于西酞普兰和艾司西酞普兰代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> unsure

<222> (1)..(23)

<400> 1

accagagctt ggcatattgt atc 23

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> unsure

<222> (1)..(23)

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caaatacgca agcagtcaca taa 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

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ctccctgcaa tgtgatctgc t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<221> unsure

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gtaatttgtt atgggttcc 19

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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bgggaaataa tcaatga 17

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgratccag gtaaggc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<400> 9

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