一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法。

背景技术

世界卫生组织和联合国粮农组织(WHO/FAO)将树坚果归类为保健食品，在过去几年时间里腰果和其他树坚果的消费量一直在增加，和花生过敏相似，树坚果过敏是常见的，且临床过敏表现较为严重，难以解决。坚果和花生是导致严重过敏以及并发症的主要原因，并占食物致死性案例的绝大部分，腰果也会通过交叉反应对相当一部分的过敏人群构成健康风险，流行病学研究发现，欧美等发达国家腰果过敏的发病率占坚果类过敏的15-30％。

Ana o 3是腰果临床过敏的主要致敏原，其分子量为12.6kDa。高纯度的过敏原蛋白Ana o 3在食品过敏原定性定量检测、腰果致敏反应机制及低致敏食物的开发中是不可或缺的；目前，高纯度Ana o3的制备尚未有成型的方法，而国内外对过敏原的检测方法都需要致敏蛋白的 标准品作为内标或外标定量，或者作为阳性对照，因此高纯度的Ana o 3的制备是迫切的。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明提供了一种从生腰果中制备高纯度致敏原Anao 3的方法，本发明采用低浓度盐溶液提取与阴离子交换层析相结合的方法提取高纯度的腰果过敏原Ana o 3，为腰果过敏研究及过敏原Ana o 3特性研究提供样品。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、脱脂腰果粉的制备：将生腰果于液氮内粉碎至糊状后进行脱脂、干燥，得脱脂腰果粉；

步骤(2)、腰果粗蛋白的制备：将步骤(1)的脱脂腰果粉于提取液中进行蛋白提取，然后依次经离心、取上清液透析、冷冻干燥，得到粗蛋白冻干粉；

其中，所述提取液采用浓度为10-50mmol/L、pH为7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；

步骤(3)、过敏原Ana o 3提纯：将步骤(2)的粗蛋白冻干粉经弱阴离子交换层析，得到高纯度过敏原Ana o3 。

优选的，所述步骤(1)中脱脂、干燥的方法为：将糊状的生腰果加入至沸程为30-60℃的石油醚中脱脂2-6h，然后于4-25℃下离心去除油脂，重复上述脱脂离心操作后，将石油醚于自然条件下风干；

其中，果粉的质量与石油醚的体积比为1g：5-10mL。

优选的，所述步骤(2)中脱脂腰果粉的质量与磷酸盐缓冲液的体积之比为1g：10-20mL。

优选的，所述步骤(2)中蛋白提取的方法为：将步骤(1)的脱脂腰果粉与磷酸盐缓冲液混合均匀，并于4℃条件下磁力搅拌6-12h。

优选的，所述步骤(2)中离心的条件为：于6000-11000r/min、4℃条件下离心10-30min。

优选的，所述步骤(2)中透析的方法为：采用6-8KD的透析袋，于4℃下，于蒸馏水中磁力搅拌透析10-24h。

优选的，所述步骤(3)中弱阴离子交换层析的条件为：于pH为6.8的条件下，采用浓度为0.1-0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱液流速为2mL/min。

优选的，所述步骤(3)中弱阴离子交换层析采用弱阴离子柱材，其于pH为1-14条件下均结构和活性稳定。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、Ana o 3过敏原是一种低盐溶解的蛋白，因此可通过低盐浸提的方式，在减少其他蛋白浸出的同时加大Ana o 3的溶解，本发明采用低浓度的磷酸盐缓冲液浸提蛋白，可在充分提取Ana o 3的前提下，减少其它蛋白的溶解，继而实现了Ana o 3的有效分离。

2、本发明通过Ana o 3过敏原的氨基酸序列可预测其理论等电点，从而设计后续的弱阴离子交换层析，继而采用低浓度盐溶液提取与弱阴离子交换层析相结合的方法，从生腰果中提取出纯度可达95％以上过敏原Ana o 3。

3、本发明的提纯条件都在低温下进行，并采用冷冻干燥技术，有效的保护了过敏原Ana o 3的结构和功能活性。

附图说明

图1为本发明实施例2采用低浓度磷酸盐浸提腰果粗蛋白的电泳图；

图2为本发明实施例2采用弱阴离子交换层析纯化后的Ana o 3的电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实验方法和检测方法，如没有特殊说明，均为常规方法；下述试剂和原料，如没有特殊说明，均为市售。

实施例1

一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、脱脂腰果粉的制备：液氮磨粉+石油醚脱脂；

取生腰果于粉碎机中，加入液氮后粉碎至糊状，然后向其中加入石油醚进行脱脂，搅拌脱脂时长2h，然后于10℃、8000r/min条件下离心去除油脂，重复两次脱脂后于通风橱中风干石油醚，即得脱脂腰果粉；

其中，生腰果粉的质量与石油醚的体积比为1g：5mL；

步骤(2)、腰果粗蛋白的制备：PBS盐提+透析+冷冻干燥；

将脱脂腰果粉加入至30mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行蛋白提取，4℃条件下磁力搅拌8h，提取完后用冷冻离心机在10000r/min、4℃条件下离心20min，取上清液于离心管中，并重复上述操作，合并两次上清液后，将上清液用蒸馏水透析(透析袋截留范围为6-8KD)，然后于4℃条件下磁力搅拌16h，期间换液5次，透析完后经冷冻干燥得到粗蛋白冻干粉；

其中，脱脂腰果粉的质量与磷酸盐缓冲液的体积之比为1g:15mL；

步骤(3)、过敏原Ana o 3提纯：

将粗蛋白冻干粉经弱阴离子交换层析，阴离子交换层析在pH为6.8的条件下进行，氯化钠洗脱浓度为0.1mol/L，洗脱液流速为2mL/min，得到高纯度过敏原Ana o 3，而后经冷冻干燥获得Ana o 3冻干粉。

实施例2

一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、脱脂腰果粉的制备：液氮磨粉+石油醚脱脂；

取生腰果于粉碎机中，加入液氮后粉碎至糊状，然后向其中加入石油醚进行脱脂，搅拌脱脂时长3h，然后于4℃、8000r/min条件下离心去除油脂，重复两次脱脂后于通风橱中风干石油醚，即得脱脂腰果粉；

其中，生腰果粉的质量与石油醚的体积比为1g：10mL；

步骤(2)、腰果粗蛋白的制备：PBS盐提+透析+冷冻干燥；

将脱脂腰果粉加入至10mmol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行蛋白提取，4℃条件下磁力搅拌12h，提取完后用冷冻离心机在11000r/min、4℃条件下离心15min，取上清液于离心管中，并重复上述操作，合并两次上清液后，将上清液用蒸馏水透析(透析袋截留范围为6-8KD)，然后于4℃条件下磁力搅拌10h，期间换液5次，透析完后经冷冻干燥得到粗蛋白冻干粉；

其中，脱脂腰果粉的质量与磷酸盐缓冲液的体积之比为1g:10mL；

步骤(3)、过敏原Ana o 3提纯：

将粗蛋白冻干粉经弱阴离子交换层析，阴离子交换层析在pH为6.8的条件下进行，氯化钠洗脱浓度为0.3mol/L，洗脱液流速为2mL/min，得到高纯度过敏原Ana o 3，而后经冷冻干燥获得Ana o 3冻干粉。

实施例3

一种从生腰果中制备高纯度致敏原Ana o 3的方法，包括以下步骤：

步骤(1)、脱脂腰果粉的制备：液氮磨粉+石油醚脱脂；

取生腰果于粉碎机中，加入液氮后粉碎至糊状，然后向其中加入石油醚进行脱脂，搅拌脱脂时长6h，然后于25℃、8000r/min条件下离心去除油脂，重复两次脱脂后于通风橱中风干石油醚，即得脱脂腰果粉；

其中，生腰果粉的质量与石油醚的体积比为1g：8mL；

步骤(2)、腰果粗蛋白的制备：PBS盐提+透析+冷冻干燥；

将脱脂腰果粉加入至50mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行蛋白提取，4℃条件下磁力搅拌6h，提取完后用冷冻离心机在6000r/min、4℃条件下离心30min，取上清液于离心管中，并重复上述操作，合并两次上清液后，将上清液用蒸馏水透析(透析袋截留范围为6-8KD)，然后于4℃条件下磁力搅拌24h，期间换液5次，透析完后经冷冻干燥得到粗蛋白冻干粉；

其中，脱脂腰果粉的质量与磷酸盐缓冲液的体积之比为1g:20mL；

步骤(3)、过敏原Ana o 3提纯：

将粗蛋白冻干粉经弱阴离子交换层析，阴离子交换层析在pH为6.8的条件下进行，氯化钠洗脱浓度为0.5mol/L，洗脱液流速为2mL/min，得到高纯度过敏原Ana o 3，而后经冷冻干燥获得Ana o 3冻干粉。

本发明实施例1-实施例3均提取得到Ana o 3冻干粉，下面以实施例2的提取方法及提取得到的Ana o 3冻干粉为例进行研究，研究的方法及结果如下所示：

电泳方法：采用Tricine-SDS-PAGE电泳进行腰果过敏原分析，上样量为10μL，先恒压30V条件下，电泳60min；后恒压100V条件下，电泳120min；电泳结束后，依次经蒸馏水洗5min，固定液固定15min，考马斯亮蓝染色15min，采用脱色液脱色后过夜，次日取胶块进行成像分析，经GS-800型光密度扫描仪分析蛋白纯度。

图1中标号的1-3的样品均为实施例2采用低浓度磷酸盐浸提得到的腰果粗蛋白的电泳图，通过图1发现，电泳图中分子量12.6KDa处有一明显的粗条带，可得知粗提蛋白中Ana o 3的含量较高，而其他蛋白质的含量较少，说明低盐浸提Ana o 3的方法效果较好。

图2中标号的1-9的样品均为实施例2采用阴离子层析纯化后得到的腰果过敏原Ana o 3的电泳图，图2右侧的lane number中的编号1-9分别与左侧的电泳图对应；maker与样品1之间的泳道所对应的样品为初期分离得到的少量腰果过敏原Ana o 3，随着盐浓度的提高，腰果过敏原Ana o 3被得到大量分离，此时记为样品1；通过图2发现，采用弱阴离子交换层析的条件纯化出的腰果过敏原Ana o 3的纯度很高，经Quantity One软件对比条带灰度值，发现该条带的纯度都能保持在95％以上。

生腰果中蛋白质含量约为19-21％，Ana o 3占腰果蛋白的5％；由于粗蛋白浸提时采用低盐提取，粗蛋白的各组分的比重发生改变，故以1g生腰果所含Ana o 3为基准来计算Ana o 3的得率，阴离子法分离得到的腰果过敏原Ana o 3的蛋白含量及得率如表1所示；结果表明，该阴离子交换法分离所得的Ana o 3的得率为25.36％。

表1阴离子法分离得到的腰果过敏原Ana o 3的得率

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。