有效提高植物果实生物量的方法

技术领域

本发明涉及一种有效提高植物果实生物量的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

角果是由两枚合生心皮组成的雌蕊发育而成的果实，为十字花科植物所特有，其形态上可分为长角果和短角果。长角果，细长圆柱形，短角果，果长宽度差不多，多呈扁平、椭圆状。十字花科植物的角果都具有较大的应用价值。油菜为长角果，其成熟种子含油可达35～45％，是食用植物油的重要来源之一，还可用于制造润滑剂、清漆、尼龙、塑料、驱虫剂、稳定剂和药品等。荠为短角果，其成熟种子含油20～30％，榨油可制皂或作油漆。菥冥具有两合生心皮形成的角果，形状奇特，种子含油量28～34％，榨油可制皂或作滑润油。白芥的角果既可被人类当作中药食用，还可用来榨油或者调味料。目前，对于十字科植物的研究更加关注角果数、千粒重等生物量性状，对产量的贡献较大，且均受遗传控制。同为十字花科的双子叶模式植物拟南芥，其角果线形，长约10～14mm，宽不到1mm，每个果荚可着生50～60粒种子，是研究角果生物量遗传调控的理想材料，对作物育种具有重要的借鉴意义。

发明专利《增强植物抗病性的基因及其功能》(申请号：CN202110236767.4)公布了AT5G02580基因的序列、敲除AT5G02580基因后能增强拟南芥植株抗病性的功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供AT5G02580基因的新用途----调控角果生物量，即，提供一种有效提高植物果实生物量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供基因AT5G02580在有效提高植物果实生物量中的应用：基因AT5G02580的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明应用的改进：负调控拟南芥的角果数目与种子重量；过表达该基因会降低拟南芥的角果数目与种子重量；基因缺失突变会增加拟南芥的角果数目与种子重量，基因缺失突变后的核苷酸序列为以下任一：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO:3。

本发明的技术方案具体如下：

本发明利用转基因技术，构建AT5G02580基因过表达载体，通过农感菌介导遗传转化野生型拟南芥，获得阳性的转基因植株，通过基因的表达分析，鉴定出过表达AT5G02580基因的转基因植株。同时，本发明还利用基因编辑技术，在野生型拟南芥中对AT5G02580基因进行编辑，获得两种该基因的片段缺失突变体。然后，比较了缺失突变体、过表达植株与野生型对照的主茎上的角果数目及其种子千粒重，结果发现缺失突变体的角果数目与种子千粒重都显著性高于野生型对照，而过表达AT5G02580基因植株的表型则刚好相反。

因此，表明该基因参与了拟南芥的角果生长发育，是一个负调控拟南芥角果生物量的关键因子，其功能的发现对十字花科其它作物的角果研究具一定的借鉴意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为拟南芥野生型、转基因植株中AT5G02580基因的表达量分析，其中是过表达-1、过表达-2是两个不同转基因株系(下同)；

图2为拟南芥野生型、缺失突变-1和缺失突变-2的植株中AT5G02580基因编辑靶点的测序分析，其中缺失突变-1和缺失突变-2为AT5G02580基因的两种不同片段缺失突变体(下同)；

图3为拟南芥野生型、缺失突变-1、缺失突变-2、过表达-1、过表达-2植株的主茎角果数统计；

图4为拟南芥野生型、缺失突变-1、缺失突变-2、过表达-1、过表达-2植株的种子千粒重统计；

**表示其它组与野生型对照组之间的t检验存在极显著性(P<0.01)差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、AT5G02580基因的PCR克隆

采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂提取拟南芥叶片的总RNA，具体操作按产品说明；对获得的RNA，使用GoScript

在生物技术公司(如TaKaRa)合成扩增AT5G02580基因的PCR引物(5’端带有限制性内切酶的识别序列，下划线所示)：

引物1：5’-

引物2：5’-

从以上获得的cDNA中，用PrimerSTAR HS DNA Polymerase试剂盒(TaKaRa)PCR扩增AT5G02580基因，具体方法为：在PCR管中分别加入PrimerSTAR HS DNA Polymerase0.2μL、5×PrimerSTAR Buffer 4μL、cDNA 0.8μL、引物1与引物2(10μM)各0.5μL、dNTPMixture1.6μL、ddH

步骤(1)95℃，5min；

步骤(2)先98℃10s，60℃15sec，72℃，60sec，重复步骤(2)循环30次；

步骤(3)72℃10min。

基因AT5G02580的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2、AT5G02580基因过表达载体的构建

对实施例1获得的PCR产物，用

将纯化的酶切目的基因片段插入到表达载体pCAMBIA1300S中：纯化的酶切目的基因片段3μL、线性化pCAMBIA1300S载体1μL、T4 DNA Ligase(Takara)0.5μL、T4 DNA LigaseBuffer 1μL、ddH

实施例3、AT5G02580基因过表达载体的遗传转化

农杆菌介导法(Plant Journal,1998,16(6):735-743)，将pCAMBIA1300-35S::AT5G02580载体遗传转化到野生型拟南芥Col-0中，经过筛选，获得相应的转基因植株。

实施例4、转基因植株的阳性鉴定

分别取野生型拟南芥、转基因单株的叶片各0.1g，在液氮研磨后，加600μl提取液(15.76gTris-cl，29.22g Nacl，15.0g SDS粉末加超纯水定容至1L，pH＝8.0)，65℃保温1h；加200μl 5MKAC，冰浴10min；再加500μl氯仿，混匀后10000rpm离心5min；取上清，加入500μl异丙醇，混匀，12000rpm离心3min，弃去上清；用75％乙醇500μl洗涤沉淀，12000rpm离心3min，弃去上清；倒置干燥DNA 15min后，加50μl纯水溶解DNA。

在生物技术公司(如TaKaRa)合成鉴定AT5G02580基因转基因的PCR引物：

引物3：5’-ATGGGTGATCATAATAGCTCGCA-3’；

引物4：5’-TTAGATTGTAGTTCGTGAAAGCA-3’。

用以上提取的基因组DNA为模板，用2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN公司)进行PCR扩增，PCR扩增体系为20μl，含有2×Taq PCR MasterMix 10μl，引物3与引物4(10μM)各0.5μL，模板DNA 1μl(<1μg)，ddH

实施例5、转基因植株中AT5G02580基因的表达分析

按照实施例1的方法提取实施例4所得的阳性转基因植株叶片的RNA，并合成cDNA。在生物技术公司(如TaKaRa)合成AT5G02580基因表达分析的PCR引物：

引物5：5’-AGTATTCAACATGGGCAAAG-3’

引物6：5’-TTCTCGGTCGGTATTTCTT-3’

基因表达水平测定采用qPCR方法，使用TB Green

与野生型相比，结果如图1所示，在转基因植株中鉴定到了两个过表达AT5G02580基因的不同株系，用于后续的表型分析。

实施例6、拟南芥AT5G02580基因缺失突变体的构建

设计AT5G02580基因编辑的靶向sgRNA序列：5'-GGAATGTATAGTATTCAACA-3’，并合成相应的退火引物：5'-TGATTGGAATGTATAGTATTCAACA-3’与5'-AAACTGTTGAATACTATACATTCCA，并采用CRISPR/Cas9试剂盒(Biogle，China)按照产品说明构建AT5G02580基因编辑载体。按照实施例3的方法将AT5G02580基因编辑载体遗传转化到拟南芥野生型品种Col-0中，获得相应的转基因拟南芥植株。

提取由实施例6获得的转基因拟南芥植株DNA：称取0.1g新鲜叶片组织，于液氮中研磨成粉末，转入2mL离心管中，加300μL提取液(1.25g/L SDS，500mmol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)，在65℃冰浴1h；再加100μL的5mol/L KAC，冰浴10min；然后加入250μL氯仿，混匀，静置5min；12000r/min离心10min，取上清液于1.5ml管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min离心5min，弃上清，加1mL 70％乙醇冲洗沉淀，12000r/min离心7min后弃上清，倒置室温风干，加入100μL ddH2O溶解DNA。

合成PCR扩增的引物：

引物7：5'-GTGACTATAGCATCTATCATCCTTCA-3'

引物8：5'-TTTCGCTAGCTCTTTCCACAC-3'

以实施例6获得的转基因拟南芥植株DNA为模板，采用2×Taq PCR试剂(天根)，PCR体系为20μL，其中包括了模板DNA 1μL、引物7与引物8(10μM)各0.5μL，10μL 2×Taq PCRMasterMixⅡ与ddH

PCR产物经测序分析后，成功鉴定了AT5G02580基因的2种片段缺失突变体：缺失突变-1植株，缺失10个碱基A(图2)，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；缺失突变-2植株，缺失29个碱基A(图2)，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。两种片段缺失突变同时还导致了AT5G02580基因发生移码突变。

实施例7、拟南芥植株的角果数目与种子千粒重统计分析

取野生型拟南芥Col-0、缺失突变-1、缺失突变-2、过表达-1、过表达-2五类植株的种子，放入锥形瓶中，加入800μl 10％(V/V)的次氯酸钠进行消毒，在200rpm摇床20min后，弃去锥形瓶中的液体，种子用无菌水清洗多次，然后在4℃培养箱中进行春化作用，3d后将种子铺在滤纸上风干，然后铺在1/2MS平板培养基上，置于22℃光照培养箱(16h昼8h夜)中培养7～10d，再将长势良好的小苗移栽营养土中培养，其继续生长至成熟期。随机选取以上五类植株各9株，统计每株主茎上的角果数目；然后，取下角果，分别收集每株的种子，28℃风干两周，用电子天枰称量种子的称重。采用t-Test方法分别分析缺失突变-1、缺失突变-2、过表达-1、过表达-2与野生型对照间的显著性差异。

鉴定结果，缺失突变-1与缺失突变-2植株的角果数均显著高于野生型，分别上升了24.3％、27.3％，而过表达-1与过表达-2转基因植株的角果数均显著低于野生型，分别下降了25.9％、31.0％(图3)；同时，缺失突变-1与缺失突变-2植株的种子千粒重均显著高于野生型，分别上升了6.3％、5.8％，而过表达-1、过表达-2植株种子的千粒重均显著著低于野生型，分别下降了5.9％、6.9％(图4)。以上结果表明，AT5G02580基因负调控了拟南芥角果生物量的合成，该基因的两种缺失突变能提高拟南芥的角果数及其种子重量。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 有效提高植物果实生物量的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtgatc ataatagctc gcaagcttct tacatccatt tggtgcatca tttgatagaa 60

gaatgtatag tattcaacat gggcaaagaa gagtgtatgg atgctctgtt caagcatgct 120

aatattaagc ctatcatcac ttccacagtg tggaaagagc tagcgaaaga gaacaaagag 180

ttcttcgagg catacgagag aagacgagaa gaaataccga ccgagaaaga gacagctcga 240

agaatccgtg atttgctttc acgaactaca atctaa 276

<210> 2

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtgatc ataatagctc gcaagcttct tacatccatt tggtgcatca tttgatagaa 60

gaatgtacat gggcaaagaa gagtgtatgg atgctctgtt caagcatgct aatattaagc 120

ctatcatcac ttccacagtg tggaaagagc tagcgaaaga gaacaaagag ttcttcgagg 180

catacgagag aagacgagaa gaaataccga ccgagaaaga gacagctcga agaatccgtg 240

atttgctttc acgaactaca atctaa 266

<210> 3

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtgatc ataatagctc gcaagcttct tacatccatt tggtgcaaca tgggcaaaga 60

agagtgtatg gatgctctgt tcaagcatgc taatattaag cctatcatca cttccacagt 120

gtggaaagag ctagcgaaag agaacaaaga gttcttcgag gcatacgaga gaagacgaga 180

agaaataccg accgagaaag agacagctcg aagaatccgt gatttgcttt cacgaactac 240

aatctaa 247