一种巨噬细胞纳米颗粒复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种巨噬细胞纳米颗粒复合物及其制备方法与应用。

背景技术

癌症是当今威胁人类健康的主要疾病之一。近年来提出的近红外光介导的光热治疗，能够对肿瘤组织进行定点清除并且对正常组织具有较低的毒副作用，为肿瘤的治疗提供了新的方法。纳米材料在生物医学方面的应用和研究是纳米科技的一个十分重要方面。研究纳米技术在生命医学上的应用，可以在纳米尺度上比较清楚认识生物大分子的精细结构及相应功能的关系，获取生命信息或物质。

巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在血管生成、细胞外基质重塑、癌细胞增殖、转移和免疫抑制以及对化疗药物的耐药性和检查点阻断免疫治疗中发挥作用。适当激活时，巨噬细胞可以介导癌细胞的吞噬和细胞毒性肿瘤杀伤，并与先天性和适应性免疫系统的组成部分进行有效的双向相互作用。因此，它们已成为癌症治疗中的治疗靶点。巨噬细胞本身的吞噬能力很强，易于与药物结合，这些特点为单核-巨噬细胞成为药物载体提供了可能。但药物直接与单核巨噬细胞结合时有时会出现载药量过低、药物提前释放和药物活性被细胞影响等问题。因此，修饰巨噬细胞表面，为巨噬细胞纳入新的功能是迫切需要的。

相关技术有采用正电荷纳米颗粒吸附于巨噬细胞表面来修饰巨噬细胞表面，但是正负电荷吸附为非共价连接，在复杂溶液环境中容易脱落；也有通过马来酰亚胺基团和巨噬细胞上的巯基偶联以实现对巨噬细胞的选择性修饰，但是新生成的C-S键在生理条件下稳定性不足，会发生逆迈克尔加成，在有竞争性的巯基化合物(例如半胱氨酸)时更不稳定。因此，仍然亟需新的对巨噬细胞表面的修饰方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种巨噬细胞纳米颗粒复合物，所述巨噬细胞纳米颗粒复合物连接稳定，特异性好。

本发明还提出一种上述巨噬细胞纳米颗粒复合物的制备方法。

本发明还提出一种上述巨噬细胞纳米颗粒复合物的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种巨噬细胞纳米颗粒复合物，所述巨噬细胞纳米颗粒复合物为巨噬细胞通过N3-DBCO连接纳米颗粒得到。

在本发明的一些实施方式中，所述巨噬细胞纳米颗粒复合物的粒径为130-180nm。

根据本发明的第二方面，提出了一种巨噬细胞纳米颗粒复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1、在巨噬细胞表面修饰叠氮基团；

S2、制备纳米颗粒：将疏水性多聚物溶于第一溶剂，得到第一混合溶液，将吲哚菁绿、卵磷脂和含有二苯并环辛炔的磷脂类物质溶解于第二溶剂得到第二混合溶液，将第一混合溶液逐滴加入到第二混合溶液中，超声3-8min，得到纳米颗粒；

S3、将步骤S1制备得到的表面修饰叠氮基团巨噬细胞与步骤S2制备得到的纳米颗粒进行连接，制备得到巨噬细胞纳米颗粒复合物。

在本发明的一些实施方式中，所述巨噬细胞为人源巨噬细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述在巨噬细胞表面修饰叠氮基团包括以下步骤：诱导巨噬细胞极化，将极化的巨噬细胞加入引入叠氮基团的糖分子进行孵育即得。

在本发明的一些实施方式中，所述糖分子包括甘露糖胺盐酸盐、葡萄糖胺盐酸盐或半乳糖胺盐酸盐、四乙酰甘露糖、四乙酰半乳糖、乙酰唾液酸和四乙酰葡萄糖中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述引入叠氮基团的糖分子为四乙酰基-N-叠氮乙酰甘露糖胺。

在本发明的一些实施方式中，所述巨噬细胞的培养采用含有5-15％FBS的培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述培养基为RPMI-1640培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述巨噬细胞的培养条件为在30-40℃，含有2-7％CO

在本发明的一些实施方式中，在诱导巨噬细胞极化前还包括诱导巨噬细胞分化的步骤，诱导分化的试剂采用佛波酯或集落刺激因子进行。

在本发明的一些实施方式中，所述佛波酯(PMA)的浓度为80-120ng/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述诱导细胞极化的培养液包括脂多糖、IFN-γ和PMA。

在本发明的一些实施方式中，所述脂多糖的含量为80-120ng/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述IFN-γ的含量为10-30ng/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述佛波酯的浓度为80-120ng/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述孵育的时间为40-50h。

在本发明的一些实施方式中，所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(又称聚乙交酯丙交酯)、聚乳酸和聚己内酯的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述疏水性多聚物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(简写为PLGA)。

在本发明的一些实施方式中，所述含有二苯并环辛炔的磷脂类物质包括磷脂聚乙二醇二苯基环辛炔。

在本发明的一些实施方式中，所述卵磷脂为大豆卵磷脂。

在本发明的一些实施方式中，所述吲哚菁绿、卵磷脂和含有二苯并环辛炔的磷脂类物质的添加质量比为(40～80)：(6～12)：(4～8)。

在本发明的一些实施方式中，所述吲哚菁绿、卵磷脂含有二苯并环辛炔的磷脂类物质的添加质量比为50：9：6。

在本发明的一些实施方式中，所述第一溶剂为丙酮或乙腈。

在本发明的一些实施方式中，所述第二溶剂为质量分数为2-10％的乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述第二溶剂为质量分数为3-5％的乙醇。

在本发明的一些实施方式中，所述超声采用超声波细胞破碎仪进行，频率为10-30kHz，功率为30-40W，时间为3-8min。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米颗粒的制备还包括超滤步骤，所述超滤采用8-12KDa的超滤管进行超滤。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中的连接在RPMI-1640培养基中进行。

在本发明的一些实施方式中，所述连接的反应时间为0.5-2h。

在本发明的一些实施方式中，所述巨噬细胞与纳米颗粒的添加比例为(0.5～2)：(90～120)。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米颗粒的添加浓度为80-150μg/mL。

在本发明的第三方面，提出了上述复合纳米颗粒的应用，所述应用为在制备抗肿瘤的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备药物递送载体中的应用。

根据本发明的一些的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明制备得到的巨噬细胞纳米颗粒复合物连接稳定，特异性好，对肿瘤的靶向效率高，为肿瘤提供了新的治疗途径。制备巨噬细胞纳米颗粒复合物的方法简单，反应条件温和，便于操作，将叠氮化的糖分子四乙酰基-N-叠氮乙酰甘露糖胺(Ac4ManAz)与巨噬细胞共孵育，使巨噬细胞表面代谢标记上叠氮基团(-N3)，可与携带二苯基环辛炔基团(-DBCO)的纳米颗粒相互识别并发生反应，实现巨噬细胞与纳米颗粒的高效连接。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的巨噬细胞与纳米颗粒的连接的示意图；

图2为本发明测试例中的巨噬细胞膜表面叠氮基团代谢表达流式图；

图3为本发明测试例中的INPs粒径图；

图4为本发明测试例中的巨噬细胞与纳米颗粒连接的扫描电镜图；

图5为本发明测试例中的巨噬细胞与纳米颗粒连接的激光共聚焦图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例制备了一种巨噬细胞纳米颗粒复合物，制备原理如图1所示，具体过程为：

(1)巨噬细胞的准备：

材料：人源巨噬细胞(THP-1)(购自上海细胞库-ATCC细胞中心)。

巨噬细胞扩增：使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5％CO

巨噬细胞代谢标记叠氮基团：含有2×10

(2)吲哚菁绿聚合物纳米颗粒制备：

PLGA聚合物首先溶解在丙酮，PLGA聚合物的浓度为1mg/mL，作为第一混合溶液。

将180μg大豆卵磷脂，120μg DSPE-PEG-DBCO，1mg吲哚菁绿溶解于3mL 4％乙醇中，作为第二混合溶液。

用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及35W的功率边超声二混合溶液，边将1mL第一混合溶液逐滴加入其中，超声时间为5min，10KDa超滤管超滤2-3次，即得吲哚菁绿聚合物纳米颗粒(INPs)。

(3)巨噬细胞与纳米颗粒的连接：

首先用PBS缓冲液将步骤(1)得到的巨噬细胞膜表面通过代谢标记上叠氮基团的巨噬细胞清洗1次，离心收集细胞，置于不含小牛血清的RPMI-1640培养基中，然后加入步骤(2)制备得到的吲哚菁绿聚合物纳米颗粒(INPs，100μg/mL)，所述巨噬细胞与纳米颗粒的添加质量比为1:100，反应1小时，然后用PBS缓冲液洗去未连接的纳米颗粒，制备得到巨噬细胞纳米颗粒复合物。

试验例

本试验例测试了实施例1制备得到的巨噬细胞纳米颗粒复合物的性能。

1、巨噬细胞膜表面叠氮基团代谢表达

采用DBCO-Alexa Fluor 488染料用于标记N

检测结果如图2所示，从图中可以看出，巨噬细胞膜表面成功表达叠氮基团。

2、粒径检测

采用透射电镜检测实施例1制备得到的巨噬细胞纳米颗粒复合物。

检测结果如图3所示，从图中可以看出，本发明采用旋转薄膜-超声水化法制备得到的纳米颗粒(INPs)的平均粒径为160nm。

3、巨噬细胞与纳米颗粒的连接

采用扫描电镜检测实施例1制备得到的巨噬细胞纳米颗粒复合物中巨噬细胞与纳米颗粒的连接。

检测结果如图4所示，吲哚菁绿聚合物纳米颗粒(INPs，黄色)成功连接在巨噬细胞(蓝色)表面。

4、性能检测。

实施例1制备得到的巨噬细胞纳米颗粒复合物接种在8孔培养板中(Lab-

荧光纳米颗粒示踪的效果检测结果如图5所示，从图中可以看出，INPs分布于巨噬细胞膜表面，蓝色代表细胞核Hoeches 33258的荧光，红色代表ICG的荧光，INPs成功连接在巨噬细胞表面。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。