TRAF4抑制剂在制备人卵巢癌治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TRAF4抑制剂联合维甲酸在制备人卵巢癌治疗药物中的应用。

背景技术

人卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是导致女性死亡的最常见恶性肿瘤之一，是一种具有复杂分子和基因变化的异质性疾病，75％的病例在晚期被诊断。OC治疗的复杂性不仅取决于OC细胞自身的固有特性，还很大程度上取决于OC细胞与其周围微环境各组分之间的动态信号。虽然以铂为基础的化疗能够帮助大多数患者达到缓解，但该病易复发，化疗耐药，导致5年生存率仅为30％左右。因此，了解卵巢癌的耐药的相关机制，发现潜在靶点，进行合理的靶向治疗至关重要。

维甲酸(Retinoic acid,RA)是视黄醇或维生素A的主要生物活性代谢物，在细胞生长和分化中诱导一系列效应，参与胚胎发育和体内生理等作用。RA活性主要由视黄酸受体(RAR)亚家族的成员介导，即RARα、RARβ和RARγ，它们属于转录因子的核受体(NR)超家族。RARs与类视黄酮X受体(RXR)亚家族成员形成异二聚体，并通过结合靶基因启动子中的RA特异性反应元件(RAREs)作为配体调节的转录因子。RARs也有非基因组效应和激活激酶信号通路，微调RA靶基因的转录。维甲酸已被证明能在体内和培养中抑制人类卵巢癌细胞的生长。最近的一些研究表明，维甲酸作为卵巢癌化疗药物可能发挥潜在作用。维甲酸是目前治疗晚期卵巢癌的化疗方法中一种潜在的强大替代品。虽然维甲酸的抗癌作用机制还不完全清楚，但很可能是由于其抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力。近年来，有许多分子机制研究挖掘了与卵巢癌的发生和发展相关的遗传和分子变化，如Rb2/p130肿瘤抑制子等基因与维甲酸耐药性密切相关。然而，这些潜在靶点尚未导致有效/治疗性治疗药物的开发。因此，挖掘新型的与维甲酸耐药的潜在靶点能够为人卵巢癌的治疗提供新的方向。

肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子(TRAFs)是由TNFR和IL1/Toll受体家族成员，参与信号转导的一个适配器蛋白家族。肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)是TRAF家族成员之一，是人类癌症中发现的第一个上调的成员。TRAF4通常在多种人类癌症中过表达。据报道，TRAF4在大约2.5％的卵巢癌患者中被扩增。近期研究表明，TRAF4在高危卵巢癌(High-grade serous ovarian cancer，HGSOC)中的表达明显高于正常卵巢上皮，TRAF4通过激活YAP通路促进卵巢癌细胞恶性进展，可能作为HGSOC的预后生物标志物。然而，TRAF4在维甲酸治疗人卵巢癌中的功能尚未被探讨。

发明内容

本发明的目的是提供TRAF4抑制剂联合维甲酸在制备人卵巢癌治疗药物中的应用。

本发明先通过挖掘TCGA数据库分析TRAF家族(TRAF1-TRAF7)在人卵巢癌中的mRNA表达情况，发现TRAF4的mRNA表达水平偏高，并在人卵巢癌细胞中验证了TRAF4的高蛋白表达水平，推测TRAF4在人卵巢癌中起重要的作用。之后利用RNAi技术对SK-OV-3和A2780细胞进行瞬时敲低TRAF4，在此基础上加入终浓度为0.125μM-32μM的维甲酸孵育，考察抑制TRAF4是否使人卵巢癌细胞对维甲酸更加敏感。此外进一步考察了TRAF4的抑制对人卵巢癌细胞SK-OV-3在维甲酸的处理下细胞克隆形成的影响。最后研究了TRAF4是否会增强维甲酸诱导的人卵巢瘤细胞凋亡，结果证实TRAF4基因敲低与维甲酸联用可增加几种促凋亡因子的表达。因此，TRAF4抑制可提高人卵巢癌对维甲酸的敏感性，这为以TRAF4作潜在靶点的抑制剂治疗人卵巢癌提供新的思路。

附图说明

图1为TRAF家族在人卵巢癌中的表达情况。左图为TCGA数据库中人卵巢癌队列中TRAF家族的mRNA水平；右图为人卵巢癌SK-OV-3和A2780细胞中TRAFs的蛋白水平。

图2为敲低TRAF4后人卵巢癌细胞对维甲酸治疗的敏感性结果。A为不同浓度的维甲酸处理siTRAF4干扰前后的人卵巢癌SK-OV-3细胞结果；B为不同浓度的维甲酸处理siTRAF4干扰前后的人卵巢癌A2780细胞结果。

图3为敲低TRAF4后人卵巢癌细胞的增殖结果。A为MeWo细胞在siNEG或siTRAF4转染后经8μM维甲酸处理细胞克隆形成情况；B为GraphPad Prism 8.2.0定量分析不同处理组细胞克隆形成结果，所有数据均为三次独立重复实验的数据，用三次测量的平均值±标准差表示，**p<0.01,***p<0.001。

图4为维甲酸(RA)处理SK-OV-3细胞前后TRAF4敲低对凋亡相关因子的蛋白水平变化结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

1.生物信息数据挖掘

使用TCGA数据库检索所有数据进行生信处理。TRAFs家族(TRAF1-TRAF7)mRNA水平在UCSC Xena网站(http://xena.ucsc.edu/)上进行分析。

2.细胞培养

两种不同的人恶性黑色素瘤细胞株SK-OV-3和A2780购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS,1％青霉素-链霉素)于5％ CO

3.细胞转染

前一天开始在60mm皿中培养SK-OV-3和A2780细胞，使每皿细胞预计在普板后第二天的细胞汇聚度为70％-80％。在500μL Opti-MEM reduced serum medium中加入5μMsiGENONE SMARTpool TRAF4 siRNA(M-006908-01-0005，Horizon Discovery)或siGENOMEnon-targeting Control siRNA(D-001206-13-5，Horizon Discovery)，轻轻混匀，静置5min。在500μL Opti-MEM reduced serum medium中加入10μL转染试剂LipofectamineRNAiMax，轻轻混匀，静置5min。将上述溶液轻轻混匀，室温孵育15min，即获得转染溶液。将此混合溶液滴加至分别培养A357和MeWo细胞的60mm细胞培养皿中，轻轻混匀。转染6h后，更换新鲜完全培养基，置于5％ CO

siGENMONE SMARTpool TRAF4 siRNA序列如下：

(1)5’-GAAACUAUGUGCGGGAUGA-3’(Seq_1)

(2)5’-UGAUCUACCUGCACACUUG-3’(Seq_2)

(3)5’-GGCCACCGUUUCUGCGAUA-3’(Seq_3)

(4)5’-CAUCCGUGCUGCUGUUGAA-3’(Seq_4)。

4.细胞增殖测定

上述细胞培养24h后，收集并计数siRNA转染SK-OV-3和A2780细胞，一部分用于细胞活力测定，一部分用于Western blot分析。将2000-4000个细胞/孔接种在90μL培养基/孔96孔板中。培养过夜后，用最终浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32μM的10μL视黄酸处理细胞5天。将10μL CYQUANT试剂混合物直接加入每个孔中，并在37℃下孵育板1h，激发光480nm和发射光520nm条件下测定细胞活性。每个药物浓度下进行三次细胞毒性试验。

5.Western blot分析

转染细胞培养48h后收集细胞，1*NETN裂解缓冲液(100mM NaCl,20mM Tris-Cl(pH8.0),0.5mM EDTA,0.5％(V/V)Nonidet P-40(NP-40))加入1*蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂重悬细胞沉淀，冰上孵育30分钟。将上述裂解混合物进行超声处理，4℃下12000g离心10min，上清即为总蛋白。使用Quick Start

6.细胞克隆形成分析

按照上述细胞转染方法，利用siRNA干扰技术在SK-OV-3细胞敲低TRAF4，siNegative(siNEG)作为对照进行相同处理。干扰24h后，将TRAF4敲低的SK-OV-3细胞与siNegative(siNEG)处理MeWo细胞分别加入6孔板(500-1000个细胞/孔)，用8μM维甲酸处理14天后，用1×PBS轻轻冲洗细胞，室温下用乙醇固定30分钟。用0.5％w/v结晶紫染色过夜，1×PBS轻轻洗涤细胞菌落。利用ChemiDoc

先从TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)挖掘人卵巢癌样本中TRAF1-TRAF7的mRNA水平。结果显示，所有TRAF1-TRAF7 mRNA均在TCGA人卵巢癌队列中表达(n＝634)(图1所示)，其中TRAF4和TRAF7的mRNA表达量较高。其次在SK-OV-3和A2780两种人卵巢癌细胞系中检测TRAF1-TRAF7的蛋白水平。如图1所示，TRAF蛋白在卵巢癌细胞系中的表达是不同的。具体来说，与其他家族成员相比，TRAF4高表达，这与TCGA卵巢癌数据集获得的mRNA水平一致。据此，推测TRAF4可能在人卵巢癌的发生发展过程中起着至关重要的作用。

由图2可知，与对照细胞相比，siRNA介导的TRAF4的敲低显著降低了维甲酸对SK-OV-3细胞的IC

由图3A可知，与未加维甲酸处理的对照细胞相比，siTRAF4细胞产生的克隆数量较少，表明单独敲低TRAF4对SK-OV-3细胞克隆形成有较强的抑制作用，这进一步支持了TRAF4在人卵巢癌细胞中的致瘤可能。此外，与siNegative(siNEG)对照组相比，维甲酸+siTRAF4协同处理后，进一步大幅减少了克隆形成，如图3B所示。维甲酸联合TRAF4抑制对SK-OV-3细胞集落形成的抑制作用分别为14.3％，而维甲酸单独抑制对SK-OV-3细胞集落形成的抑制作用分别为42.1％。

如图4所示，在TRAF4抑制的SK-OV-3细胞联合维甲酸处理，与单独敲低TRAF4相比，明显增强了Caspase 9(凋亡前蛋白)和IRF-1(干扰素受体因子，促凋亡因子)的蛋白水平，其他相关因子(Bcl-2,Survivin等)蛋白水平并未发生明显变化。值得注意的是，与单独给药维甲酸相比，siTRAF4+维甲酸协同作用在一定程度上p53(凋亡前蛋白)蛋白水平的增加。维甲酸可通过调控凋亡信号通路影响细胞增殖和生长，TRAF4能增强维甲酸诱导的人卵巢瘤细胞凋亡。上述结果进一步说明了TRAF4基因敲低与维甲酸联用可增加几种促凋亡因子的表达，因此，TRAF4抑制可增强维甲酸诱导的人卵巢癌细胞凋亡。

综上所述，TRAF4抑制可提高人卵巢癌对维甲酸的敏感性，研发以TRAF4为潜在靶点的抑制剂可为人卵巢癌的治疗提供新的思路。