CRISPR/Cas9技术创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株及方法

技术领域

本发明属于食药用真菌遗传育种技术领域，具体涉及蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Fr.]基因组的安全超表达位点CmSH1、疏水蛋白基因Cmhyd1、白毛病抗性增强的蛹虫草菌株，以及通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株的方法。

背景技术

蛹虫草白毛病，是虫草生齿梗孢(Calcarisporium cordycipiticola)引起的真菌性病害，影响蛹虫草的品质及产量，为蛹虫草栽培过程中的头号杀手；且病害一般发生在蛹虫草生长发育后期，侵染子实体并产生大量分生孢子，生产上很难防控(刘晴,万佳欣,张雨晨,董彩虹.蛹虫草病原真菌虫草生齿梗孢的生物学特性研究[J].菌物学报,2018,37(08):1054-1062.DOI:10.13346/j.mycosystema.180034.)。随着分子生物学、基因组学、遗传学、以及基因编辑技术的快速发展，对蛹虫草抗病的分子机制研究得以不断深入，发现许多基因或蛋白参与蛹虫草抗病响应过程。由于传统育种方法的局限性，利用分子手段选育抗病蛹虫草菌株显得尤为重要。如果通过基因组学、转录组学以及相关分子手段，发现与蛹虫草白毛病抗性有关的基因，进而利用CRISPR/Cas9系统进行编辑，产生超表达抗性基因的蛹虫草菌株，则可以为蛹虫草传统育种方法提供便利且高效的替代选项。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于，寻找蛹虫草基因组中安全超表达位点与增强白毛病抗性有关的靶基因，然后通过CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/Cas9)基因编辑技术定点超表达靶基因，创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株，为蛹虫草安全生产提供新菌株，并为其新品种定向改良提供遗传材料。

一方面，本发明提供了一种DNA分子，其是蛹虫草基因组中的安全超表达位点CmSH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明还提供了一种DNA分子，其是蛹虫草疏水蛋白编码基因Cmhyd1，且其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在第三方面，本发明提供了一种白毛病抗性增强的蛹虫草菌株，该蛹虫草菌株在安全超表达位点CmSH1(SEQ ID NO:1)超表达靶基因Cmhyd1(SEQ ID NO:2)。该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.40324，保藏日期为2022年09月22日。

在第四方面，本发明提供了通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株的方法，该方法包括以下步骤：

S1、确定蛹虫草基因组中的安全超表达位点；

S2、确定蛹虫草基因组中增强白毛病抗性的靶基因；

S3、确定所述安全超表达位点的sgRNA，并构建表达所述sgRNA的CRISPR-Cas9定点超表达中间载体；

S4、确定并扩增所述安全超表达位点的上、下游同源臂核苷酸序列；

S5、确定并扩增所述靶基因的完整表达盒；

S6、将S4所述的上、下游同源臂核苷酸序列和S5所述的完整表达盒连接至S3所述的CRISPR-Cas9定点超表达中间载体，构建靶基因定点超表达载体；以及

S7、将S6所得的载体转化到蛹虫草原生质体中，获得超表达所述靶基因的转化体。

在本发明第四方面的实施方案中，安全超表达位点为CmSH1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。在本发明第四方面的实施方案中，安全超表达位点的上、下游同源臂核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。在本发明第四方面的实施方案中，CmSH1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明第四方面的实施方案中，靶基因为Cmhyd1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明第四方面的实施方案中，完整表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在本发明第四方面的实施方案中，该方法还包括以下步骤：

S8、在基因组DNA水平，从S7获得的转化体中鉴定出定点超表达所述靶基因的转化体，即阳性转化体；S9、在cDNA水平，验证S8获得的阳性转化体，确认阳性转化体中所述靶基因高表达；S10、对S9中获得的阳性转化体进行传代培养，获得载体丢失的无外源基因插入、超表达所述靶基因的蛹虫草菌株；和S11、用虫草生齿梗孢侵染由S10获得的蛹虫草菌株发育的子实体，以验证所述子实体是否超表达所述靶基因且增强对白毛病的抗性。

在本发明的第五方面，本发明提供了重组载体或表达盒，其包含蛹虫草疏水蛋白编码基因Cmhyd1(SEQ ID NO:2)。

在本发明的第六方面，本发明提供了CRISPR/Cas9基因编辑载体，该载体包含安全超表达位点CmSH1的sgRNA(SEQ ID NO:3)、CmSH1的上下游同源臂核苷酸序列(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)以及蛹虫草疏水蛋白编码基因Cmhyd1(SEQ ID NO:2)。

在本发明第六方面的实施方案中，该载体的骨架载体可以为pAMA1-Cas9-hyg载体。

在本发明的第七方面，本发明涉及第一方面、第二方面的DNA分子，第五方面的重组载体或表达盒，或第六方面的CRISPR/Cas9基因编辑载体，在调控蛹虫草白毛病抗性中的应用。

在本发明的第八方面，本发明涉及安全超表达位点CmSH1在基因回补和超表达中的应用。

在第九方面，本发明提供了蛹虫草疏水蛋白在增强白毛病抗性和或防治白毛病中的应用，该疏水蛋白由基因Cmhyd1编码。

在第十方面，本发明提供了蛹虫草疏水蛋白在制备增强白毛病抗性和或防治白毛病的制剂中的应用，该疏水蛋白由基因Cmhyd1编码。

与现有工厂化蛹虫草菌株相比，本发明具有明显的有益效果。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在蛹虫草基因组的安全超表达位点CmSH1超表达蛹虫草基因组中潜在的抗病基因Cmhyd1，从而创制对白毛病抗性增强的蛹虫草菌株，且不影响子实体的商品性，既有利于降低白毛病对蛹虫草产业的危害，又能避免转基因元件整合至基因组引起的食品安全性问题，为蛹虫草抗病育种提供了思路及实验依据，且与传统育种方式相比时间短，目的性强。

附图说明

图1显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与CmSH1定点表达红色荧光蛋白菌株(CmSH1-RFP-15，66和74)的红色荧光蛋白表达状况。

图2显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与CmSH1定点表达红色荧光蛋白菌株(CmSH1-RFP-15，66和74)的子实体生长状况。

图3显示了Cmhyd1定点超表达载体pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down鉴定结果，其中A：pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down载体PCR验证，1：DL2000标记，2-4：pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down,5：水，6：pAMA1-Cas9-hyg；B：pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down酶切验证，1：BsrGⅠ单酶切，2：BsrGⅠ和SspⅠ双酶切，3：15kb标记，4：DL2000标记。

图4显示了Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)的PCR检测，其中A：利用Cas9在CmSH1位点超表达Cmhyd1的策略；B：CmSH1-Cmhyd1oe的PCR检测，M：DL2000，1：CmSH1-Cmhyd1oe，2：pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down，3：WT，4：水；C：野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)的菌丝体Cmhyd1表达量检测。

图5显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)潮霉素敏感性检测。

图6显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)的子实体生长状况。

图7显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)的子实体性状比较。

图8显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)接种虫草生齿梗孢10天后的发病情况。

图9显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)接种虫草生齿梗孢10天后的发病子实体条数和病斑面积统计。

图10显示了野生型蛹虫草菌株(WT)与Cmhyd1定点超表达菌株(CmSH1-Cmhyd1oe)子实体被虫草生齿梗孢侵染7天后Cmhyd1的表达量，其中，WTi：野生型蛹虫草菌株被虫草生齿梗孢侵染7天，CmSH1-Cmhyd1oei：Cmhyd1定点超表达菌株被虫草生齿梗孢侵染7天。

具体实施方式

下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。

目前，蛹虫草中基因的超表达和回补一般采用随机整合的方式，但是这种随机整合可能会导致位置效应，造成表达量的不一致。解决这一问题的方法是选择一个转录稳定且活跃的基因组区域，然后在该区域靶向整合一个基因。该转录稳定且活跃的区域称为“基因组安全港”，这个概念最初源于高等真核生物，该区域被认为既具有转录活性，又不会导致任何可识别的表型效应。这种区域已在新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中被识别并广泛应用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过基因组的定向编辑实现菌株改良，相比于传统杂交、诱变及驯化等育种方法，该技术具有目的性强、操作周期短、简便、高效且不引入外源DNA片段等优势。其中，载体元件AMA1(丝状真菌自主复制核苷酸序列)能够维持载体独立于染色体外复制，因此载体几乎不会插入到真菌的基因组中，在无抗生素选择压力的条件下很容易实现转化体中的载体丢失，从而实现真正无外源基因插入的无痕编辑，避免转基因的安全问题。

因此，如果能够在蛹虫草基因组中确定其“安全港”，并找到与白毛病抗性有关的靶基因，然后利用CRISPR/Cas9编辑技术，使靶基因在安全港即安全位点进行定点超表达，就能获得白毛病抗性增强的蛹虫草菌株。本发明令人惊异地发现，蛹虫草基因组中Cmhyd1基因编码蛹虫草疏水蛋白，与抗白毛病相关，且研究确定CmSH1为蛹虫草基因组中的安全超表达位点，由此获得本发明。

因此，本发明提供了蛹虫草因组中的安全超表达位点CmSH1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。CmSH1定点红色荧光蛋白表达蛹虫草菌株的平板菌丝生长速度及见光转色(类胡萝卜素积累)程度与野生型菌株无异，CmSH1定点表达红色荧光蛋白，菌丝产生强烈的红色荧光，可在小麦培养基上正常发育成子实体且与野生型无异，表明CmSH1定点超表达对蛹虫草栽培性状无影响，因此可以作为蛹虫草中安全的超表达位点。

另一方面，本发明提供了一种DNA分子，其是蛹虫草疏水蛋白编码基因Cmhyd1，且其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在第三方面，本发明提供了白毛病抗性增强的蛹虫草菌株，该菌株在安全超表达位点CmSH1定点超表达Cmhyd1基因。该蛹虫草菌株的平板菌丝生长速度及见光转色(类胡萝卜素积累)程度与野生型菌株无明显差异，可在小麦培养基上正常发育成子实体，且白毛病抗性增强。

在第四方面，本发明提供了通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株的方法，该方法包括以下步骤：S1、确定蛹虫草基因组中的安全超表达位点；S1、确定蛹虫草基因组中增强白毛病抗性的靶基因；S3、确定安全超表达位点的sgRNA，并构建表达sgRNA的CRISPR-Cas9定点超表达中间载体；S4、确定并扩增安全超表达位点的上、下游同源臂核苷酸序列；S5、确定并扩增靶基因的完整表达盒；S6、将S4所述的上、下游同源臂核苷酸序列和S5所述的完整表达盒连接至S3所述的CRISPR-Cas9定点超表达中间载体，构建靶基因定点超表达载体；以及S7、将S6所得的载体转化到蛹虫草原生质体中，获得超表达靶基因的转化体。

在本发明的实施方案中，通过基因组、多套转录组分析筛选以及红色荧光蛋白位点特异性表达，确定蛹虫草基因组中CmSH1为蛹虫草基因组中的安全超表达位点，可用于蛹虫草基因回补和超表达。CmSH1为位于蛹虫草CCM_00870和CCM_00871基因之间的间隔区，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的实施方案中，通过互作转录组分析和CmHYD1毕赤酵母(Pichiapastoris)外源表达的方式，本发明确定蛹虫草基因组中编码疏水蛋白的基因与蛹虫草对白毛病抗性相关，称为Cmhyd1，可以作为靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

sgRNA(single guide RNA)是CRISPR基因敲入敲除系统中的重要组成部分，与cas9酶结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。在本发明的实施方案中，sgRNA核苷酸序列为CmSH1原间隔核苷酸序列毗邻基序(Protospacer-associated motif,PAM)上游的20bp碱基，即5′-N20-NGG-3′，其中，NGG表示PAM核苷酸序列，N20代表20bp碱基的识别核苷酸序列。

在本发明优选的实施方案中，sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明优选的实施方案中，可以通过扩增sgRNA表达盒(SEQ ID NO:4)，将其连接至载体例如pAMA1-Cas9-hyg载体上，来构建定点超表达中间载体，例如pAMA1-CmSH1-sgRNA。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使靶基因形成双链断裂位点(Double-strandbreak,DSB)，利用真菌自身的DSB修复机制，引入两端同源臂核苷酸序列启动机体同源重组修复，其中上游同源臂核苷酸序列位于CmSH1区域上游，下游同源臂核苷酸序列位于CmSH1区域下游，上下游同源臂核苷酸序列分别与超表达靶基因紧密连接，从而导致靶基因在CmSH1位点准确插入。

在本发明的实施方案中，安全超表达位点CmSH1的上、下游同源臂核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

完整表达盒通常包括启动子、CDS(coding DNA sequence)以及终止子，可以成功地表达功能性蛋白。在本发明的具体实施方案中，完整表达盒包含SEQ ID NO:7所示的启动子、SEQ ID NO:2所示的CDS即Cmhyd1基因以及SEQ ID NO:8所示的终止子。

在本发明的实施方案中，可以通过将安全超表达位点的上、下游同源臂核苷酸序列，以及包含启动子、靶基因、终止子的完整表达盒连接至CRISPE-Cas9定点超表达中间载体，构建靶基因定点超表达载体。

在本发明的实施方案中，通过将靶基因定点超表达载体转化到蛹虫草原生质体中，来获得在安全超表达位点超表达靶基因的转化体。转化可以是PEG介导的转化，或者通过电穿孔或基因枪法进行。

在本发明的实施方案中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制白毛病抗性增强的蛹虫草菌株的方法还可以包括：S8、在基因组DNA水平，从S7获得的转化体中鉴定出定点超表达所述靶基因的转化体，即阳性转化体；S9、在cDNA水平，验证S8获得的阳性转化体，确认阳性转化体中靶基因高表达；S10、对S9中获得的阳性转化体进行传代培养，获得载体丢失的无外源基因插入、超表达靶基因的蛹虫草菌株；和S11、用虫草生齿梗孢侵染由S10获得的蛹虫草菌株发育的子实体，以验证子实体是否超表达靶基因且增强对白毛病的抗性。

利用同源重组方法进行基因敲除之后，为了更好的证明基因的功能，确认是否其它基因被敲除，造成相应表型的变化，都要进行该基因的回补试验。回补后表型恢复或部分恢复，便能证明该表型和敲除的基因有关。目前，蛹虫草中基因的回补一般采用随机整合的方式，但是这种随机整合可能会导致位置效应，造成表达量的不一致，给筛选带来巨大的工作量。解决这一问题的方法是寻找合适的定点回补位点，进行基因的定点回补。

CmSH1定点表达红色荧光蛋白的蛹虫草菌株的平板菌丝生长速度及见光转色(类胡萝卜素积累)程度与野生型菌株无异，CmSH1定点表达红色荧光蛋白，菌丝产生强烈的红色荧光，可在小麦培养基上正常发育成子实体且与野生型无异，表明CmSH1定点表达对蛹虫草栽培性状无影响，因此可作为蛹虫草中安全的超表达位点，也可作为潜在的定点回补位点。因此，本发明提供了CmSH1在基因回补和超表达中的应用。

本发明利用CRISPR/Cas9技术使靶基因形成双链断裂位点(Double-strandbreak,DSB)，利用真菌自身DSB的修复机制，引入两端同源臂核苷酸序列启动机体同源重组修复，其中上游同源臂核苷酸序列位于CmSH1区域上游，下游同源臂核苷酸序列位于CmSH1区域下游，中间插入超表达靶基因Cmhyd1。上游同源臂、超表达靶基因和下游同源臂核苷酸序列紧密连接，从而定点超表达该靶基因，且无抗性基因插入。

实施例

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

主要试剂包括：NEB公司的限制性内切酶；TOYOBO公司的高保真DNA聚合酶；南京诺唯赞生物科技股份有限公司的普通DNA聚合酶，一步克隆、反转录试剂盒，定量PCR试剂；OMEGA公司的RNA提取试剂盒；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素、潮霉素试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。实施例中所用的各种其他化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

下述实施例所用野生型蛹虫草菌株为CGMCC 3.16323，虫草生齿梗孢菌株为CGMCC5.2193，所用载体pAMA1-Cas9-hyg由中国科学院微生物研究所刘钢研究员课题组惠赠，以CmSH1位点超表达Cmhyd1为例阐述具体实施方式。

实施例1、确定蛹虫草基因组中的安全超表达位点CmSH1

通过已发表的蛹虫草CM01基因组(Zheng et al.,Genome sequence of theinsect pathogenic fungus Cordyceps militaris,a valued traditional chinesemedicine.Genome Biology,2012,R116.)、ATCC 34164基因组(Kramer et al.,Chromosomelevel assembly and secondary metabolite potential of the parasitic fungusCordyceps militaris.BMC Genomics,201718(1):912.)和多套转录组测序分析(Zhang etal.,Dynamic genome-wide transcription profiling and direct target genes ofCmWC-1 reveal hierarchical light signal transduction in Cordycepsmilitaris.Journal of Fungi,2022,8(6):624.)，按照“两个基因的终止子区域、间隔区长度3000-7000bp，间隔区有表达量”这一标准，筛选出蛹虫草基因组中的CmSH1(SEQ ID NO:1)为潜在的安全超表达位点，CmSH1是蛹虫草CM01(CGMCC3.14242)基因组中CCM_00870和CCM_00871基因间隔区的一段序列。通过PEG介导的原生质体转化在该位点表达红色荧光蛋白，筛选出的3个转化体均表达强烈的红色荧光，表明该位点具有较强的转录活性(图1)，且3个转化体的生长速度、见光转色程度、子实体发育与野生型菌株无异(图2)，因此确定CmSH1可以作为蛹虫草基因组中安全的超表达位点。

实施例2、确定蛹虫草基因组中增强白毛病抗性的靶基因Cmhyd1

选择虫草生齿梗孢侵染4天和8天的蛹虫草子实体进行转录组测序，以健康子实体作为对照。对上述转录组测序结果进行差异表达分析，发现蛹虫草被虫草生齿梗孢侵染4天和8天时，蛹虫草疏水蛋白基因Cmhyd1(CCM_03537)高度表达，尤其是被侵染4天时，从而初步确定蛹虫草疏水蛋白基因Cmhyd1(SEQ ID NO:2)为增强蛹虫草白毛病抗性的靶基因。用重组载体pPICZαA-Cmhyd1转化毕赤酵母菌株GS115并诱导其表达，经纯化获得含疏水蛋白的发酵上清液(浓度约0.1mg/mL)，作为实验组；用空载体pPICZαA转化毕赤酵母菌株GS115并诱导其表达，经纯化获得不含疏水蛋白的发酵上清液，作为阴性对照(表达纯化疏水蛋白的方法、空载体pPICZαA、重组载体pPICZαA-Cmhyd1和毕赤酵母菌株GS115，参见李肖，蛹虫草疏水蛋白家族基因功能及调控机制研究.2021中国科学院大学博士学位论文)。将上述发酵上清液分别喷施至虫草生齿梗孢侵染1天的蛹虫草子实体上，结果发现喷施含疏水蛋白的发酵上清液可提高蛹虫草对白毛病的抗性，进一步确定Cmhyd1在增强白毛病抗性方面发挥着重要的作用。

实施例3、CmSH1定点超表达Cmhyd1的CRISPR/Cas9基因编辑中间载体构建和检测

为了进一步确认Cmhyd1在增强白毛病抗性方面的作用，利用已获得的蛹虫草基因组中的安全超表达位点CmSH1超表达Cmhyd1。为了构建CmSH1定点超表达Cmhyd1的载体，需要构建一个表达sgRNA的中间载体，即pAMA1-CmSH1-sgRNA。选取CmSH1作为靶点，sgRNA识别区的编码序列为CmSH1序列第1566-1585位。使用Eukaryotic Pathogen CRISPR guideRNA/DNA Design Tool网站(http://grna.ctegd.uga.edu/)在线设计sgRNA，所用参数均为默认，设计包含靶点信息的引物。sgRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

该中间载体按照如下步骤制备：

3.1、PCR扩增：以pUC57-sgRNANc5SrRNA(记载在如下文献中：王徐萍，蛹虫草高效基因编辑系统构建.2021中国科学院大学硕士学位论文)为模板，分别以Bste-5srRNA-F(SEQ ID NO:10)/CmSH1-sgRNA-R(SEQ ID NO:11)、CmSH1-sgRNA-F(SEQ ID NO:12)/Bste-gRNA-scaf-R(SEQ ID NO:13)为引物，按照TOYOBO公司的高保真DNA聚合酶2×KODMasterMix的说明书，进行PCR扩增，然后将获得的2种PCR产物切胶回收。

3.2、酶切：将pAMA1-Cas9-hyg载体(记载在如下文献中：王徐萍，蛹虫草高效基因编辑系统构建.2021中国科学院大学硕士学位论文)BstEⅡ酶切后切胶回收，参照诺唯赞一步克隆试剂盒说明书，与步骤3.1中切胶回收的2种PCR产物一起，进行3片段一步克隆连接，获得连接产物，即为中间载体pAMA1-CmSH1-sgRNA，该载体表达sgRNA。

限制性内切酶BstEⅡ酶切反应体系如下：

载体：2μg

限制性内切酶：2μL

10×NEBuffer 3.1：10μL

Nuclease-free water：至100μL

60℃酶切过夜。

3.3、鉴定

取10μL步骤3.2获得的连接产物，即中间载体pAMA1-CmSH1-sgRNA，转化大肠杆菌DH5α，并将其培养在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，以进行筛选。通过菌落PCR鉴定单克隆，鉴定引物为bsteck-F(SEQ ID NO:14)/bsteck-R(SEQ ID NO:15)。挑选阳性克隆，接入10mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜后提取质粒，然后对该质粒进行PCR、酶切验证，并进行测序。PCR、酶切和测序结果显示，从该阳性克隆中提取的质粒为载体pAMA1-CmSH1-sgRNA，该载体表达sgRNA，sgRNA识别区的编码序列为SEQ ID NO:1第1566-1585位。

大肠杆菌DH5α菌落PCR鉴定反应体系如下：

2×Rapid Taq Master Mix：5μL；

引物bsteck-F(10μmol/L)：0.2μL；

引物bsteck-R(10μmol/L)：0.2μL；

菌悬液(蘸取LB/Amp+培养基上菌落于10μL ddH

PCR扩增反应程序如下：

95℃预变性60s，95℃变性15s，退火温度(Annealing temperature,Tm)退火15s，72℃延伸5s/Kb，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

实施例4、CmSH1定点超表达Cmhyd1的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建和检测

在中间载体pAMA1-CmSH1-sgRNA的基础上，构建CmSH1定点超表达Cmhyd1的CRISPR/Cas9基因编辑载体，即pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down，该载体表达sgRNA，且在CmSH1位点超表达Cmhyd1。选取CmSH1(SEQ ID NO:1)的上下两端约1000bp处作为上、下游同源臂(SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6)，野生型蛹虫草的疏水蛋白编码基因Cmhyd1(SEQ IDNO:2)为超表达基因，选用Cmhyd1自身的启动子(SEQ ID NO:7)和终止子(SEQ ID NO:8)。

该载体按照如下步骤制备：

4.1、PCR扩增：以野生型蛹虫草基因组DNA为模板，分别以CmSH1_up_F(SEQ ID NO:16)/CmSH1_up_R(SEQ ID NO:17)、Cmhyd1_P+CDS+T_F(SEQ ID NO:18)/Cmhyd1_P+CDS+T_R(SEQ ID NO:19)以及CmSH1_down_F(SEQ ID NO:20)/CmSH1_down_R(SEQ ID NO:21)为引物，按照TOYOBO公司的高保真DNA聚合酶2×KODMasterMix的说明书，扩增CmSH1上游同源臂(SEQ ID NO:5)、Cmhyd1完整的表达盒(SEQ ID NO:9)和CmSH1下游同源臂(SEQ ID NO:6)，得到3种PCR产物并切胶回收。

4.2、酶切：将pAMA1-CmSH1-sgRNA载体(步骤3.1中构建)SspI-HF和BsrGI双酶切后胶回收，参照诺唯赞一步克隆试剂盒说明书，与步骤4.1中切胶回收后的3种PCR产物进行4片段一步克隆连接，得到连接产物，即pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down，该载体表达sgRNA和Cmhyd1。

4.3、鉴定

取10μL步骤4.2得到的连接产物，即pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down，转化大肠杆菌DH5α，并培养在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，进行筛选。通过菌落PCR鉴定单克隆，鉴定引物为1774F(SEQ ID NO:22)/1774R(SEQ ID NO:23)。挑选阳性克隆，接入10mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜后提取质粒，然后对该质粒进行PCR、酶切验证，并进行测序。PCR、酶切和测序结果显示，从该阳性克隆中提取的质粒为重组CRISPR载体pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down(图3)，该载体表达sgRNA，含有CmSH1的上、下游同源臂和Cmhyd1的完整表达盒(图4A)。

实施例5、Cmhyd1定点超表达CRISPR-Cas9菌株的构建和鉴定

5.1、Cmhyd1定点超表达CRISPR-Cas9菌株的构建

载体pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down构建成功后，需要将该载体转化至野生蛹虫草菌株中。参照王徐萍(蛹虫草高效基因编辑系统构建.2021中国科学院大学硕士学位论文)的方法，进行野生型蛹虫草原生质体的制备和转化。将在添加500μg/mL潮霉素的复苏培养基上萌发的单菌落挑取至新的筛选培养基(PPDA+500μg/mL潮霉素)中，进行二次筛选培养。采用引物1774F(SEQ ID NO:22)/1774R(SEQ ID NO:23)(p2)和CmSH1-1723F(SEQ IDNO:24)/CmSH1-1723R(SEQ ID NO:25)(p1)进行转化体筛选，所用两对筛选引物(p1和p2)的位置如图4A所示。利用上述两对引物(p1和p2)，筛选出Cmhyd1定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe，其中Cmhyd1已整合至CmSH1位点(图4B)。经cDNA检测发现，相较于野生型蛹虫草菌株，Cmhyd1定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe菌丝体中Cmhyd1基因高表达(图4C)。

5.2、pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down载体丢失

使用无菌牙签蘸取Cmhyd1定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe的分生孢子，点接至不添加潮霉素的上述复苏培养基上进行传代培养，直至带有潮霉素抗性的载体pAMA1-CmSH1-sgRNA-up-Cmhyd1-down丢失，即获得无抗性筛选标签的无痕定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe(CGMCC No.40324)。该无痕定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe与野生型蛹虫草菌株一致，在添加500μg/mL潮霉素的PPDA培养基上不生长(图5)。

5.3、Cmhyd1无痕定点超表菌株CmSH1-Cmhyd1oe子实体性状、Cmhyd1表达量和致病力检测

对野生型蛹虫草菌株和Cmhyd1无痕定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe进行子实体栽培和致病力检测，同时检测野生型蛹虫草菌株和Cmhyd1无痕定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe子实体被虫草生齿梗孢侵染前后疏水蛋白基因Cmhyd1的表达量。

将WT和CmSH1-Cmhyd1oe菌丝块接种于种子培养基(葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g，自来水定容至1L)中，150rpm避光培养3d以制备液体菌种。将5mL上述液体菌种接种至小麦培养基(去皮小麦20g；营养液28mL：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸铵1g，维生素B1 20mg；自来水定容至1L)上，置于20℃食用菌智能出菇箱(北京智态康兴生物科技有限公司)中，观察小麦培养基中蛹虫草子实体的发育情况。

结果表明：蛹虫草疏水蛋白基因Cmhyd1定点超表达后，不影响蛹虫草原基的形成，但子实体形态发生部分改变，与野生型蛹虫草菌株相比，Cmhyd1定点超表达菌株CmSH1-Cmhyd1oe子实体稍短，头部稍膨大，子实体加粗但条数略减少，湿重和干重与野生型无差别，不影响其商品性，参见图6和图7。

统计发病子实体条数和病斑面积，发现CmSH1-Cmhyd1oe菌株发病子实体条数和病斑面积显著少于野生型蛹虫草菌株，如图8和图9所示。虫草生齿梗孢的侵染诱导Cmhyd1高表达，且CmSH1-Cmhyd1oe菌株被虫草生齿梗孢侵染后表达量显著高于野生型，如图10所示。

在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。