一种富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物的方法

技术领域：

本发明属于多环芳烃污染环境生物修复领域，尤其涉及一种富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物的方法。

背景技术：

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是广泛分布于天然环境中的含有2个苯环以上的持久性有机污染物，主要来源于人类活动，包括化石燃料、废弃物等有机物的不完全燃烧、工业排放、交通排放及原油泄漏等。PAHs是一类惰性很强的碳氢化合物，不易被降解，能稳定地存在于环境中。环境中的PAHs可随着工业废水、废弃物、大气的干湿沉降和城市地面径流等方式进入水体，并累积于沉积物或土壤中，是环境中常见的一类难降解有机污染物。在我国近岸海域，尤其是主要河口、港湾及城市毗邻海域，PAHs等持久性有机污染物的污染问题日渐突出。PAHs因具有持久性、生物累积性、长距离迁移性及高生物毒性等特征，已被美国及欧盟列为优先控制污染物，对人类健康和生态环境有着极大的潜在危害。PAHs污染已成为目前亟待解决的重要环境问题之一，其有效修复途径更加备受关注。

目前对PAHs的处理方法有物理法、化学法和生物降解法等，但大量研究表明生物降解是环境PAHs污染去除的主要机制。生物降解具有快速、无污染、经济可行等优点，因而成为PAHs污染修复的有效途径。生物降解PAHs方式因终端电子受体不同，分为好氧呼吸和厌氧呼吸代谢两种方式。好氧代谢过程中微生物易培养、降解效率高，因而被广泛研究。目前，好氧条件下多株PAHs降解菌被富集并分离，相应的好氧生物膜处理技术已被开发与投入应用。但由于实际环境中PAHs降解需要复杂的微生物群落，单一功能菌的降解效果往往不稳定。其次，有机污染物富集的环境大多处于厌氧环境，如深水层、土壤、沉积物、海洋底泥等均处于缺氧或厌氧状态。因此，识别和富集环境中厌氧微生物降解PAHs菌群，对提高环境PAHs降解效率的具有重要的理论和现实意义。

PAHs降解生物菌群的电化学富集形成电活性生物膜，在PAHs厌氧降解微生物资源发掘方面凸显优势。电活性生物膜(Electroactive biofilms,EABs)在自然环境中通常附着在固态电子受体表面，通过氧化有机物产生的电子传递至固体表面而获得能量，并驱动地球表层元素循环和污染物的转化。由EABs强化厌氧降解的有机污染物包括PAHs、石油烃、有机染料、卤代烃等。一般认为，EABs是由电活性微生物分泌的胞外多糖、蛋白、胞外DNA、菌毛等成分聚集，与细胞本身相互交联形成的导电多聚体。

发明内容：

本发明的目的是提供一种富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物的方法。

研究表明，能厌氧降解污染物的EABs微生物组成不仅仅是由电活性微生物，还有丰富的污染物降解微生物构成。因此，利用电化学手段定向筛选并富集PAHs污染环境中的微生物，使之形成EABs，有利于发掘PAHs高效降解菌。为此，我们在PAHs污染体系中构建简单的生物电化学系统，定向富集原位降解PAHs的电活性生物膜。

本发明的基本原理是：

多环芳烃污染物在环境中的降解是微生物参与的氧化还原过程，在此过程中多环芳烃作为电子供体。微生物氧化多环芳烃产生电子，经电子传递链传递给电子受体，并且释放能量供微生物生长代谢。利用生物电化学系统，以电极作为用之不竭的电子受体，以强化微生物氧化降解多环芳烃污染物；在电极上定向富集多环芳烃功能降解菌群，并形成致密的生物膜。因此，构建生物电化学系统，通过加速“污染物→微生物→电极”之间的电子产生及传输过程，进而加速微生物的对污染物降解的过程，富集得到的高效降解生物膜增加了环境污染物原位修复的菌种资源。

本发明的富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物的方法，包括以下步骤：

构建生物电化学反应器，生物电化学反应器中设有工作电极、辅助电极、参比电极，工作电极、辅助电极、参比电极连接上电化学工作站；

制备含多环芳烃的模拟废水，并在模拟废水中接入石油污染地的土壤，装入生物电化学反应器中，充分曝N

优选，制备含多环芳烃的模拟废水，并在模拟废水中接入石油污染地的土壤，充分曝N

优选，所述的含多环芳烃的模拟废水，每升的制备方法是：将11.4g十二水磷酸氢二钠、2.8g二水磷酸二氢钠、0.3g氯化铵、0.1g氯化钾、芘5mg、10mL微量元素和10mL维生素定容至1L。

本发明的有益效果是：

本发明公开了一种富集多环芳烃污染物降解微生物装置的设计及方法，将有利于多环芳烃污染场地的生物修复。通过本发明设计的多环芳烃污染物降解微生物富集装置及方法能加速多环芳烃污染介质的生物修复，减少了物化修复法带来的二次污染的环境风险，缩短了污染物降解周期。同时，富集得到的具有特定降解功能的生物膜不仅可以原位反复、持续发挥降解功能，而且可以将成熟的生物电极异位对多环芳烃污染场地修复进行调控。该技术易于操作，示范性强，便于在多环芳烃污染沉积物或水体中实施。

生物电化学方法富集PAHs高效降解菌有以下优点：(1)其原理和结构适合PAHs污染物降解功能菌的原位富集；(2)结合微生物和电化学两个过程，使PAHs污染环境修复的速度大大加快；(3)设备成本较低，并且能耗很低(只需施加微电压)；(4)富集得到的电活性生物膜可异位修复其他PAHs污染环境；(5)识别到的PAHs降解功能微生物有利于构建PAHs高效厌氧降解菌群。因此，该富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物装置及方法可以有效实现PAHs污染的定向转化，有望成为环境污染原位修复新技术。

附图说明

图1是本发明富集多环芳烃污染物厌氧降解微生物装置的结构示意图：该示意图仅表示本发明装置的一个示例，本发明的装置不仅限于图中表示的结构。1、电化学工作站；2、辅助电极；3、参比电极；4、工作电极；5、生物膜。

图2是芘污染体系中驯化的生物膜产生的生物电流情况；

图3是：(a)是对比例1与对比例2中污染物芘的自然厌氧降解情况与无菌条件下污染物芘的电化学降解情况；(b)是实施例1中污染物芘在富集生物膜后的降解情况。

图4是实施例1与实施例2生物膜的微生物群落组成情况；(a)、富集的生物膜在门水平上的生物群落组成情况；(b)、富集的生物膜在属水平上的生物群落组成情况；

具体实施方式：

以下通过具体的实施案例对本发明的内容作进一步详细说明。

1、多环芳烃污染环境介质准备：以山东某石油污染场地土壤为例。在污染场地采取土壤样品，采样深度为0-20cm深度的土层。土壤于4℃保存，运输至实验室，室温风干7天，研磨后，筛分至粒径2mm进行均质。一部分土壤样品保存至-80℃冰箱，用于后续DNA提取及微生物测序，其余样品用于多环芳烃降解测试及降解功能微生物富集实验。

2、制备多环芳烃模拟废水：分别将11.4g十二水磷酸氢二钠、2.8g二水磷酸二氢钠、0.3g氯化铵、0.1g氯化钾、10mL微量元素和10mL维生素定容至1L容量瓶中。以芘作为多环芳烃模拟污染物，将芘加入上述培养基中，使芘终浓度为5mg/L，该污染介质即为芘污染模拟废水。

3、预富集多环芳烃厌氧降解菌群：将2g石油污染场地土壤接种至装有200mL模拟废水的西林瓶中，充分曝N

实施例1：

1)生物电化学反应器的设计：

如图1所示，采用单室三电极体系生物电化学系统：采用容积为120mL的玻璃蓝盖瓶容器，加入总体积约100mL的含预富集降解菌的模拟废水。以石墨板(1.5cm×2cm)作为工作电极4，钛丝作为辅助电极2，饱和甘汞电极(Saturated calomel electrode,SCE)作为参比电极3，连于多通道电化学工作站1上，电压设置+200mV vs.SCE。

2)多环芳烃污染物及生物膜驯化：

多环芳烃污染物选用石油烃污染土壤中常被检测到的芘做测试。在接种预富集的菌液后，向模拟废水中加入

实施例2：

1)生物电化学反应器的设计：

采用单室三电极体系生物电化学系统：采用容积为120mL的玻璃蓝盖瓶容器，加入总体积约100mL的含预富集降解菌的模拟废水。以石墨板(1.5cm×2cm)作为工作电极，钛丝作为辅助电极，饱和甘汞电极(Saturated calomel electrode,SCE)作为参比电极，连于多通道电化学工作站上，电压设置+200mV vs.SCE。

2)多环芳烃污染物及生物膜驯化：

多环芳烃污染物选用石油烃污染土壤中常被检测到的芘做测试。在接种预富集的菌液后，向模拟废水中加入

对比例1：

模拟废水中添加

对比例2：

将灭菌的模拟废水中添加

芘降解效果：

实施例1和对比例1的芘降解情况

从结果可知(图2)，在实施例1中的生物电化学体系中，在含5mg/L芘污染的废水中驯化的生物膜具有稳定的生物电流，最高电流约2.5mA。图3显示，初始浓度5mg/L的芘在自然厌氧条件下(对比例1)的降解速率为0.07±0.02mg·L

实施例1和对比例2的芘降解情况

图3显示，初始浓度5mg/L的芘在无菌的电化学体系中(对比例2)的降解速率与芘自然厌氧降解速率相当，为0.06±0.03mg·L

实施例1和实施例2的功能微生物富集情况

图4为在生物电化学体系中驯化和富集生物膜过程中，添加

通过对不同分层DNA进行分析，识别到四种芘降解功能菌：Acinetobacter、Sericytochromatia、Flavobacterium和Peptococcaceae，它们在13C_处理的重层(浮力密度＞1.765g·mL

从以上实施案例可以看出，本发明中设计的多环芳烃厌氧降解微生物富集装置及方法，能够强化多环芳烃(芘)的厌氧降解速率，且能短时间实现污染介质(废水)污染物的零排放。该设计能定向驯化多环芳烃(芘)降解生物膜，特别是富集高效降解多环芳烃的功能微生物。驯化形成的生物膜能重复利用，持续降解多环芳烃污染废水，且能保持输出的最高生物电流及污染物降解速率一致。这些结果表明本发明设计的多环芳烃降解微生物富集装置能通过驯化具有降解功能的生物膜和富集降解功能微生物，快速提高多环芳烃的降解，缩短降解周期同时降低环境风险和节约成本。