一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及多糖提取技术领域，具体的说涉及一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种严重威胁老年人生命健康的中枢神经退行性疾病，发病隐匿，诊断困难，致病致死率高。β淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结是AD最主要的病理学特征，但其发病机制复杂，许多方面仍有待深入研究。目前，临床上用于治疗AD的药物主要包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA(N-methyl-D-aspartic acid receptor)受体阻断剂，能在一定程度上阻断AD的进程，但需要长期服药，并且具有恶心、呕吐、腹泻等不良反应。因此，探寻安全有效的防治AD的药物具有重要意义。传统中医将AD归“痴呆”“健忘”“呆病”一属，其病位在脑，但与心肝脾肾功能失调密切相关，是由肾精不足，脑髓空虚而引起的神志病。因此，中医常选用具有补肾益精功能的中药材治疗痴呆。

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的干燥根和根茎或茎，其味辛、微苦、性温，归脾、肾、心经，具有益气健脾、补肾安神的功效，常用于治疗脾肺气虚、肺肾两虚、心脾不足等症状，发展前景广阔。工业生产中常采用75％乙醇提取刺五加苷，而多糖等其他大分子有效成分仍留在废渣、废液中，未得到有效利用。多糖是刺五加药渣中的主要活性成分之一，具有保护中枢神经系统、抗衰老、增强机体免疫力等多种药理活性。目前，传统的刺五加多糖的提取方法多以刺五加药材为原料，采用水提醇沉法进行提取，具有耗时长、溶剂消耗量大、提取率低、资源浪费等缺点。

动态高压微射流技术是一种新型预处理破壁、高压均质技术，通过瞬时高速碰撞、强烈剪切、瞬间压力释放等作用使植物细胞壁破裂，促进有效成分溶出，提高传质速率，进而提高提取率，已被广泛应用于植物活性多糖的提取领域。表面活性剂是一种新型溶剂，具有绿色安全、易降解、无毒副作用等优点，在天然活性物质提取方面具有巨大潜力。但是，将动态高压微射流协同表面活性剂的方法应用于刺五加药渣多糖的提取未见报道。

因此，如何促进刺五加资源最大化利用，提供一种提取率及纯度高，又同时降低秀丽线虫Aβ沉积的刺五加药渣多糖及其制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)取刺五加药渣将其烘干后粉碎，然后加入水，搅拌均匀后，进行动态高压微射流均质处理；

(2)取处理后的料液，加入表面活性剂进行超声提取，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液进行离心后取上清液，减压浓缩，得到浓缩液；

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇进行醇沉；

(5)将醇溶液离心，取沉淀复溶，减压浓缩，冷冻干燥，得刺五加药渣多糖APSP-50；

(6)将刺五加药渣多糖ASPS-50经DEAE-650M填料分离纯化得ASPS-50-Ⅰ、ASPS-50-Ⅱ和ASPS-50-Ⅲ。

进一步，步骤(1)中所述烘干温度为45～50℃，烘干时间2～2.5h；

所述粉碎粒度为90～110目；

更进一步，步骤(1)中所述刺五加药渣与水的质量比为1:20～40；

所述搅拌转速为300～500r/min，搅拌时间3-5min；

所述微射流均质压力为120～160MPa，时间60～90s，微射流均质处理2～3次。

进一步，步骤(2)中所述表面活性剂类型为十二烷基磺酸钠；

所述表面活性剂用量为处理后的料液质量的2～3％；

更进一步，步骤(2)中所述超声提取功率为500～700W，提取温度为60～90℃，提取时间30～50min。

进一步，步骤(3)中所述离心转速为4500～5000r·min

进一步，步骤(4)中所述醇沉温度为4℃，醇沉时间为48h；

所述无水乙醇的加入量为加入无水乙醇后溶液中乙醇体积浓度为50％。

进一步步骤(3)和步骤(5)中所述超声减压均为在压力12KPa，温度50℃，转速30r/min下进行。

进一步步骤(5)中所述冷冻干燥为在压力13Pa，温度-40℃下冷冻干燥24h。

进一步，步骤(5)中所述离心转速为4500～5000r·min

本发明还提供了一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖，其采用上述方法制备得到。

本发明的有益效果在于：本发明首次以刺五加药渣为原料，对其化学成分和药理作用进行深入研究。本发明提供的刺五加药渣多糖首次采用动态高压微射流协同表面活性剂进行提取，该方法具有操作方便、省时高效和无污染等优点，而且本发明刺五加药渣多糖具有降低秀丽线虫Aβ沉积的作用。

本发明采用刺五加药渣为原料，对刺五加药渣中的活性成分进行资源回收和二次利用，促进刺五加产业的可持续发展。本发明公开的制备方法具有操作方便、省时高效和无污染等优点。本发明制备的刺五加药渣多糖具有降低秀丽线虫Aβ沉积的功效。

本发明还提供了上述刺五加药渣多糖在在降低秀丽线虫Aβ沉积中的应用。本发明采用秀丽线虫Aβ模型——CL4176转基因线虫株，应用本发明制备的ASPS-50给药，结果表明，本发明的ASPS-50能够抗线虫瘫痪、延长线虫寿命、减轻热应激损伤，提高线虫运动能力而刺五加药渣多糖在此方面相关报道较少，说明刺五加药渣多糖在降低秀丽线虫Aβ沉积方面具有明显前景。

本发明中采用的CL4176转基因线虫株购买自CGC(Caenorhabditis GeneticsCenter)，本发明中的内容不涉及生物保藏内容。

附图说明

图1为本发明制备的ASPS-50-Ⅰ、ASPS-50-Ⅱ和ASPS-50-Ⅲ的HPGPC图谱；

图2为本发明ASPS-50不同浓度对CL4176转基因线虫株瘫痪的影响；

图3为本发明ASPS-50不同浓度对CL4176转基因线虫株寿命的影响；

图4为本发明ASPS-50不同浓度对CL4176转基因线虫株热应激能力的影响；

图5为本发明ASPS-50不同浓度对CL4176转基因线虫株运动能力的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，刺五加药渣与水的质量比为1:30，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，微射流均质压力为140MPa，时间60s，微射流均质处理3次；

(2)取处理后的料液，加入2.5％的十二烷基磺酸钠，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

所得ASPS-50提取率为8.25％、糖含量为72.54％。

为了进一步证明本发明的技术效果，本发明分别针刺五加药渣与去离子水比例、微射流压力，微射流次数，表面活性剂种类以及表面活性剂用量进行优选，具体内容如下：

试验例1

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，设置三个平行方案，刺五加药渣与水的质量比分别为1:20、1:30、1:40，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，微射流均质压力为120MPa，时间60s，微射流均质处理3次；

(2)取处理后的料液，加入2.5％的十二烷基磺酸钠，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

根据刺五加药渣与去离子水料液比不同进行优化，所得刺五加多糖1提取率为5.32％、糖含量为49.43％；刺五加多糖2提取率为6.88％、糖含量为57.4％；刺五加多糖3提取率为提取率为6.13％、糖含量为53.67％。因此，优选刺五加药渣与去离子水的料液比为1:30。

试验例2

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，刺五加药渣与水的质量比为1:30，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，设置三个平行方案微射流均质压力为分别为120、140、160MPa，时间60s，微射流均质处理3次；

(2)取处理后的料液，加入2.5％的十二烷基磺酸钠，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

根据微射流压力不同，进行优化，所得刺五加多糖4提取率为7.16％、糖含量为62.48％；刺五加多糖5提取率为7.83％、糖含量为70.41％；刺五加多糖6提取率为6.89％、糖含量为58.72％。因此，优选微射流压力为140MPa进行制备。

试验例3

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，刺五加药渣与水的质量比为1:30，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，微射流均质压力为140MPa，时间60s，设置三个平行方案微射流均质处理次数为2、3、4次；

(2)取处理后的料液，加入2.5％的十二烷基磺酸钠，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

根据微射流处理次数不同进行优化，所得刺五加多糖7提取率为7.41％、糖含量为65.87％；刺五加多糖8提取率为8.17％、糖含量为71.95％；刺五加多糖9提取率为7.95％、糖含量为70.93％。因此，优选微射流处理次数为3次进行制备。

试验例4

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，刺五加药渣与水的质量比为1:30，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，微射流均质压力为140MPa，时间60s，微射流均质处理3次；

(2)取处理后的料液，加入2.5％的表面活性剂，设置3个平行方案表面活性剂分别为吐温80、十二烷基磺酸钠和蔗糖酯，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

根据表面活性剂种类不同进行优化，所得刺五加多糖10提取率为7.34％、糖含量为63.77％；刺五加多糖11提取率为8.23％、糖含量为72.34％；刺五加多糖12提取率为7.51％、糖含量为64.23％。因此，优选表面活性剂为十二烷基磺酸钠进行制备。

试验例5

一种降低秀丽线虫aβ沉积的刺五加药渣多糖

(1)取刺五加药渣500g将其50℃烘干2h后粉碎至100目，然后加入水，刺五加药渣与水的质量比为1:30，400r/min搅拌4min后，进行动态高压微射流均质处理，微射流均质压力为140MPa，时间60s，微射流均质处理3次；

(2)取处理后的料液，设置三个平行方案分别加入2.0、2.5、3.0％的十二烷基磺酸钠，500W、60℃下超声提取30min，得到多糖提取液；

(3)将所得多糖提取液5000r·min

(4)向所述浓缩液中加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，4℃醇沉48h；

(5)将醇溶液5000r·min

根据表面活性剂用量不同进行优化，所得刺五加多糖13提取率为7.78％、糖含量为68.35％；刺五加多糖14提取率为8.25％、糖含量为72.54％；刺五加多糖15提取率为7.62％、糖含量为66.97％。因此，优选表面活性剂用量为2.5％进行制备。

对比例1：

按照实施例1的方法制备刺五加药渣多糖，区别在于提取前未经过动态高压微射流处理，其他步骤同实施例1，制备刺五加药渣多糖(ASPS-50-A)。

对比例2：

按照实施例1的方法制备刺五加药渣多糖，区别在于进行提取过程中未加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠)，其他步骤同实施例1，制备刺五加药渣多糖(ASPS-50-B)。

对比例3：

按照实施例1的方法制备刺五加药渣多糖，区别在于分别采用传统水提和超声提取，其他步骤同实施例1，制备刺五加药渣多糖(ASPS-50-C和ASPS-50-D)。

采用苯酚-硫酸法测定各对比例中刺五加药渣多糖含量，并计算多糖提取率。各刺五加药渣多糖提取率及糖含量测定结果如表1所示。

结果表明，动态高压微射流技术能够通过多种作用使物料和溶剂充分混合，促进活性成分溶出，提高多糖得率。加入表面活性剂可以降低溶剂和物料之间的界面张力，使得溶剂更易于渗透植物细胞中，进一步增加刺五加药渣多糖的得率和多糖含量。相比于传统水提和超声提取，两者均能显著提高刺五加药渣多糖的提取率及多糖含量。采用动态高压微射流协同表面活性剂进行提取，可以结合两者的优势，优化提取效果，达到协同增效的目的。

实验例1

将预处理后的DEAE-650M填料采用湿法装柱，配制1mg·mL

所得ASPS-50相对分子量分布于1.6×10

实验例2

将CL4176品系线虫于16℃恒温培养，以大肠杆菌OP50为食。取实施例1制备的刺五加多糖，超纯水溶解成2mg·mL

瘫痪实验设空白组和经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组。将同期化后的CL4176虫卵，分别放置在空白组及各浓度给药组，每板30条，16℃培养24h，转板，继续于16℃培养12h，然后转移至25℃培养箱转温培养36h，之后，每隔2h在显微镜下观察一次，记录瘫痪线虫的数量(用挑针轻触线虫头部及身体数次，除头部外其他身体部位不动视为瘫痪)。结果显示，相比空白组，经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组均有一定的抗线虫瘫痪作用(P<0.05)，其中ASPS-50(0.5mg·mL

实验例3寿命实验

设空白组和经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组。将同期化后的CL4176虫卵，分别放置在空白组及各浓度给药组，每板30条，每3d记录线虫存活情况，直至全部死亡为止，用挑针轻触线虫头部和尾部，若30s内均无反应，则判定为死亡。结果显示，相比空白组，经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组均能在一定程度上延长线虫寿命(P<0.05)，其中ASPS-50(0.5mg·mL

实验例4热应激实验

设空白组和经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组。将同期化后的CL4176虫卵，分别放置在空白组及各浓度给药组，每板30条，在16℃培养箱中培养3d后升温至35℃，每隔1h观察线虫存活情况1次，直至线虫全部死亡。结果显示，相比空白组，经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组均能减弱线虫受到的热应激损伤作用(P<0.05)，其中ASPS-50(0.5mg·mL

实验例5运动能力测定实验

设空白组和经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组。将同期化后的CL4176虫卵，分别放置在空白组及各浓度给药组，每板10条，在16℃培养箱中培养，每隔2d换1次培养皿。待虫体长至10d，加入适量M9缓冲溶液，显微镜下检测30s内虫体做正弦运动的次数，确定CL4176线虫的运动能力变化。结果显示，相比空白组，经实施例1制备的刺五加药渣多糖低、中、高剂量组均能提高线虫的运动能力(P<0.05)，其中ASPS-50(0.5mg·mL

综上实验结果表明：本发明制备的刺五加药渣多糖提取率及糖含量高，并且不同浓度给药组均能一定程度上抗线虫瘫痪、延长线虫寿命、减轻热应激损伤，提高运动能力，降低秀丽线虫Aβ沉积。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。