一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置及方法

技术领域

本发明属于生物医学、医疗器械、医学成像技术等领域，具体来说，本发明提供了一种无化学染色、价格低廉、易操作、普适性强的折射率检测技术，建立了一种步骤简洁、易于计算的生物颗粒折射率鉴别装置及方法。

背景技术

生物颗粒在大气中遍布，与空气质量、大气污染等息息相关。在生物颗粒的折射率测量方面，传统的测量方法存在计算量较大，测量步骤冗杂等问题。

申请公布号为CN 110687022A的发明专利申请，公开了一种利用散射光的偏振差异测量颗粒折射率的方法及系统，该系统是利用静态光散射原理的激光粒度仪获得的散射光信号本身来求出样品的折射率，而激光粒度仪探测的依然是只包含极角θ的一维光散射信号，因此该发明仅能探测极角θ的散射信息，且散射角度θ的范围受限于所用的探测器个数，每个探测器对应于一个散射角度，仅适用于折射率相同的颗粒群的测量。

申请公布号为CN 104568857A的发明专利申请，公开了一种二维光散射静态细胞仪方法及装置，该装置虽然可以用于折射率的鉴别，但是由于其探测二维光散射的角度范围的缺陷，会造成装置的固有物理分辨率较低。

发明内容

本发明为了提高物理分辨率，提供了一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置及方法。该装置可以在单个细胞水平上实现高效、低成本和易操作的折射率检测，无损识别和分类生物颗粒，为获得生物颗粒内部信息提供更多可能性。

为实现上述目的，本发明的具体方案如下：

一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置，包括依次连接的激光器、激光能量调节元件、激光聚焦元件、光纤耦合组件、显微镜和图像处理系统；所述激光器用于提供激光光源，激光能量调节元件用于调整激光束的能量，激光聚焦元件用于汇聚调整过能量的激光，光纤耦合组件将汇聚的激光束耦合后进入显微镜系统，图像处理系统用于对显微镜系统中生物颗粒被激发光激发产生的二维光散射图像进行捕获、处理和分析。

其中，所述激光器产生波长532nm、光束直径1.2mm的50mW准直激光束。

所述激光能量调节元件为中性密度滤光片。

所述激光聚焦元件为透镜。所述透镜为数值孔径0.25的10倍物镜。

所述光纤耦合组件包括光纤和设置在光纤一端的光纤耦合器，若为了能调节光纤耦合器的位置，可在光纤耦合器上设置三维位移平台。所述光纤为直径50μm、数值孔径0.22的多模光纤。

所述显微镜的载物台上设置有液基芯片，待测生物颗粒位于液基芯片中，所述液基芯片包括两个载玻片和两个盖玻片，其中一个载玻片作为基片，两端各放置一个盖玻片作为垫片，另一个载玻片作为顶片，中间的空腔作为静态颗粒室，存放静态待测生物颗粒，颗粒浓度为2000～3000个/ml，尺寸为35×25×0.15mm。显微镜系统中的物镜为数值孔径0.4的20倍物镜。

所述图像处理系统包括CMOS探测器和计算机，其中CMOS探测器可以捕获二维光散射图像，计算机用于对捕获的图像进行处理和分析。

上述装置在使用时，首先配制浓度适当的待测生物颗粒样品，放置于显微镜的载物台上，启用显微镜照明系统，调节粗细调焦螺旋，确保视野中的待测物明亮清晰，关闭显微镜照明系统，启用激光器，激光器发出绿色准直光，通过激光能量调节元件调整入射激光束的能量，经过激光聚焦元件汇聚激光，激光束耦合经光纤耦合组件进入光纤一端，光纤另一端移动扫描载物台上均匀分布的单个待测生物颗粒，生物颗粒被激光激发产生二维光散射图样，此时调节显微镜细调焦螺旋，显微镜的物镜向Z轴正方向移动，在离焦200μm时图像处理系统捕获二维光散射图样，并对采集到的原始图像和光散射图样初步处理，旋转、剪裁，提取图像特征，最后将颗粒直径作为固定参数，折射率作为变量，根据Mie理论大量模拟散射图样，对模拟图样进行灰度扫描、傅里叶变换和线性拟合，可以获得模拟图样的典型主波峰特征频率值和折射率的关系表达式，将待测颗粒的典型主波峰特征频率值代入表达式，即可获得对应的折射率，进而区分不同种类的生物颗粒。

一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别方法，包括以下步骤：

第一步：调整待测液体浓度，制备浓度适当的待测生物颗粒混悬液，并将其置入显微镜的载物台；

第二步：激光光源经过激光能量调节元件调节后，经激光聚焦元件聚焦为激光束，然后经光纤耦合组件耦合进入光纤的一端；

第三步：打开显微镜的照明系统，调节粗细调焦螺旋，显微镜的物镜聚焦视野中的待测生物颗粒；

第四步：关闭显微镜的照明系统，移动光纤的另一端，保证垂直激发待测生物颗粒，在离焦200μm时图像处理系统捕获单个待测生物颗粒的二维光散射图像；

第五步：打开显微镜的照明系统，调节粗细调焦螺旋，显微镜的物镜再次聚焦视野中的待测生物颗粒，获得待测生物颗粒的原始显微图像；

第六步：处理与分析采集的待测生物颗粒的原始显微图像和二维光散射图像。

本发明的有益效果：

本发明提出一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置及方法，激光通过光纤扫描显微镜载物台中的待测颗粒，得到单个生物颗粒的二维光散射图像、已知待测颗粒的直径，通过提取二维光散射图像特征频率值可以得到颗粒的折射率，进而鉴别颗粒的种类，为单细胞水平的生物颗粒鉴别提供更多可能性。

本发明能够探测73°≤θ≤107°、

本发明的优点是相比于流式细胞仪所用颗粒无需化学染色、价格低廉、易操作，普适性强，建立了一种步骤简洁、易于计算的生物颗粒折射率鉴别装置，提供了一种计算单个生物颗粒折射率的新思路。

附图说明

图1为本发明的单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置结构示意图。

图2为液基芯片结构示意图。

图3为基于本发明装置获得的单个标准微球的原始显微图像，其中图(a)和(b)为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的原始图像，图(c)和(d)为6μm聚苯乙烯和氧化硅微球的原始图像。

图4为基于本发明装置获得的单个标准微球的二维光散射图样，其中图(a)和(b)为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的二维光散射图样，图(c)和(d)为6μm聚苯乙烯和氧化硅微球的二维光散射图样。

图5为基于Mie理论的单个微球的模拟二维散射图样，其中图(a)和(b)为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的Mie散射模拟图样，图(c)和(d)为6μm聚苯乙烯和氧化硅微球的Mie散射模拟图样。

图6是基于本发明装置所获标准微球二维光散射图样的灰度扫描图。

图7是基于本发明装置所获标准微球二维光散射图样的傅里叶变换曲线图。

图8是基于本发明装置的单个标准微球的折射率鉴别曲线。

图中，1、激光器，2、中性密度滤光片，3、10倍物镜，4、三维位移平台，5、光纤，6、显微镜照明系统，7、液基芯片，8、20倍物镜，9、图像处理系统。

图9是基于本发明装置获得的单个酵母细胞的原始显微图像、二维光散射图样，及对应的基于Mie理论的模拟二维散射图样，其中图(a1)为显微原图、图(a2)为基于本装置探测的实验二维光散射图样、图(a3)为模拟二维散射图样。

图10是基于本发明装置所获酵母细胞二维光散射图样的灰度扫描图。

图11是基于本发明装置所获酵母细胞二维光散射图样的傅里叶变换曲线图。

图12是基于本发明装置的单细胞水平酵母细胞的折射率鉴别曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例1

如图1所示，本实施例的一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别装置，包括依次连接的激光器1、激光能量调节元件、激光聚焦元件、光纤耦合组件、显微镜和图像处理系统9。

所述激光器1用于提供激光光源，激光能量调节元件用于调整激光束的能量，本实施例选用二极管半导体固体激光器，143.5mm×73.0mm×46.2mm，可发射波长532nm、50mW的绿色柱状光束，光束直径1.2mm，穿透力较强，符合大多数生物细胞实验要求，考虑到实验人员的安全和不同细胞种类，可使用中性密度滤光片2作为激光能量调节元件调整激光的功率。

所述激光聚焦元件用于汇聚调整过能量的激光，本实施例采用数值孔径0.25的10倍物镜3作为激光聚焦元件聚焦直径1.2mm原始激光束。

光纤耦合组件将汇聚的激光束耦合后进入显微镜系统，所述光纤耦合组件包括光纤5和设置在光纤一端的光纤耦合器，若为了能调节光纤耦合器的位置，可在光纤耦合器上设置三维位移平台4。所述光纤为直径50μm、数值孔径0.22的多模光纤，由石英纤芯，玻璃包层组成，激光束穿过直径50μm、数值孔径0.22的光纤，光纤的一端接收汇聚后的光束，另一端作为扫描光纤，插入含有单层待测颗粒静态细胞室，和激光器一起提供激光光源，保证被测颗粒被垂直激发。

所述显微镜的载物台上设置有液基芯片7，待测生物颗粒位于液基芯片中，所述液基芯片包括两个载玻片和两个盖玻片，其中一个载玻片作为基片，基片上方两端各放置一个盖玻片作为垫片，另一个载玻片作为顶片，中间的空腔作为静态颗粒室，存放静态、单层待测生物颗粒，颗粒浓度为2000～3000个/ml，尺寸为35×25×0.15mm。显微镜系统中的物镜为数值孔径0.4的20倍物镜8，通过调整显微镜系统物镜的焦距，观察被测颗粒的原始显微图像和二维光散射图样。

图像处理系统9用于对显微镜系统中生物颗粒被激发光激发产生的二维光散射图像进行捕获、处理和分析。图像处理系统包括CMOS探测器和计算机，CMOS探测器与计算机系统连接，CMOS探测器捕获两种图片：原始显微图像和二维光散射图样。CMOS探测器像素为1936×1460，尺寸为4.54μm，具有高分辨率和大观察视野，1：2500的动态范围，能以无损图像品质呈现细微的色差和丰富的细节信息。计算机系统用于进行图像处理与分析，首先对显微镜系统中的物镜与CMOS探测器采集到的原始图像和光散射图样初步处理，利用ImageJ将采集到的二维光散射图样旋转至水平方向，剪切掉图中多余的部分，只保留目标散射图样，对于生物颗粒原始显微图像，将对应生物颗粒剪裁为像素160×160，保证颗粒处于图像的中心位置。之后将生物颗粒直径作为固定参数，折射率作为变量，根据Mie理论大量模拟散射图样，得到一系列不同折射率的Mie散射模型图，逐一扫描Mie散射模型图中间行的灰度值，对灰度值进行快速傅里叶变换，得到每张图片的典型主波峰特征频率值，将所有图片的特征频率值线性拟合，得到特征频率值与折射率的关系曲线，即可依据单个被测生物颗粒光散射图样的特征频率值实现其折射率的快速鉴别。

上述装置在使用时，首先配制浓度适当的待测生物颗粒样品混悬液，将适量混悬液注入液基芯片7中并放置在显微镜载物台上，启用显微镜照明系统6，调节粗细调焦螺旋，确保视野中的待测颗粒聚焦清晰，关闭显微镜照明系统6，启用激光器1，二极管泵浦激光器发出绿色准直光，通过中性密度滤光片2调整入射激光束的能量，经过10倍物3镜汇聚激光，激光束耦合进入光纤探针，光纤探针移动扫描液基芯片7上均匀分布的单个待测生物颗粒，激光激发待测颗粒产生二维光散射图样，此时调节显微镜细调焦螺旋，显微镜的20倍物镜8向Z轴正方向移动，在离焦200μm时CMOS传感器捕获二维光散射图样，并传输至计算机端，由计算机系统对采集到的原始图像和光散射图样初步处理，旋转、剪裁，提取图像特征，最后将颗粒直径作为固定参数，折射率作为变量，根据Mie理论大量模拟散射图样，对模拟图样进行灰度扫描、傅里叶变换和线性拟合，可以获得模拟图样的典型主波峰特征频率值和折射率的关系表达式，将待测颗粒的典型主波峰特征频率值代入表达式，即可获得对应的折射率，进而区分不同种类的生物颗粒。

实施例2

一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别方法，具体步骤如下：

本实施例选择4μm和6μm的聚苯乙烯和氧化硅微球作为待测样品。

本实施例中能够探测的二维散射角度为：73°≤λ≤107°、

液基芯片和待测样品的准备：准备两个无菌载玻片(76.2mm×25.4mm×1.1mm)，两个无菌盖玻片(20mm×20mm×0.15mm)，其中一个载玻片作为基片，基片上方两端各放置一个盖玻片作为垫片，另一个载玻片作为顶片，如图2所示。为了减少微球成团，避免二维光散射图像重叠干扰，分别配置浓度适当的4μm和6μm聚苯乙烯和氧化硅微球待测混悬液，微球数约2000～3000个/ml，取200μl待测混悬液至基片上，盖上顶片，操作过程中注意避免气泡产生，影响实验效果。

打开激光器预热30min，激光束经过中性密度滤光片调整能量后，由数值孔径0.25的10倍物镜聚集，通过调整三维位移平台上光纤固定器的位置，确保激光耦合进光纤的一端，利用光纤钳去除光纤另一端的包层，再用光纤切割刀把光纤内芯切割平整，保证激光垂直激发单个被测微球，在空间中形成三维散射光，散射光经过显微镜系统的20倍物镜，此时调节显微镜细调焦螺旋，显微镜的物镜向Z轴正方向移动，在离焦200μm时，调节液基芯片的位置寻找目标散射图样，由CMOS探测器捕获并传输图像，所传输的图像大小为1936×1460像素；然后打开显微镜照明系统，调节显微镜细调焦螺旋至颗粒图像聚焦，由CMOS探测器捕获被测微球的明场显微图像。

图像处理系统中的计算机对显微镜物镜与CMOS探测器采集到的原始显微图像和光散射图样进行初步处理。对于4μm和6μm的聚苯乙烯和氧化硅微球原始显微图像，将其剪裁为像素160×160，保证微球处于图像的中心位置，如图3(a)和3(b)分别为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的明场显微图像，图3(c)和3(d)分别为6μm聚苯乙烯和氧化硅微球的明场显微图像。利用ImageJ软件将采集到的二维光散射图样旋转至水平方向，剪切掉图片中多余的部分，只保留目标散射图样，如图4(a)和4(b)分别为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的二维光散射图样，图4(c)和4(d)分别为6μm聚苯乙烯和氧化硅微球的二维光散射图样，散射范围为73°到107°。

接着将微球直径作为固定参数，折射率作为变量，待测颗粒假定为材质均匀的圆形小球，散射角度从73°到107°，周围介质折射率1.334，入射光波长532nm，小球直径为4μm，由于聚苯乙烯折射率为1.59，氧化硅折射率1.45，然后把折射率的范围控制在1.3～1.7，步长为0.1，进行散射理论模拟，得到一系列不同折射率的Mie散射模型图，如图5(a)和5(b)分别为4μm聚苯乙烯和氧化硅微球的模拟散射图样，图5(c)和5(d)分别为6μm聚苯乙烯和氧化硅模微球的模拟散射图样。经理论模拟散射图样和实验散射图样对比分析，验证了方法和装置的准确性。

对经过初步处理的二维光散射图像进行灰度扫描，如图6(a)为4μm聚苯乙烯和氧化硅的灰度曲线，图6(b)为6μm聚苯乙烯和氧化硅的灰度曲线，将其进行傅里叶变换后得到特征频率值，如图7(a)为4μm聚苯乙烯和氧化硅的频率-幅值图，其特征频率值分别为0.22017和0.16683，图7(b)为6μm聚苯乙烯和氧化硅的频率-幅值图，其特征频率值分别为0.28682和0.22161。

逐一扫描Mie散射模型图中间行的灰度值，对灰度值进行快速傅里叶变换，得到每张图片的典型主波峰特征频率值，将所有图片的特征频率值线性拟合，得到颗粒的特征频率值与折射率的关系曲线，即可依据单个被测微球光散射图样的特征频率值实现其折射率鉴别，如图8(a)为4μm聚苯乙烯和氧化硅的折射率鉴别曲线，图8(b)为6μm聚苯乙烯和氧化硅的折射率鉴别曲线。依据被测微球散射图样的特征频率值，经计算4μm聚苯乙烯的折射率为1.58，4μm氧化硅折射率为1.49，6μm聚苯乙烯的折射率为1.58，6μm氧化硅折射率为1.41，均与已知折射率高度接近。

实施例3

一种单细胞水平的生物颗粒折射率鉴别方法，具体步骤如下：

本实施例选择酵母细胞为待测样品，一般地，酵母细胞直径为3μm～6μm，理论折射率为1.42。

本实施例能够探测的二维散射角度为：73°≤θ≤107°、

样品制备：将适量活性干酵母颗粒放入适量纯水中，搅拌均匀，在室温下活化30min，将活化后的酵母溶液稀释至3000个/ml，以便于观察单个细胞的光散射。

图9(a1)是酵母细胞在20×明场视野中的原始图像，图9(a2)是其对应的二维光散射图样，呈现条纹状。

由于酵母细胞的大小与活化时间、温度有关，具有一定的变化范围，本实施选取固定大小的酵母模拟光散射。假定酵母细胞为材质均匀的圆形小球，散射角度从73°到107°，周围介质折射率1.334，入射光波长532nm，细胞直径为5.03μm，由于酵母细胞理论折射率为1.42，设定折射率范围为1.3-1.7，步长为0.1，进行散射理论模拟，得到一系列不同折射率的Mie散射模型图，如图9(a3)为折射率1.42、直径5.03μm的酵母细胞散射模拟图样。

逐一扫描41幅Mie散射模型图中间行的灰度值，对灰度值进行快速傅里叶变换，得到每个模拟图的典型主波峰特征频率值，将41个特征频率值与折射率线性拟合，得到颗粒的特征频率值与折射率的关系曲线，如图12所示。

图10为对应图9(a2)的中间行灰度曲线，图11为对应图9(a2)的中间行灰度的频率特征图，典型主波峰的特征频率值为0.09883，经计算直径5.03μm的酵母细胞折射率为1.46，这与理论值1.42相近，并保持在误差范围内。

综上，本发明建立了一种操作步骤简洁且易于计算的生物颗粒折射率鉴别装置，并提供了一种无化学染色、价格低廉、易操作、普适性强的单细胞水平折射率检测方法。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。