双佐剂重组新型冠状病毒疫苗（毕赤酵母）中CpG含量检测的方法

技术领域

本发明涉及CpG含量检测方法领域，特别是双佐剂重组新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)中CpG含量检测的方法。

背景技术

CpGISS1018是一种22聚体非甲基化的CpG-B类寡核苷酸，CpGISS1018可刺激B细胞和NK细胞活化。CpG-B定位于转铁蛋白受体1(TFR1)内体，并通过TLR9依赖性机制导致IFNɑ的产生，用可溶性CpG-B加抗原免疫，通过依赖于DC中TLR9介导的MyD88激活的机制，诱导激活NF-κB产生促炎性和Th1型的细胞因子。目前CpG是已被临床证明安全有效的新型佐剂。CpGISS1018是硫代磷酸骨架(PS)修饰，硫原子取代了磷酸酯骨架中的一个非桥接的氧原子，PS改造后可以抵抗核酸酶的降解，PS修饰更加疏水和稳定。

氢氧化铝佐剂以铝羟基形式存在的，是一种纤维状粒子，等电点一般在10.0-11.0左右，在中性pH的溶液中以带正电荷微米颗粒存在，可较好的吸附带负电荷的CpG以及带负电的抗原，氨基酸中存在着孤对电子，在溶液中加入金属离子，就有可能发生配位反应。因此，在测定CpG含量时，氢氧化铝与CpG的发生吸附反应，直接测定CpG含量时，会使检测量小于投入量，检测值偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供双佐剂重组新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)中CpG含量检测的方法，解决以上问题。

为达到以上目的，提供以下技术方案：

双佐剂重组新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)中CpG含量检测的方法，包括以下步骤：

S1：取新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。

S2：设置紫外可见分光光度计波长为260nm，以纯化水作为空白对照，测定标准曲线溶液、供试品溶液、稀释后的抗原的吸光值。

S3：以CpG标准溶液含量(μg/ml)对应吸光度值做标准曲线，求直线回归方程(Conc＝aX+b)，将测得供试品的吸光值带入直线回归方程。

优选地，所述CpG含量检测还包括专属性测试，保证在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在的情况下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力，具体步骤如下：

S1：精密量取供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。

S2：量取2mg/mlCpG对照品工作液40μl，置于5mlEP管中，加纯化水补至4ml，即含CpG为20μg/ml。

S3：配制抗原-氢氧化铝-山梨醇溶液(空白溶液)1ml，调制其与供试品中抗原、氢氧化铝、山梨醇含量一致，量取混合后的溶液50μl和4.95ml纯化水，混匀，共稀释100倍。

S4：将所述步骤S3中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量。

优选地，所述CpG含量检测还包括线性测试，测定在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力，具体步骤如下：

S1：量取2mg/mlCpG对照品工作液20μl、30μl、40μl、50μl、60μl，分别置于5mlEP管中，加纯化水补至4ml，即含CpG为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml。

S2：将所述步骤S1中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量。

优选地，所述CpG含量检测还包括重复性与中间精密度测试，测定在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性，在同一实验室内条件改变测定结果的精密度，称为中间精密度，具体步骤如下：

S1：取一批供试品，取供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清。摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。每个供试品做6个平行样品。

S2：将所述步骤S1中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，并测定6个供试品溶液的CpG含量相对标准偏差(RSD)值。

S3：将所述步骤S1中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，且由实验员A与实验员B分别测定每个供试品溶液的CpG含量RSD值。

优选地，所述CpG含量检测还包括准确性测试，测定用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，并用回收率(％)表示，具体步骤如下：

S1：配制CpG浓度为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml的试验苗，取供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍，每个供试品做3个平行样品。

S2：将所述步骤S1中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量。

优选地，所述CpG含量检测还包括耐用性测试，测试在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据，对煮沸时间和氢氧化钠溶液进行了变动，具体步骤如下：

S1：本步骤与权利要求1中步骤S1区别之处在于：煮沸时间改为14min与16min，氢氧化钠溶液浓度改为2.8％与3.2％。

S2：将所述步骤S1中的溶液采用所述权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量。

优选地，所述疫苗中成分含量为：1.5mg/剂氢氧化铝、1.0mg/剂CpG、10％/剂山梨醇、50μg/剂抗原。

本发明的有益效果为：

(1)成本低，节省试液，只用氢氧化钠；

(2)经处理后的供试品中不存在静电吸附和配位反应，准确测定CpG含量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

双佐剂重组新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)中CpG含量检测的方法，包括以下步骤：

S1：取新型冠状病毒疫苗(毕赤酵母)供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。

S2：设置紫外可见分光光度计波长为260nm，以纯化水作为空白对照，测定标准曲线溶液、供试品溶液、稀释后的抗原的吸光值。

S3：以CpG标准溶液含量(μg/ml)对应吸光度值做标准曲线，求直线回归方程(Conc＝aX+b)，将测得供试品的吸光值带入直线回归方程。

在一些实施例中，CpG含量检测还包括专属性测试，保证在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在的情况下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力，具体步骤如下：

S1：精密量取供试品1ml装入10mlEP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。

S2：量取2mg/mlCpG对照品工作液40μl，置于5mlEP管中，加纯化水补至4ml，即含CpG为20μg/ml。

S3：配制抗原-氢氧化铝-山梨醇溶液(空白溶液)1ml，调制其与供试品中抗原、氢氧化铝、山梨醇含量一致，量取混合后的溶液50μl和4.95ml纯化水，混匀，共稀释100倍。

S4：将步骤S3中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，实验结果如下表所示：

表1：专属性测试结果

在一些实施例中，CpG含量检测还包括线性测试，测定在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力，具体步骤如下：

S1：量取2mg/mlCpG对照品工作液20μl、30μl、40μl、50μl、60μl，分别置于5mlEP管中，加纯化水补至4ml，即含CpG为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml。

S2：将步骤S1中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，实验结果如下表所示：

表2：线性测试结果

在一些实施例中，CpG含量检测还包括重复性与中间精密度测试，测定在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性，在同一实验室内条件改变测定结果的精密度，称为中间精密度，具体步骤如下：

S1：取一批供试品，取供试品1ml装入10ml EP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清。摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10mlEP管中，加入4.9ml水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍。每个供试品做6个平行样品。

S2：将步骤S1中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，并测定6个供试品溶液的CpG含量相对标准偏差(RSD)值，实验结果如下表所示：

表3：重复性测试结果

S3：将步骤S1中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，且由实验员A与实验员B分别测定每个供试品溶液的CpG含量RSD值，实验结果如下表所示：

表4：中间精密度测试结果

在一些实施例中，CpG含量检测还包括准确性测试，测定用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，并用回收率(％)表示，具体步骤如下：

S1：配制CpG浓度为1mg/ml、2mg/m l、3mg/ml的试验苗，取供试品1ml装入10ml EP管中，加入3％氢氧化钠溶液1ml，确保密封完好后，经沸水浴15分钟加热至澄清，摇匀，精密量取混合后的溶液100μl装入10ml EP管中，加入4.9m l水，摇匀，作为供试品溶液，共稀释100倍，每个供试品做3个平行样品。

S2：将步骤S1中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，实验结果如下表所示：

表5：准确性测试结果

在一些实施例中，CpG含量检测还包括耐用性测试，测试在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据，对煮沸时间和氢氧化钠溶液进行了变动，具体步骤如下：

S1：本步骤与权利要求1中步骤S1区别之处在于：煮沸时间改为14mi n与16mi n，氢氧化钠溶液浓度改为2.8％与3.2％。

S2：将步骤S1中的溶液采用权利要求1中步骤S2-S3测定其CpG含量，实验结果如下表所示：

表6：耐用性测试结果

在一些实施例中，所述疫苗中成分含量为：1.5mg/剂氢氧化铝、1.0mg/剂CpG、10％/剂山梨醇、50μg/剂抗原。