一种来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及肿瘤生物学领域，尤其涉及一种来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株及其制备方法与应用。

背景技术

在中国，肺癌是发病率和死亡率最高的癌种，肺癌病例的发现以晚期居多，而晚期肺癌的5年生存期只有5-6%。肺癌的主要治疗手段有外科手术、靶向治疗、免疫治疗、放化疗等，其中外科手术仍然是肺癌治疗的主要手段。但很多患者往往在发现患肺癌时已是晚期甚至已经发生转移，失去了手术的机会。快速转移的晚期肿瘤患者被判死刑，研究者们针对这一类型的患者一直在探索有效的治疗手段，但缺乏高侵袭快速转移的原代研究模型。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于构建高侵袭高转移肺癌模型的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株及其制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株，命名为NSCLC-009T，保藏编号为GDMCC NO.63195。

可选地，所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株携带RET基因、TP53基因、ROS1基因突变。

可选地，所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株携带TP53 exon3:c.C98G:p.P33R和TP53 exon4:c.C215G:p.P72R突变，SDHA exon13:c.1701_1702del:p.T567fs缺失突变。

可选地，所述非小细胞肺癌为临床分期为IIA肺腺癌，且3个月内快速发展成V期并发生全身转移。

本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的制备方法，其中，包括步骤：

提供支持细胞和来源于人的非小细胞肺癌肿瘤组织；

将所述来源于人的非小细胞肺癌肿瘤组织进行胶原酶消化后，利用所述支持细胞进行培养，得到所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株。

本发明的第三方面，提供一种本发明如上所述的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株在构建高侵袭高转移肺癌模型中的应用。

可选地，所述高侵袭高转移肺癌模型用于临床药物靶点研究和药理机制研究。

有益效果：本发明提供的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株可用于构建高侵袭高转移肺癌模型，可用于治疗高侵袭高转移肺癌的临床药物的靶点研究和药理机制研究，对开发治疗高侵袭高转移肺癌的药物具有重要意义，具有较高的科研和生产应用价值，能够产生良好的科研、经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的形态图。

图2为本发明实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的外显子测序总体变异百分比。

图3为本发明实施例3中的细胞生长曲线图。

图4为本发明实施例4中的细胞侵袭实验结果图。

图5为本发明实施例5中的细胞黏附实验结果图。

具体实施方式

本发明提供一种来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明实施例提供一种来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株，分类命名人源肺癌细胞，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2023年2月24日，保藏编号为GDMCC NO.63195。

进一步地，通过外显子测序发现所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株携带RET基因、TP53基因、ROS1基因突变。其中，TP53突变可促进肿瘤细胞的增殖。具体地，所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株在TP53 exon3:c.C98G:p.P33R和TP53 exon4:c.C215G:p.P72R发生突变，在 SDHA exon13:c.1701_1702del:p.T567fs发生缺失突变。本实施例中来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的TP53基因在第3号外显子上第98位碱基由C突变成G，第4号外显子上第215位碱基由C突变成G，皆揭示了编码的蛋白序列中从脯氨酸突变成精氨酸。SDHA基因在第13号外显子上第1701-1702位碱基缺失突变，第567位苏氨酸发生移码突变。

进一步地，所述非小细胞肺癌为临床分期为早期（IIA）肺腺癌，且3个月内快速发展成晚期（V期）并发生全身转移。因此，所述细胞株属于高侵袭高转移细胞株，可用于构建高侵袭高转移肺癌模型。

本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的制备方法，其中，包括步骤：

S1、提供支持细胞和来源于人的非小细胞肺癌肿瘤组织；

S2、将所述来源于人的非小细胞肺癌肿瘤组织进行胶原酶消化后，利用所述支持细胞进行培养，得到所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株。

步骤S1中，在一些实施例中，所述支持细胞的制备方法包括步骤：

S11、提供含有胎牛血清（FBS）和青链霉素双抗的DMEM完全培养基；

S12、将小鼠成纤维细胞（3T3-J2细胞）加入到所述含有FBS和青链霉素双抗的DMEM完全培养基中，进行离心，去除上清；

S13、然后加入DMEM完全培养基轻柔吹打均匀，进行培养；

S14、细胞传代培养到拟合度达80-90%丰度后，加入含有丝裂霉素C（在DMEM完全培养基中的浓度为2-4 μg/mL）的DMEM完全培养基，使其成为非增殖细胞；

S15、去除含有丝裂霉素C的DMEM完全培养基，加入DMEM完全培养基进行培养，得到所述支持细胞。

步骤S2中，在一些实施例中，所述将所述非小细胞肺癌肿瘤组织进行胶原酶消化后，利用所述支持细胞进行培养，得到所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的步骤具体包括：

S21、取临床分期为早期（IIA）期并在3个月内迅速发展成晚期（V期）并发生全身转移的肺腺癌患者手术切除后的肿瘤组织，用含有青链霉素双抗的生理盐水冲洗；

S22、将所述冲洗后的肿瘤组织加入到胶原酶中并剪碎，置于37℃水浴锅中进行消化，然后加入含有FBS的PBS终止消化；

S23、将所述终止消耗后的肿瘤组织过筛后，离心去除上清，加入红细胞裂解液裂解5-10min，然后加入PBS终止红细胞裂解，离心，去除上清；

S24、加入肿瘤完全培养基轻柔吹打细胞，然后在37℃、5%CO

在一些实施例中，将所述原代肿瘤细胞（所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株）进行传代的步骤具体包括：

S31、将所述原代肿瘤细胞用PBS进行洗涤，去除PBS，然后加入 EDTA细胞消化液，置于37℃、5% CO

S32、加入胰酶，并置于37℃、5% CO

S33、以1：2或1：3传代于T75培养瓶中，传代后的细胞可用于进一步实验。

本发明实施例还提供一种本发明如上所述的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株在构建高侵袭高转移肺癌模型中的应用。快速转移的晚期肿瘤患者被判死刑，局限性是缺乏高侵袭性快速转移的研究模型，本发明选取短时间内（3个月内）从早期（IIA）快速发展成晚期（V期）并发生全身转移的患者样本，建成高侵袭性高转移性模型。本实施例中，细胞株来源于临床分期为早期肺腺癌患者的肿瘤组织，但此患者于术后3个月内出现全身转移，因此，所述细胞株属于高侵袭高转移细胞株，可用于构建高侵袭高转移肺癌模型。

在一些实施例中，所述高侵袭高转移肺癌模型用于临床药物靶点研究和药理机制研究。

下面通过具体的实施例进行详细说明。

实施例

来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备支持细胞

将3T3-J2细胞从液氮中取出来，放入37℃水浴锅中解冻，然后将解冻后的3T3-J2细胞加入到5mL含有10%FBS和1%青链霉素双抗的DMEM完全培养基中，以1000r/min的转速离心5min后，去上清，加入1mL DMEM完全培养基轻柔吹打均匀；

接着，将其加入到T25培养瓶中进行培养，细胞传代培养到拟合度达90%丰度后加入3mL含有丝裂霉素C（在DMEM完全培养基中的浓度为2μg/mL）的DMEM完全培养基作用2h，使其成为非增殖细胞（可作为支持细胞）；

去除含有丝裂霉素C的DMEM完全培养基，加入DMEM完全培养基进行培养，为下一步的原代肿瘤细胞培养作为支持细胞用。

（2）组织消化成为单个肿瘤细胞进行培养，得到所述来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株（原代肿瘤细胞）

从临床分期为早期（IIA）肺腺癌的患者手术切除后的肿瘤组织中取0.5cm

将1.0mL胶原酶（其制备方法为：用DPBS溶解终浓度为5mg/mL 胶原酶1和1mg/mL胶原酶IV消化酶，sigma）加入到2.0mL离心管中，将冲洗好的肿瘤组织加入到胶原酶中用剪刀剪碎并置于37℃水浴锅中进行消化25min；接着，消化好的肿瘤组织中加入含10%FBS的PBS终止消化；

将终止消化的肿瘤组织过70目细胞筛，用PBS冲洗细胞筛，搜集滤液和冲洗液并以1000r/min的转速离心5min去除上清，加入5mL红细胞裂解液裂解5min，加入10mL PBS终止红细胞裂解，以1000r/min的转速离心5min，去除上清，加入肿瘤完全培养基（购于深圳涌泰生物科技有效公司，型号为 YTB-TCBM-E102）轻柔吹打细胞，然后加入到含有上述支持细胞的T25培养瓶中，并置于37℃、5%CO

将实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株在倒置光学显微镜下观察细胞形态并拍照，结果如图1所示，可见细胞状态较好，呈立体状。

将实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株进行外显子测序，外显子测序总体变异百分比如图2所示，其中indel为插入缺失，外显子（exonic）突变占插入缺失的7.41%（数目为637），内含子（intronic）突变占插入缺失的67.34%，其他突变占插入缺失的23.25%；SNP是单核苷酸多态性（指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性），其中外显子（exonic）突变占33.33%（数目为22218），内含子（intronic）突变占36.66%，同义单核苷酸突变（synonymous_SNV）占17.2%，其他突变占12.81%。

实施例2 原代肿瘤细胞传代

将上述装有原代肿瘤细胞的T25培养瓶的培养基吸出，加入3mL PBS洗涤细胞，吸去PBS，加入3 mL EDTA细胞消化液后，置于37℃、5%CO

吸取细胞置于15mL离心管中以1000r/min的转速离心5min，去除上清；

细胞以1：2传代于T75培养瓶中。

实施例3 细胞生长曲线的测定

用含有0.25%EDTA胰酶将实施例1中得到的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株（原代肿瘤细胞）消化成单细胞悬液并计数；

按照每孔 1000 个细胞，铺入 96 孔板中，每组 6 孔；

每隔 24 小时加入 10μL CCK8 试剂，37℃孵育 1 小时后，使用酶标仪在λ=490nm的条件下测出每孔的OD值，连续检测 3 天，结果如图3所示。

实施例4 细胞侵袭实验

BD基质胶（Matrigel）提前一晚从-80℃取出放置于冰上并置于4℃冰箱中溶解；

提前在细胞培养小室（Transwell 小室，corning，8um）中铺入100μL浓度为50 μg/uL基质胶，放入37℃培养箱中，使其凝固（2小时以上）；

用含0.25%EDTA胰酶消化实施例1中的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株（原代肿瘤细胞）制成细胞悬液并计数，用无血清的细胞培养基重悬细胞，将1×10

将小室取出，弃掉培养基，用棉签将小室上部的基质胶及细胞擦净，小室上下各加入 500μL 4%多聚甲醛固定液，室温固定30分钟；

小室上下加入500μL结晶紫，染色15分钟，弃掉结晶紫，清水漂洗小室后垫支晾干；

使用刀片将小室的上室膜切下，使用盖玻片压片于载玻片上，显微镜下统计穿过基质胶的细胞数，得到细胞迁移率。同时，以正常的肺上皮细胞做对比，结果如图4所示，与正常的肺上皮细胞（N）对比，NSCLC-009T（原代肿瘤细胞）的迁移能力显著上调，说明NSCLC-009T具有高侵袭性。

实施例5 细胞粘附实验

BD基质胶（Matrigel）提前一晚从-80℃取出放置于冰上并置于4℃冰箱中溶解；以下步骤中使用的96孔板、枪头、Ep管、无血清培养基提前预冷；

将Matrigel胶与无血清培养基按1:100的比例加入到预冷的EP管中，用预冷的枪头吹打充分混匀，得到稀释后的Matrigel胶（5μg/μL）；

在96孔板中，每孔加入20μL稀释后的Matrigel胶，过夜，待胶凝固后，每孔加入200μL培养基（其中含有4.5×10

45min后加入200μL PBS冲洗，然后加入4%多聚甲醛固定液固定；

加入100μL结晶紫染色，用流水冲去后，室温风干；

细胞在200X显微镜下随机选择6个视野拍照进行细胞计数（此细胞为粘附在培养板孔中的细胞，其余细胞已被水冲走）；

对照组细胞数均一化处理，每个实验组细胞数除以对照组的平均数得到相对粘附率。结果如图5所示，与正常的肺上皮细胞（N）对比，NSCLC-009T（原代肿瘤细胞）的黏附能力明显上调，说明NSCLC-009T具有高转移能力。

综上所述，本发明提供的来源于人非小细胞肺癌的原代细胞株可用于构建高侵袭高转移肺癌模型，可用于治疗高侵袭高转移肺癌的临床药物的靶点研究和药理机制研究，对开发治疗高侵袭高转移肺癌的药物具有重要意义，具有较高的科研和生产应用价值，能够产生良好的科研、经济和社会效益。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。