红米种皮活性提取物在制备防治急性酒精性肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及红米种皮活性提取物在制备防治急性酒精性肝病药物中的应用。

背景技术

酒精性肝病(ALD)是由长期大量饮酒引起的疾病。可进展为酒精性肝炎和酒精性肝纤维化以及肝硬化。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，最后甚至为酒精性肝硬化和肝癌。酒精性肝病的发病机制尚不完全清楚，目前认为其发病机制主要与氧化应激和脂质过氧化、细胞因子和线粒体功能障碍有关，其中氧化应激在急性酒精性肝损伤的发生和发展中起关键作用。研究急性酒精肝损伤为理想的模型是动物急性肝损伤模型。目前，酒精性肝损伤的治疗尚不满意，临床上尚无有效的治疗药物。为了预防或治疗急性酒精性肝损伤进程，急待从天然产物中寻找得到一种安全有效预防或治疗急性酒精性肝损伤的药物。

稻米是人类主要食物来源之一。除淀粉外，稻米还含丰富多样的营养物质，包括蛋白质、维生素、膳食纤维、类黄酮等次生代谢物、不饱和脂肪酸、矿物质等。红米种皮活性成分具有“天然、营养、多功能”的特点，而且对人体的多种疾病还具有治疗、预防等药理作用和保健功能。据报道，红米种皮富含花青素等色素、三萜类、芳香油类、黄酮类等成分，其提取物具有抗氧化、抗疲劳和抗病毒活性，并且红米种皮活性提取物安全没有致突变作用。但目前国内外关于红米种皮活性提取物对急性酒精肝损伤预防作用的研究未见有专利文献报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了红米种皮活性提取物在医药方面的新用途，将红米种皮活性提取物应用在制备预防和/或治疗急性酒精性肝损伤的新药物中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的在于提供红米种皮活性提取物在制备防治急性酒精性肝损伤药物中的应用，所述药物为恢复小鼠体重，减轻酒醉行为；提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成；缓解肝脏组织炎性细胞浸润和渗出造成的病理损伤，改善肝脏指数和肝脏功能的药物。

进一步地，所述红米种皮活性提取物为氨基酸及其衍生物、萜类、木脂素和香豆素、有机酸、醌类、苯及其衍生物、核苷酸及其衍生物、鞣质、生物碱、脂质、酚酸类和黄酮类；所述氨基酸及其衍生物为209个、所述生物碱为173个、所述脂质为198个、所述酚酸类为271个、所述黄酮类为323个、所述萜类为92个、所述木脂素和香豆素为63个、所述有机酸为121个、所述醌类为16个、所述苯及其衍生物为8个、所述核苷酸及其衍生物为66个、所述鞣质为5个。

在本发明中，所述红米种皮活性提取物在防治急性酒精性肝损伤的药物中的浓度优选为每天每只200mg/kg～600mg/kg。本发明对药物的剂型、药物的辅料和药物的制备方法无特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。本发明预防和/或治疗急性酒精性肝损伤的新药物是以红米种皮提取物为活性成分，用于制备防治急性酒精性肝损伤的药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，或者与其他活性成分复配发挥协同抗急性酒精性肝损伤的作用。

本发明对红米种皮活性提取物防治急性酒精性肝损伤进行了系列研究。证实了红米种皮活性提取物可以显著恢复小鼠体重，减轻酒醉行为；可以显著提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成；可以有效缓解肝脏组织炎性细胞浸润和渗出造成的病理损伤，改善肝脏指数和肝脏功能；总体来说有效的改善了乙醇诱导的急性酒精肝损伤模型小鼠的肝脏损伤并提高其肝脏功能，对于预防或治疗急性酒精肝损伤的效果与空白对照组几乎相当。本发明提供的红米种皮活性提取物对防治急性酒精肝损伤有显著的作用，且红米作物分布广泛，安全性高，价格低廉，原料易得；红米种皮活性提取物在制备防治急性酒精肝损伤药物中拥有良好的开发应用前景。

综上所述，相比于现有技术，本发明的优点在于：

1、本发明为红米种皮活性提取物发掘了新的医疗用途。

2、本发明通过实验发现红米种皮活性提取物在较低剂量下均可以有效的恢复小鼠体重，减轻酒醉行为；提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成；缓解肝脏组织炎性细胞浸润和渗出造成的病理损伤，改善肝脏指数和肝脏功能；本发明的原料来自于天然产物采集方便，安全性高。

3、本发明红米种皮活性提取物提取工艺简单，成本低廉，适于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的红米种皮活性提取物的液质检测结果图；

图2为本发明红米种皮活性提取物对模型小鼠体重影响的曲线图；

图3为本发明红米种皮活性提取物对模型小鼠姿势反射影响的柱状图；

图4为本发明红米种皮活性提取物对模型小鼠肝脏指数影响的柱状图；

图5为本发明红米种皮活性提取物对模型小鼠肝功影响的柱状图；

图6为本发明红米种皮活性提取物对模型小鼠肝脏组织中氧化应激相关指标影响的柱状图；

图7为本发明小鼠肝脏组织病理切片的HE染色图。

具体实施方式

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1

本实施例的红米种皮活性成分提取物的制备：

红米购自云南普洱，将红米进行粉碎，过80目筛，得到红米粉末。称取75g红米粉，加入1200mL提取剂(0.5％柠檬酸和70％乙醇的混合溶液体积比为3：17)，红米粉末与提取剂的质量体积比为1g:16mL，充分混合后在53℃、135W功率条件下超声30～35min，提取2～3次，合并提取液后离心，以4500r/min的转速离心10min，收集上清液，然后抽滤，再旋转蒸发进行浓缩，旋蒸提取液，回收提取剂直至获得水相；将所述水相继续旋蒸浓缩得到浓缩液；浓缩液在-20℃冰箱预冻，再用冻干机冻干，即得到红米种皮活性成分(冻干粉)。

通过UPLC-MS/MS技术对红米种皮活性成分提取物的主要化学成分进行了定性分析，分析结果见图1所示。

由图1可知，红米种皮活性成分富含氨基酸及其衍生物、萜类、木脂素和香豆素、生物碱、脂质、酚酸类和黄酮类等。所述氨基酸及其衍生物为209个、所述生物碱为173个、所述脂质为198个、所述酚酸类为271个、所述黄酮类为323个、所述萜类为92个、所述木脂素和香豆素为63个、所述有机酸为121个、所述醌类为16个、所述苯及其衍生物为8个、所述核苷酸及其衍生物为66个、所述鞣质为5个。

本发明提供了红米种皮活性提取物在制备急性酒精肝损伤药物中的应用。

本发明还提供了红米种皮活性取物在制备恢复体重，减轻酒醉行为药物中的应用。

本发明还提供了红米种皮活性提取物在制备提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成药物中的应用。

本发明还提供了红米种皮活性提取物在制备缓解肝脏组织炎性细胞浸润和渗出造成的病理损伤，改善肝脏指数和肝脏功能药物中的应用。

实施例2

本实施例为红米种皮活性提取物对防治急性酒精肝损伤的活性评价：

2.1急性酒精肝损伤小鼠模型的建立及实验过程

以C57BL/6J雄性小鼠(8周龄，重量20g左右)为研究对象，每组10只小鼠。采用灌胃的方法经口1次给予小鼠45％(v/v)乙醇,灌胃量为10mL/kg·BW(折合乙醇的剂量为剂量为4.48g/kg·d)，连续14天，构建小鼠急性肝脏损伤模型。在最终给药后4小时，所有小鼠通过灌胃接受60％乙醇，除了正常组和阴性对照组给予等量的蒸馏水。记录了乙醇引起的翻正反射时间的损失和恢复。通过灌胃实施例1得到的红米种皮活性成分(冻干粉)来评价其对乙醇诱导的急性酒精肝损伤模型小鼠的防治效果；小鼠购买以后在标准环境下适应7天，小鼠按照标准饲料进行饲养。具体实验流程及分组如下：

空白对照组：连续14天灌胃给予等体积蒸馏水，并自由饮用蒸馏水；

阴性对照组：连续14天灌胃给予等体积溶解红米种皮活性成分的溶剂(10％DMSO+40％PEG300+5％Tween-80+45％Sal ine)，并自由饮用蒸馏水；

模型组：连续14天灌胃给予等体积45％(v/v)乙醇，在最终给药后4小时，所有小鼠通过灌胃接受等体积60％乙醇；

红米种皮活性成分低剂量组：连续21天灌胃给予每只小鼠每天200mg/kg红米种皮活性成分，并从第8天开始连续14天灌胃给予等体积45％(v/v)乙醇，在最终给药后4小时，所有小鼠通过灌胃接受等体积60％乙醇；

红米种皮活性成分高剂量组：连续21天灌胃给予每只小鼠每天600mg/kg红米种皮活性成分，并从第8天开始连续14天灌胃给予等体积45％(v/v)乙醇，在最终给药后4小时，所有小鼠通过灌胃接受等体积60％乙醇；

阳性对照组：连续21天灌胃给予每只小鼠每天50mg/kg红米种皮活性成分，并从第8天开始连续14天灌胃给予等体积45％(v/v)乙醇，在最终给药后4小时，所有小鼠通过灌胃接受等体积60％乙醇。

2.2检测红米种皮活性提取物对小鼠急性酒精肝损伤模型小鼠体重、姿势反射、肝脏指数的影响：

2.2.1实验中每天记录各组小鼠的体重，造模结束后取各组小鼠，将小鼠平放在平坦的表面上，并有时间自己纠正(最多30秒)。酒醉状态判定标准：酒后小鼠背部朝下，四肢朝上观察翻正反射是否消失，消失且持续30秒可判定为醉酒状态。醒酒状态判定：小鼠进入醉酒状态后，观察期翻正反射是否恢复，翻身时间短于30秒即可判定为醒酒状态。

解剖小鼠，取出肝脏组织进行称量获得肝脏指数。

2.2.2实验结果：

小鼠体重变化，可以反映小鼠的生长发育情况。通过分析小鼠体重变化，可以评价红米种皮提取物对急性酒精肝损伤小鼠生长发育的影响。翻正反射的时间长短可以反应小鼠酒醉状态。翻正反射丧失的越晚肝脏功能越好，翻正反射恢复的越早肝脏功能越好。肝脏指数也是反映肝脏损损伤情况，肝脏指数越大，表明机体肝脏发生肿大的情况越严重。

本发明通过对各处理小鼠体重变化、翻正反射的时间、肝脏指数来评价红米种皮活性提取物对急性酒精肝损伤模型小鼠的作用情况，结果见图2、图3、图4，其中图2表示小鼠体重的变化；图3表示小鼠翻正反射的情况；图4表示小鼠的肝脏指数。Control为空白对照组；NC为阴性对照组；Model为乙醇诱导模型组；RRAL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；RRAH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；SILY为阳性对照组(水飞蓟素50mg/kg)。

由图2可知，给红米种皮活性提取物的小鼠相比模型小鼠体重明显恢复和阳性药物组效果相似。

由图3可知，给红米种皮活性提取物的小鼠与模型组相比翻正反射丧失的晚，恢复的早，这说明了给红米种皮活性提取物小鼠与模型组相比明显减轻酒醉行为。

由图4可知，给红米种皮活性提取物的小鼠与模型组相比肝脏指数明显改善。

2.3检测活性成分对模型小鼠血浆肝功能指标的影响：

2.3.1取各组小鼠，用抗凝管眼球采血，4℃条件下3000rpm离心15min，取上清，用相应试剂盒检测各组小鼠血浆中AST、ALT表达情况。

2.3.2实验结果

AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)是反应肝损害的敏感指标，大多数情况下ALT和AST升高程度与肝细胞受损程度相一致，是目前最常用的肝功能检测指标，急性或慢性酒精给药会引起严重的肝脏氧化应激，这将通过多种机制导致细胞凋亡，包括过多的自由基等。

本发明通过用相应试剂盒检测各组小鼠血浆中ALT、AST的表达情况来检测红米种皮活性提取物对急性酒精肝损伤小鼠肝功的影响，效果见图5。其中图5为本发明小鼠肝功变化的情况，其中图5A表示小鼠血浆中ALT的含量；图5B表示小鼠血浆中AST的含量；Control为空白对照组；NC为阴性对照组；Model为乙醇诱导模型组；RRAL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；RRAH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；SILY为阳性对照组(水飞蓟素50mg/kg)。

实验结果如图3所示。由图3可看出，红米种皮活性提取物显著抑制模型小鼠血浆中ALT、AST水平。说明红米种皮活性提取物能显著改善急性酒精肝损伤模型小鼠肝功能。

2.4检测活性成分对模型小鼠肝脏组织中氧化应激相关指标的表达量：

2.4.1取各组小鼠，无菌术取肝脏组织，用无菌预冷PBS冲洗后，取100mg肝脏组织加900μl无菌预冷PBS在4℃下匀浆，离心取上清液，用相应试剂盒检测各组小鼠肝脏组织中SOD、ROS表达情况。

2.4.2实验结果

SOD是超氧化物歧化酶，属于金属蛋白酶，SOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是机体进行正常有氧代谢的产物，是由氧组成，含氧并且性质活泼的一类物质的总称。ROS作为氧代谢的天然副产物，在机体内处于较低的水平，作为“氧化还原信使”参与细胞内的信号传递和调节，并且在细胞周期、基因表达和机体内环境稳态的维持中发挥着重要作用。然而，当机体受到刺激时，如紫外线、辐射、缺氧、热暴露等，ROS水平会急剧增加，超过机体本身的清除处理能力，机体氧化-抗氧化作用失衡，发生氧化应激，从而导致DNA损伤，脂质过氧化，蛋白结构和功能发生改变，细胞膜被破坏，最终引起机体细胞的死亡。此外，这些大分子物质的损伤还与癌症、衰老、炎症和多种人类疾病(神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病)等的发病机制有关。因此，ROS水平是细胞正常生理功能和环境因素导致的细胞氧化损伤的重要标志

本发明通过用相应试剂盒检测各组小鼠肝脏中SOD、ROS的表达情况来评估红米种皮活性提取物对急性酒精肝损伤小鼠的影响，效果见图6。其中图6A表示小鼠肝脏中SOD的表达量；图6B表示小鼠肝脏组织ROS表达量；Control为空白对照组；NC为阴性对照组；Model为乙醇诱导模型组；RRAL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；RRAH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；SILY为阳性对照组(水飞蓟素50mg/kg)。

由图6结果显示，红米种皮活性提取物使模型小鼠肝组织中SOD表达显著升高，ROS水平显著降低，说明红米种皮活性提取物能显著提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成。

2.5检测活性成分对模型小鼠肝脏组织病理损伤的影响：

2.5.1取各组小鼠，无菌术取肝脏组织，用无菌预冷PBS冲洗后固定制作石蜡切片，经HE染色后显微镜下观察组织结构变化情况。

石蜡切片的制备方法：

(1)取材：新鲜肝脏组织用10％的福尔马林溶液固定24小时以上。将肝脏组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；

(2)脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4小时，85％酒精2小时，90％酒精2小时，95％酒精1小时，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5-10min，二甲苯I 5-10min，二甲苯II 5-10min，65℃融化石蜡I1小时，65℃融化石蜡II1小时，65℃融化石蜡III 1小时；

(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；

(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm；切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

HE染色方法如下：

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗；

(2)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；

(3)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

(4)脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(5)显微镜镜检，图像采集分析。

2.5.2实验结果

本实验采用石蜡切片HE染色，对小鼠肝脏组织结构进行了观察，NC为阴性对照组；Model为乙醇诱导模型组；RRAL为低剂量灌胃组(200mg/kg)；RRAH为高剂量灌胃组(600mg/kg)；SILY为阳性对照组(水飞蓟素50mg/kg)，结果见图7。

由图7可知，红米种皮活性提取物能明显减轻模型小鼠肝脏炎性细胞浸润减少渗出，维持肝脏的肝小叶完整性。说明红米种皮活性提取物能明显改善模型小鼠肝脏病理损伤。

综上所述，红米种皮活性提取物可以显著恢复模型小鼠体重，减轻酒醉行为；显著提高肝脏组织抗氧化能力减少自由基生成；显著缓解肝脏组织炎性细胞浸润和渗出造成的病理损伤，明显改善肝脏指数和肝脏功能。本发明提供的红米种皮活性提取物对防治急性酒精肝损伤有显著的作用，且原料来自于天然产物，安全性高，成本低廉，适用于工业化生产和市场推广应用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。