一种鞘氨醇单胞菌、固定化菌剂及用途

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌、固定化菌剂及用途。

背景技术

吲哚乙酸(Indoleacetic acid，IAA)也称生长素，其既能作用于植物细胞分裂、伸长和分化过程，也参与种子萌发、根系发育以及营养生长过程，显著影响植物生长发育，是最常见的天然植物激素。IAA不仅可以由植物本身产生，还可以通过植物根际促生细菌(PGPR)释放，PGPR通过合成一些可以促进植物生长的激素物质(如IAA、赤霉素等)，使土壤中的矿物质转化成易被植物吸收利用的营养元素。PGPR还可以诱导植物代谢，激活植物对病原体的系统抗性，增强植物抵抗逆境胁迫的能力，从而促进植物生长发育。

近年来，随着微生物菌剂在植物生产中的应用日趋广泛，筛选具有产IAA高性能的菌株具有重要的研究价值。但是，目前已有报道的具有产IAA能力的菌株普遍存在两个问题：一是产IAA能力普遍较低，介于6～23mg/L范围之间，这样的菌株制备而成的微生物菌剂功能较弱，竞争优势不足；二是由于某些微生物功能的发挥具有明显的地域特点。因此筛选具有产IAA高性能的土著微生物更能适应当地的植物生产环境，更容易形成优势菌群。但是目前还未见东北地区的产IAA高性能菌株应用于植物生产的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对东北地区产IAA高性能菌株缺乏的问题，提供一株具有产IAA能力的鞘氨醇单胞菌。该菌株具有极强的产IAA能力，将其制备成微生物菌剂应用于植物生产中，可以改良土壤的理化性质，还可用于促进水稻种子发芽和水稻幼苗生长，有望成为作物生产中一种应用潜力巨大的微生物菌剂。

本发明提供的具体技术方案如下：

本发明第一方面，提供一种鞘氨醇单胞菌，所述鞘氨醇单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023777。

本发明第二方面，提供一种所述鞘氨醇单胞菌的发酵方法，包括以下步骤：将所述鞘氨醇单胞菌活化后接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，30～35℃、150～180r/min下发酵培养24～32h，得到发酵液。

本发明第三方面，提供一种根据上述方法发酵得到的发酵液。

本发明第四方面，提供一种生物炭产IAA产生长素的固定化菌剂，其是以生物炭为载体，负载所述鞘氨醇单胞菌制备而成。

优选地，该固定化菌剂具体是按照以下步骤制备得到：

将所述鞘氨醇单胞菌活化后得到的菌悬液接种至含有所述生物炭的牛肉膏蛋白胨培养基中进行培养，所得培养液离心，过滤，得到所述固定化菌剂。

优选地，所述生物炭在牛肉膏蛋白胨培养基中的添加量为1～3％；

所述生物炭是按照以下步骤制备得到：以稻壳或稻杆为原料，以10～15℃/min的速率升温至400℃～700℃，热解2～2.5h。

优选地，所述培养是在30～35℃、150～180rpm/min培养1～5d。

本发明第五方面，提供一种所述鞘氨醇单胞菌或所述发酵液或所述固定化菌剂在产IAA中的应用。

优选地，所述应用包括如下a～c任一项：

a、所述鞘氨醇单胞菌或所述发酵液或所述固定化菌剂用于土壤改良；

b、所述鞘氨醇单胞菌或所述发酵液或所述固定化菌剂用于促进水稻种子发芽；

c、所述鞘氨醇单胞菌或所述发酵液或所述固定化菌剂用于促进水稻生长。

本发明第六方面，提供一种微生物菌剂，其包括所述鞘氨醇单胞菌或所述发酵液或所述固定化菌剂，以及微生物学上可接受的辅料。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的鞘氨醇单胞菌，具有较佳的产IAA能力，且该鞘氨醇单胞菌专性好氧，具有较强的吸水性和代谢能力，作为微生物菌剂在调控植物生长和改良土壤方面具有巨大的应用潜力。

2、本发明将产IAA菌株MSp2302负载于生物炭上制备固定化菌剂，其活菌数量和产IAA浓度相较于MSp2302菌剂最高分别提高了18％和41.26％。

3、本发明以生物炭作为载体负载MSp2302菌株形成的固定化菌剂，对水稻土壤的全碳含量、全氮含量、有效磷含量、电导率、pH、微生物量碳及微生物量磷具有明显的调节作用，且效果比单独使用MSp2302菌剂或生物炭时显著提高。

4、本发明以生物炭作为载体负载MSp2302菌株形成的固定化菌剂，具有显著的促进水稻种子发芽的作用，其效果明显优于单独施用MSp2302菌剂。

5、本发明以生物炭作为载体负载MSp2302菌株形成的固定化菌剂，能显著促进水稻幼苗生长，作用效果明显优于单独施用MSp2302菌剂或者生物炭。

生物材料保藏信息：

鞘氨醇单胞菌，命名为鞘氨醇单胞菌MSp2302，拉丁名称：Sphingosinomonas，分类命名：鞘氨醇单胞菌，其于2023年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023777，保藏地址为：中国·武汉·武汉大学。

附图说明

图1是鞘氨醇单胞菌MSp2302菌落图；

图2是鞘氨醇单胞菌MSp2302革兰氏染色图；

图3是鞘氨醇单胞菌MSp2302生长曲线图；

图4是MSp2302菌剂、固定化菌剂的活菌数量对比图；a、400℃稻壳生物炭固定化菌剂，b、550℃稻壳生物炭固定化菌剂；

图5是MSp2302菌剂、固定化菌剂的活菌数量对比图；a、700℃稻壳生物炭固定化菌剂，b、400℃稻杆生物炭固定化菌剂；

图6是MSp2302菌剂、固定化菌剂的活菌数量对比图；a、550℃稻杆生物炭固定化菌剂，b、700℃稻杆生物炭固定化菌剂；

图7是MSp2302菌剂、固定化菌剂的产IAA对比图；a、400℃稻壳生物炭固定化菌剂，b、550℃稻壳生物炭固定化菌剂；

图8是MSp2302菌剂、固定化菌剂的产IAA对比图；a、700℃稻壳生物炭固定化菌剂，b、400℃稻杆生物炭固定化菌剂；

图9是MSp2302菌剂、固定化菌剂的产IAA对比图；a、550℃稻杆生物炭固定化菌剂，b、700℃稻杆生物炭固定化菌剂；

图10是MSp2302菌剂、固定化菌剂对水稻种子发芽影响的对比图；

图11是MSp2302菌剂、固定化菌剂对水稻种子胚根长影响的对比图；

图12是MSp2302菌剂、生物炭、固定化菌剂对水稻幼苗株高影响的对比图；a、稻壳生物炭固定化菌剂，b、稻杆生物炭固定化菌剂；

图13是MSp2302菌剂、生物炭、固定化菌剂对水稻幼苗地下根系鲜重和干重影响的对比图；a、稻壳生物炭固定化菌剂，b、稻杆生物炭固定化菌剂；

图14是MSp2302菌剂、生物炭、固定化菌剂对水稻幼苗地上部分鲜重和干重影响的对比图；a、稻壳生物炭固定化菌剂，b、稻杆生物炭固定化菌剂；

图15是MSp2302菌剂、生物炭、固定化菌剂对水稻幼苗茎粗和根长影响的对比图；a、稻壳生物炭固定化菌剂，b、稻杆生物炭固定化菌剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

菌株的筛选和鉴定

1、筛选样品来源

供试土壤于2021年5月取自沈阳农业大学水稻试验站，北纬41自沈阳农，东经122沈阳农业。土壤为0～20cm耕层土壤，将完整的水稻根际取出，抖落松散土壤，用刷子轻轻刷下并收集紧密附着于水稻根际上的剩余土壤，去除其中杂质，装入自封袋中置于4℃保存备用。

2、筛选过程中使用的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL，NaCl 10.0g，pH7.0～7.2。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，NaCl 10.0g，pH 7.0～7.2。

R

3、产IAA菌株的筛选与鉴定

3.1、初筛

取1g根际土样置于100mL锥形瓶中，加入99mL无菌水，180rpm/min震荡20～30min。采用梯度稀释法获得10

3.2、菌株产IAA定性检测复筛

将冻存管内菌剂解冻后加入R

3.3、菌株产IAA定量检测复筛

精确称取10mg IAA于100mL容量瓶中，首先加入少量95％乙醇将生长素溶解，然后用R

取纯化单菌落加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min活化24h制得菌悬液。将菌悬液以1％接种量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180rpm/min条件下恒温振荡培养24h后，取1mL发酵液加入到R

3.4、革兰氏染色鉴定

①挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上培养1d后的菌落于载玻片上固定；②草酸铵结晶紫染1min；③蒸馏水冲洗；④加碘液覆盖涂面染色约1min；⑤水洗，用吸水纸吸去水分；⑥滴加95％酒精，晃动均匀，脱色20s后清水冲洗，慢慢吸去水分；⑦蕃红染色液染色1min，蒸馏水冲洗；⑧干燥和镜检，观察细菌颜色及形态。

3.5、分子生物学鉴定

采用16SrDNA测序确定细菌种属，具体过程如下：

细菌基因组DNA提取→PCR扩增→凝胶电泳→纯化回收→测序结果分析(核糖体数据库中检测)。

其中，DNA采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取；

PCR反应体系：0.5μL基因组DNA 20～50ng·μL、2.5μL 10×Buffer，1.0μL dNTP、0.2μL Taq plus DNA聚合酶、0.5μL正向引物(10Μm)、0.5μL反向引物(10Μm)，以上试剂混合后加双蒸水定容至25μL；

其中，正向引物序列为：AGTTTGATCMTGGCTCAG，如SEQ ID NO:1所示；反向引物序列为：GGTTACCTTGTTACGACTT，如SEQ ID NO:2所示。PCR反应程序：94℃条件下先预变性4min，再变性40s，55℃条件下退火45s，72℃条件下延伸1min，以上步骤循环30次，而后在72℃条件下修复延伸10min，降温至4℃终止反应保存。扩增产物：1％琼脂糖电泳。核糖体数据库：http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp。

4、结果

4.1、产IAA菌株的确定

将土壤溶液涂布后的平板培养2d后分离纯化最终得到生长优势明显、菌落差异较大的33株单菌落，经Salkowski显色定性初步筛选出可能产IAA的菌株10株。

对10个菌株通过定量检测IAA产量进一步复筛，结果如表1所示。枯草芽孢杆菌(对照菌株)产IAA为21.99mg/L，试验初筛选出的10株菌除L-6外，其余菌株产IAA能力均显著高于对照菌株枯草芽孢杆菌。

表1 10株产IAA菌株与枯草芽孢杆菌产IAA能力的比较

注：表中数据后不同字母表示处理间存在显著差异(P＜0.05)

4.2、分子生物学鉴定

对上述10株菌进行分子生物学—16SrDNA测序。经鉴定，L-4和L-7菌株为杂菌，无法鉴定；L-1菌株性能不稳定；L-2和L-5菌株均具有致病性。综合考虑产IAA性能、产IAA稳定性以及菌株安全性因素，最终确定L-8作为后续研究的菌株。根据16S rDNA测序及系统发育分析，判定菌株L-8为鞘氨醇单胞菌(Sphingosinomonas)，命名为鞘氨醇单胞菌MSp2302，该菌株于2023年5月17日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其生物保藏编号为CCTCCNO:M 2023777，其序列长度为1390bp，序列如SEQ ID NO:3所示：CTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTAGGTTCGGAATAACAGTTAGAAATGACTGCTAATACCGGATGATGACGTTAAGTCCAAAGATTTATCGCCTGAGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGACTTCGAGAGATCGATTTCTTCCCTTCGGGGACTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAGGTACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACCTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGAAGGCGTTGCGCCAACCCGTAAGGGAAGCA

4.3、MSp2302菌株的理化特性

MSp2302菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上30℃培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑带有光泽，黄色不透明(图1)。将MSp2302革兰氏染色呈阴性，为无芽孢的棒状杆菌(图2)；菌株专性需氧，最适pH为6.5～7.5。

MSp2302菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基30℃、180r/min培养24h活化后，取1mL菌液加入99mL牛肉膏蛋白胨培养基30℃、180r/min振荡培养，在此期间连续检测菌液OD600值，直到OD600数值趋于稳定。MSp2302菌体生长主要呈现四个阶段，分别为：(1)迟缓期：0～8h，细菌处于缓慢生长阶段；(2)对数生长期：8～30h，细菌快速生长和繁殖，呈现出对数增长；(3)稳定期：30～36h，细菌生长处于高峰且趋于稳定；(4)衰亡期：36h后进入衰亡期，细菌生长极其缓慢(图3)。

实施例2

生物炭产IAA固定化菌剂的制备及MSp2302菌剂、固定化菌剂中活菌数量的检测

1、稻壳生物炭及稻秆生物炭的制备

将稻杆剪短，稻杆和稻壳去杂后，于100℃干燥24h，粉碎过80目筛，将过筛后的稻壳与稻杆分别置于加盖的坩埚中，待马弗炉升温至约100℃时放入坩埚，以10～15℃/min的速率升温至400℃、550℃和700℃，并在这些温度下持续热解2h(也可以延长至2.5h，但由于热解2～2.5h对热解得到的生物炭及最终制备得到的固定化菌剂的效果影响差异不明显，故本方案出于节省时间及节约能耗方面的考虑，采用2h的热解时间进行操作)，待温度降至200℃以下取出，过20～60目筛，干燥，分别得到400℃稻壳生物炭、550℃稻壳生物炭、700℃稻壳生物炭、400℃稻杆生物炭、550℃稻杆生物炭、700℃稻杆生物炭。

2、MSp2302菌剂的制备

挑取纯化的MSp2302单菌落加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180rpm/min条件下活化24h，制备MSp2302菌悬液，OD值为1～1.5。将MSp2302菌悬液以1％接种量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180rpm/min条件下恒温振荡器中分别发酵培养1d、2d、3d和5d，制备得到不同培养时间的MSp2302菌剂。

需要说明的是，MSp2302菌株的发酵培养可以在30～35℃、150～180r/min下培养24～32h，在此条件下均能够得到效果基本相同的MSp2302菌剂，本领域技术人员具体操作时按照需求进行选择即可。

3、稻壳或稻杆生物炭产IAA固定化菌剂的制备

取上述不同温度下热解得到的稻壳生物炭及稻杆生物炭，分别按照质量体积百分数1％、3％和5％加入至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后将MSp2302菌悬液以1％接种量接种至上述制备的含生物炭的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180rpm/min条件下恒温振荡器中分别培养1d、2d、3d和5d，经过离心、过滤，制备得到不同添加量的生物炭固定化菌剂，具体如下：

1％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂，3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂，5％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂；1％、550℃稻壳生物炭固定化菌剂，3％、550℃稻壳生物炭固定化菌剂，5％、550℃稻壳生物炭固定化菌剂；1％、700℃稻壳生物炭固定化菌剂，3％、700℃稻壳生物炭固定化菌剂，5％、700℃稻壳生物炭固定化菌剂；

1％、400℃稻杆生物炭固定化菌剂，3％、400℃稻杆生物炭固定化菌剂，5％、400℃稻杆生物炭固定化菌剂；1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂，3％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂，5％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂；1％、700℃稻杆生物炭固定化菌剂，3％、700℃稻杆生物炭固定化菌剂，5％、700℃稻杆生物炭固定化菌剂。

4、MSp2302标准曲线的制备

利用平板涂布计数法与酶标仪测定菌液OD450的关系，拟合二者对应曲线，制备MSp2302标准曲线。具体为：

取MSp2302纯化单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基活化1d，活化后采用倍比稀释法，取每一梯度10

5、MSp2302菌剂和生物炭固定化菌剂中活菌数的检测

取上述不同培养时间下的MSp2302菌剂和生物炭固定化菌剂用无磷滤纸过滤，吸取100μL过滤液至酶标板孔，再加入10μL CCK8试剂，37℃暗处培养一定时间后用酶标仪测定450nm处进行吸光度，每个处理三次重复。

6、活菌数检测结果

1)稻壳生物炭固定化菌剂的活菌数量检测结果如图4及图5a所示。结果显示，MSp2302菌剂以及不同添加水平(1％，3％和5％)的稻壳生物炭固定化菌剂中MSp2302活菌数均呈先上升后下降的趋势，培养至第3d时以3％添加量的400℃稻壳生物炭固定化菌剂的活菌数最高，为14.13×10

2)稻杆生物炭固定化菌剂的活菌数量检测结果如图5b及图6所示。结果显示，MSp2302菌剂以及不同添加水平(1％，3％和5％)的稻杆生物炭固定化菌剂中MSp2302活菌数均呈先上升后下降的趋势，培养至第3d时以1％添加的550℃稻杆生物炭固定化菌剂的活菌数达到最高的14.01×10

以上结果表明，MSp2302菌剂中活菌数均呈先上升后下降的趋势，且培养至第3d时以3％添加量的400℃稻壳生物炭固定化菌剂及以1％添加的550℃稻杆生物炭固定化菌剂中活菌数均显著高于MSp2302菌剂第3天的活菌数。

实施例3

MSp2302菌剂及生物炭固定化菌剂产IAA性能检测

1、IAA标准曲线的制备

精确称取10mg IAA于100mL容量瓶，首先加入少量95％乙醇将IAA溶解，然后用R

2、MSp2302菌剂和生物炭固定化菌剂产IAA的检测

向实施例2中得到的培养至第1d、2d、3d和5d的MSp2302菌剂和生物炭固定化菌剂中分别加入R

3、产IAA的检测结果

1)稻壳生物炭产IAA固定化菌剂产IAA浓度的检测结果如图7及图8a所示，MSp2302菌剂以及不同添加水平(1％，3％和5％)的稻壳生物炭固定化菌剂产IAA浓度均呈先上升后下降的趋势。培养至第3d时以3％添加量的400℃稻壳生物炭固定化菌剂产IAA浓度最高(58.07mg/L)，比MSp2302菌剂培养至第3天时产IAA浓度(43.77mg/L)高32.67％。

3)稻杆生物炭产IAA固定化菌剂产IAA浓度的检测结果如图8b及图9所示，MSp2302菌剂以及不同添加水平(1％，3％和5％)的稻杆生物炭固定化菌剂产IAA浓度均呈先上升后下降的趋势，培养至第3d时以1％添加量的550℃稻杆生物炭固定化菌剂产IAA浓度最高(61.83mg/L)，比MSp2302菌剂培养至第3天时产IAA浓度(43.77mg/L)提高了41.26％。

以上结果表明，第3d时，MSp2302菌剂产IAA达43.77mg/L，而MSp2302菌剂与稻壳或稻杆制成的3％添加量的400℃稻壳生物炭固定化菌剂及1％的550℃稻杆生物炭固定化菌剂产IAA浓度得到了进一步显著提高。

实施例4

MSp2302菌剂及生物炭固定化菌剂对水稻苗期土壤理化性质的影响

1、实验方法

将实施例2中制得的MSp2302菌剂按照体积百分数1％接种量施入水稻盆栽土壤中(即土壤与MSp2302菌剂的比例为100g∶1mL)，再施入营养液保持土面浅水层2～3cm，试验第30d检测土壤理化指标。

根据实施例2和实施例3的实验结果，选择活菌数量和产生长素水平最佳的3％添加量的400℃稻壳生物炭固定化菌剂及1％添加量的550℃稻杆生物炭固定化菌剂，按照稻壳或稻杆生物炭质量计算，将上述两种不同固定化菌剂以质量百分数1％施入到水稻盆栽土壤中搅拌均匀，再施入营养液保持土面浅水层2～3cm，试验第30d检测土壤理化指标。

同时以不做任何处理(不添加MSp2302菌剂、生物炭和固定化菌剂)的土壤为空白对照组。

2、土壤理化性质指标的测定方法

2.1、土壤全氮和全碳的测定

称取150mg过100目的土壤样品，平铺于锡纸中心，使用包样辅助工具将土密封，使用模具将包裹好的锡纸压制成形，将样品放入升温至1150℃的元素分析仪内测定。

2.2、土壤有效磷的测定

称取2.5g过20目筛的土壤样品置于150mL三角瓶中，加入50mL 0.5mol/LNaHCO

2.3、土壤pH的测定

称取5.0g干燥且粒径在20～100目之间的土壤(精确至0.01g)，置入100mL三角瓶中，缓慢顺瓶口加入25mL去离子水，用封口膜封住三角瓶瓶口，震荡90min后用pH计测定土壤pH。

2.4、电导率测定

将电导率仪器校对后插入土壤溶液(土水比1：5)，土壤溶液为5g过10目筛的土壤样品与25mL水混合，待机器读数稳定后记录数值。

2.5、微生物量碳的测定

采用熏蒸提取-仪器分析法检测，将装有5g新鲜土样的培养皿放入真空干燥器中，底部放2个盛有无乙醇氯仿及防暴沸珠的烧杯，和1个盛有NaOH溶液的烧杯，底部加水保持湿度。真空干燥器封盖后抽真空，使氯仿沸腾并持续5min，关闭阀门置于25℃黑暗条件下培养24h，熏蒸结束后将5g土样完全转移到50mL聚乙烯离心管中，加入20mL 0.5mol/L硫酸钾溶液，摇床300r/min振荡30min，再经离心机3000r/min离心5min后用中速定量滤纸过滤，滤液稀释5倍后用总有机碳分析仪测定。

2.6、微生物量磷的测定

土样完全转移到250mL三角瓶中，加入40mL 0.5mol/L NaHCO

3、检测结果

1)MSp2302菌剂及稻壳生物炭固定化菌剂对水稻土壤理化性质的影响结果如表2所示。表2显示，施用MSp2302菌剂的水稻土壤pH较空白对照组土壤得到明显的改善，且全氮含量、微生物量碳和微生物量磷含量均比空白对照组分别提高了4.3％、36.16％(P<0.05)和130.82％(P<0.05)。

施用400℃、3％的稻壳生物炭固定化菌剂能改善土壤的pH，同时还能使水稻土壤中全碳含量、全氮含量、有效磷含量、电导率及微生物量磷含量较单独施用MSp2302菌剂时分别显著提高31.52％(P<0.05)、16.49％(P<0.05)、80.48％(P<0.05)、31.62％(P<0.05)及19.02％(P<0.05)。此外，与单独施用稻壳生物炭的水稻土壤比较，施用400℃、3％稻壳生物炭固定化菌剂使得土壤中全碳含量、全氮含量、有效磷含量、土壤电导率、微生物量碳及微生物量磷含量分别显著提高3.79％(P<0.05)、11.88％(P<0.05)、26.34％(P<0.05)、10.63％(P<0.05)、3.40％(P<0.05)和87.07％(P<0.05)。

以上结果表明，MSp2302菌剂对苗期水稻土壤的理化性质具有改善作用，并且以稻壳或稻杆生物炭作为载体制备的固定化菌剂对水稻土壤的改良效果比单独使用MSp2302菌剂和稻壳或稻杆生物炭时显著提高。

表2MSp2302菌剂及稻壳生物炭固定化菌剂对水稻土壤理化性质的影响

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)；

2)MSp2302菌剂及稻杆生物炭固定化菌剂对水稻土壤理化性质的影响结果如表3所示。表3显示，施用MSp2302菌剂的水稻土壤pH较空白对照组土壤得到明显的改善，且全氮含量、微生物量碳和微生物量磷含量均比空白对照组显著提高了6.45％、9.84％(P<0.05)和137.82％(P<0.05)。施用550℃、3％的稻杆生物炭固定化菌剂能使水稻土壤中全碳含量、全氮含量、有效磷含量、电导率、微生物量碳及微生物量磷比单独施用MSp2302菌剂时分别显著提高了53.5％(P<0.05)、30.3％(P<0.05)、44.96％(P<0.05)、26.55％(P<0.05)、45.46％(P<0.05)和47.09％(P<0.05)，且施用550℃、3％的稻杆生物炭固定化菌剂还显著改善了水稻土壤pH。此外，与单独施用稻杆生物炭的水稻土壤比较，施用550℃、1％的稻杆生物炭固定化菌剂使得水稻土壤中全碳含量、全氮含量、土壤电导率、微生物量碳及微生物量磷显著提高1.03％、24.04％(P<0.05)、9.43％(P<0.05)、48.60(P<0.05)、94.06％(P<0.05)。

以上结果表明，MSp2302菌剂对水稻土壤理化性质具有明显的改善作用，而以稻杆生物炭作为载体负载MSp2302菌株形成的固定化菌剂对水稻土壤的改良作用显著高于单独使用MSp2302菌剂或稻杆生物炭。

表3 MSp2302菌剂及稻杆生物炭固定化菌剂对水稻土壤理化性质的影响

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)；

实施例5

MSp2302菌剂及生物炭固定化菌剂对水稻种子发芽的影响

1、水稻种子前处理

将水稻种子清水浸泡去除瘪粒，收集饱满且无残缺种子，蒸馏水冲洗3遍，然后用70％酒精浸泡3～5min，再用蒸馏水反复冲洗3～5次，最后用30％NaClO浸泡30min，蒸馏水冲洗干净，擦干水分备用。

2、水稻种子的孵育

在培养皿中平铺一层滤纸，用实施例2中培养3d得到的固定化菌剂及MSp2302菌剂分别浸湿滤纸后，取30粒水稻种子均匀放置于培养皿中的滤纸上，然后将培养皿置于30℃培养箱，25～30℃保持光照8h，15～16℃暗室保持16h。水稻种子发芽率的计算：培养10d后观察并统计种子发芽率。同时以清水处理作为空白对照组。发芽率＝发芽种子数/供试种子数×试种子数。

3、水稻种子发芽和生长的检测结果

水稻种子发芽率和胚根长检测结果如图10～11所示，以1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂和3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂促进种子发芽率和胚根生长的效果最佳。相较于空白对照组，MSp2302菌剂使得水稻种子发芽率及胚根长分别提高9.59％及15.79％。相较于单独使用MSp2302菌剂，1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂使得水稻种子发芽率和胚根长分别提高13.75％(P<0.05)和30.54％(P<0.05)；3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂促进水稻种子发芽率和胚根长的效果比使用MSp2302菌剂时分别高出11.25％(P<0.05)和29.70％(P<0.05)。

以上结果表明，MSp2302菌剂能促进水稻种子发芽和生长，而3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂及1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂能更加显著的促进水稻种子发芽和生长，且其作用效果比单独施用MSp2302菌剂时明显提高。

实施例6

MSp2302菌剂及生物炭固定化菌剂对水稻幼苗生长的影响

1、实验方法

将实施例2中培养3d得到的固定化菌剂及MSp2302菌剂分别按照生物炭和土壤质量比为1:100施入水稻土壤中搅拌均匀。将发芽后的水稻种子种植于30水稻土壤中搅cm塑料盆中，再施入营养液保持土面浅水层2～3cm，定植后7、15、30d分别测定水稻幼苗株高，定植后30d，测量水稻幼苗地上部鲜重、干重，地下部鲜重、干重以及茎粗和根长。同时以清水处理作为空白对照组。

2、检测结果

2.1、株高检测

水稻幼苗株高测定结果如图12所示，与空白对照组比较，两种生物炭固定化菌剂所对应的MSp2302菌剂在7d、15d和30d时使水稻幼苗株高分别平均提高了9.07％(P<0.05)、18.31％(P<0.05)和20.38％(P<0.05)，表明MSp2302菌剂能提高水稻幼苗株高。

与单独施用MSp2302菌剂相比，3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂在7d、15d及30d时使得水稻株高分别提高37.71％(P<0.05)、22.3％(P<0.05)及22.4％(P<0.05)，1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂在7d、15d及30d时使得水稻株高分别提高27.18％(P<0.05)、8.97％(P<0.05)及25.3％(P<0.05)。

与单独施用生物炭相比，3％、400℃稻壳炭产IAA固定化菌剂在7d、15d及30d时使得水稻株高分别提高38.96％(P<0.05)、20.27％(P<0.05)及35.66％(P<0.05)，1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂在7d、15d及30d时使得水稻株高分别提高35.14％(P<0.05)、18.73％(P<0.05)及34.39％(P<0.05)。

以上结果表明，MSp2302菌剂能够明显促进水稻生长，而以生物炭为载体负载MSp2302菌株制备得到的固定化菌剂对水稻的促生长作用更加显著。

2.2、水稻幼苗地下根系重量、地上部分重量、根长和茎粗的检测

水稻幼苗地下根系重量、地上部分重量、根长和茎粗的结果如图13～15所示。与空白对照组比较，两种生物炭产IAA固定化菌剂所对应的MSp2302菌剂使水稻幼苗地上部分鲜重分别提高了18.64％(P<0.05)和16.61％(P<0.05)、地上部分干重分别提高了12.28％(P<0.05)和17.54％(P<0.05)，茎粗分别提高了5.13％(P<0.05)和7.69％(P<0.05)，根系鲜重分别提高了10.53％(P<0.05)、14.04％(P<0.05)，根系干重分别提高20％(P<0.05)、30％(P<0.05)，根长分别提高12.79％(P<0.05)和15.69％(P<0.05)。

与单独施用MSp2302菌剂相比，施用3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂30d时使得水稻幼苗地上鲜重、地上干重、根系鲜重、根系干重、茎粗和根长分别提高31.69％(P<0.05)、34.38％(P<0.05)、33.33％(P<0.05)、41.67％(P<0.05)、20.73％(P<0.05)和29.7％(P<0.05)。与单独施用稻壳生物炭相比，施用3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂30d时使得水稻幼苗地上鲜重提高17.05％(P<0.05)、地上干重提高14.67％(P<0.05)、根系鲜重提高12％(P<0.05)、根系干重提高6.25％、茎粗提高了10％(P<0.05)、根长提高了38.91％(P<0.05)。

与单独施用MSp2302菌剂相比，施用1％、550℃稻杆炭产IAA固定化菌剂30d时使得水稻幼苗地上鲜重、地上干重、根系鲜重、根系干重、茎粗和根长分别提高31.71％(P<0.05)、34.33％(P<0.05)、33.85％(P<0.05)、30.77％(P<0.05)、19.05％(P<0.05)、30.54％(P<0.05)。与单独施用稻杆生物炭相比，施用3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂30d时使得水稻幼苗地上鲜重提高24.93％(P<0.05)、地上干重提高30.43％(P<0.05)、根系鲜重提高26.09％(P<0.05)、根系干重提高30.77％(P<0.05)、茎粗提高12.36％(P<0.05)、根长提高25.42％(P<0.05)。

以上结果表明，单独施用MSp2302菌剂能够促进水稻植物生长，而将MSp2302菌株负载于生物炭载体制备成的3％、400℃稻壳生物炭固定化菌剂及1％、550℃稻杆生物炭固定化菌剂能更好的发挥对水稻幼苗生长的促进作用，其效果明显优于单独施用MSp2302菌剂或者生物炭的效果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。