一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤药物技术领域，具体而言，涉及一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤作为难以治愈的疾病之一，严重威胁着人类的生命健康。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，因为这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。p53基因在超过50％的人类癌症中存在突变，在一些难以治愈的恶性肿瘤中，其突变率甚至高达80％。突变后的p53基因不仅失去了抑癌功能，还会产生新的促进癌症发生发展的功能，如促进肿瘤的生长、侵袭和转移，阻断天然免疫信号通路促进肿瘤免疫逃逸，化疗耐药且预后较差等。因此，肿瘤高发复杂多样的p53突变是癌症有效治疗面临的巨大难题。

目前针对p53突变型肿瘤的治疗策略有，采用药物化疗策略直接诱导突变型p53蛋白降解或帮助其恢复野生型的功能，但由于其药物容易被正常组织摄取而导致难以避免的毒副作用和易发生的多药耐药性，使其真正进入临床用于突变p53肿瘤治疗还比较难以实现。还有采用基因治疗策略纠正或补偿突变的p53基因，然而DNA所带来的核定位和插入突变风险，以及RNA产生的免疫原性和自身的不稳定性仍然是难以解决的问题。现有的针对p53突变型肿瘤的免疫治疗方法通常存在治疗效果不理想，免疫治疗手段单一，对于多种p53突变体的普适性低，并且存在抗体及免疫因子靶向递送效果差等问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子及其制备方法和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子，其包括脂质体、Zn

在可选的实施方式中，所述双离子基纳米粒子的粒径为100-150nm。

在可选的实施方式中，所述双离子基纳米粒子的离子释放pH小于等于5.5。

第二方面，本发明提供一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子的制备方法，其包括：

(1)将含有Zn

(2)将含有Co

(3)将所述LIZn纳米粒子与所述MCo复合物混合，分离并收集沉淀，制得LIZn@MCo纳米粒子；

(4)将所述LIZn@MCo纳米粒子与外层肿瘤细胞膜混合，分离并收集沉淀，制得LIZn@MCo@M纳米粒子，即得。

在可选的实施方式中，所述含有Zn

优选地，所述含有Co

优选地，所述LIZn纳米粒子与所述MCo复合物的体积比为1：1-1.5；

优选地，所述LIZn@MCo纳米粒子与所述外层肿瘤细胞膜的体积为1.5-2.5:1。

在可选的实施方式中，所述内层肿瘤细胞膜和所述外层肿瘤细胞膜的制备方法包括：将肿瘤细胞离心3-8min，在缓冲液中洗涤2-4次，加入无菌水使细胞涨破，用细胞破碎仪超声至离心管壁微热，5000-9000rpm离心3-8min，取上清，即得；

优选地，所述缓冲液为pH＝7-8的PBS。

在可选的实施方式中，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞。

在可选的实施方式中，步骤(1)-步骤(4)中的混合均是在涡流和超声条件下进行的；

优选地，步骤(1)-步骤(4)中的分离均包括于10000-20000rpm离心20-40min；

优选地，步骤(3)在分离之前，还包括依次采用0.7-0.9μM、0.4-0.5μM、0.1-0.2μM滤膜过滤8-12次；

优选地，步骤(4)在分离之前，还包括依次采用0.7-0.9μM、0.4-0.5μM、0.1-0.2μM滤膜过滤4-6次。

在可选的实施方式中，所述脂质体的制备方法包括：将DPPC和胆固醇溶解于有机溶剂中形成反应液，减压蒸发所述反应液以获得脂质体薄膜，所述DPPC、所述胆固醇和所述有机溶剂的质量体积比为5-10mg：1-5mg：10ml。

第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子或者如前述实施方式任一项所述的用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子的制备方法制备获得的用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子在制备用于治疗或改善突变型p53蛋白高表达的肿瘤的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本申请提供的用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子(LIZn@MCo@M纳米粒子)最外层肿瘤细胞膜能够靶向到肿瘤部位，具有更高的药效，同时还可以保护内层的Co

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例1提供的LIZn@MCo@M纳米粒子的结构示意图；

图2为本申请实施例1提供的LIZn@MCo@M纳米粒子的透射电子显微镜图；

图3为本申请实施例1提供的LIZn@MCo@M纳米粒子的粒径分布示意图；

图4为本申请实施例1提供的LIZn@MCo@M纳米粒子在制备过程中涉及的不同纳米粒子的电位图；

图5为本申请实验例一中LIZn@MCo@M纳米粒子在不同pH环境下离子随时间的释放曲线图，其中，a为锌离子随时间的释放曲线，b为钴离子随时间的释放曲线；

图6为本申请实验例二中KPC细胞存活率示意图，其中，a为LIZn@MCo@M纳米粒子随着浓度变化对KPC细胞存活率的影响示意图，b为不同处理组对KPC细胞存活率的影响示意图；

图7为本申请实验例三中蛋白表达的示意图，其中，a为免疫印迹法检测不同纳米粒子处理KPC细胞的p53和Mutp53表达情况示意图，b为免疫印迹法检测不同纳米粒子处理KPC细胞的TBK1、p-TBK1、STING和p-STING表达情况示意图；

图8为本申请实验例四中抗癌实验的结果示意图，其中，a为不同纳米粒子治疗KPC模型鼠的肿瘤体积变化曲线图，b为不同纳米粒子治疗KPC模型鼠的肿瘤重量变化曲线图，c为不同纳米粒子治疗KPC模型鼠的肿瘤变化示意图；

图9为本申请实验例五中免疫细胞的流式实验的结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中所使用的实验试剂：

胆固醇购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)购自AVT Pharmaceutical Tech CO.,Ltd.(中国上海)。氯化锌(ZnCl

本发明提供一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子，其包括脂质体、Zn

双离子基纳米粒子的粒径为100-150nm。双离子基纳米粒子的离子释放pH小于等于5.5。

本发明还提供了上述用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤：

(1)制备LIZn纳米粒子。

将DPPC和胆固醇溶解于有机溶剂中形成反应液，减压蒸发得到脂质体薄膜(此时仅为双分子层薄膜)，DPPC、胆固醇和有机溶剂的质量体积比为5-10mg：1-5mg：10ml。将含有Zn

(2)制备肿瘤细胞膜。

将肿瘤细胞离心3-8min，在缓冲液中洗涤2-4次，加入无菌水使细胞涨破，用细胞破碎仪超声至离心管壁微热，5000-9000rpm离心3-8min，取上清，即得；缓冲液为pH＝7.4的PBS。肿瘤细胞为胰腺癌细胞。

(3)制备MCo复合物。

将含有Co

(4)制备LIZn@MCo纳米粒子。

将LIZn纳米粒子与MCo复合物按照体积比为1：1-1.5进行配料，并在涡流和超声条件下混合，依次采用0.7-0.9μM、0.4-0.5μM、0.1-0.2μM滤膜过滤8-12次，10000-20000rpm离心20-40min，分离并收集沉淀，制得LIZn@MCo纳米粒子。

(5)制备LIZn@MCo@M纳米粒子。

将LIZn@MCo纳米粒子与外层肿瘤细胞膜(体积为1.5-2.5:1)在涡流和超声条件下混合，依次采用0.7-0.9μM、0.4-0.5μM、0.1-0.2μM滤膜过滤4-6次，10000-20000rpm离心20-40min，分离并收集沉淀，制得LIZn@MCo@M纳米粒子，即得。

本申请通过利用脂质体磷脂双分子层亲水性和疏水性，以及细胞膜的静电吸附作用，实现将Zn

本申请中LIZn@MCo@M纳米粒子的作用机理如下：

注入LIZn@MCo@M纳米粒子后，最外层肿瘤细胞膜能够靶向到肿瘤部位，内吞进入细胞中，并在酸性的肿瘤细胞环境下，释放Zn

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备LIZn纳米粒子。

将7mg DPPC和3mg胆固醇溶解于10mL氯仿中形成反应液，在56℃下旋蒸至干燥，在瓶壁上得到脂质体薄膜。加入氯化锌溶液(2.726mg溶于2mL去离子水中)，充分水化脂质体薄膜，水化完毕后，将溶液在涡流和超声条件下混合至澄清状液体。15000rpm离心20min，收集沉淀，再超声复溶到2mL水中，制得LIZn纳米粒子。

(2)制备肿瘤细胞膜。

将长满的两瓶50ml培养瓶的胰腺癌细胞(KPC细胞)离心5min，在pH＝7.4的PBS中洗涤3次，加入1mL无菌水使细胞涨破，用细胞破碎仪超声至离心管壁微热，7000rpm离心5min，取上清，即得肿瘤细胞膜。

(3)制备MCo复合物。

将500μL氯化钴溶液(10mg/mL)逐滴添加到1mL的肿瘤细胞膜溶液中，然后重复涡流和超声，15000rpm离心30min，收集沉淀，分散于1mL水中，制得MCo复合物。

(4)制备LIZn@MCo纳米粒子。

将LIZn纳米粒子滴加到MCo复合物中(体积比为1：1)，在涡流和超声条件下混合，依次采用0.8μM、0.45μM、0.2μM滤膜过滤10次，15000rpm离心30min，收集沉淀，重复洗涤，制得LIZn@MCo纳米粒子。

(5)制备LIZn@MCo@M纳米粒子。

将2mL的LIZn@MCo纳米粒子与1mL的肿瘤细胞膜在涡流和超声条件下混合，依次采用0.8μM、0.45μM、0.2μM滤膜过滤5次，15000rpm离心30min，收集沉淀，洗涤三次，制得平均粒径为149nm的LIZn@MCo@M纳米粒子。

获得的LIZn@MCo@M纳米粒子的结构如图1所示，可以看出，脂质体具有双分子层，Zn

对获得的LIZn@MCo@M纳米粒子进行透射电子显微镜检测和粒径分析，从图2可以看出，双层细胞膜成功包覆于脂质体外层，LIZn@MCo@M纳米粒子成功制备，从图3可以看出，LIZn@MCo@M纳米粒子的粒径分布均匀且较为集中。

此外，通过对实施例1的制备LIZn@MCo@M纳米粒子的过程中形成的多个中间体进行电位分析，从图4可以看出，单独的肿瘤细胞膜(CM)明显带负电，而脂质体(LIVN)略带电，电位不明显，包覆有Zn

实施例2

本实施例提供了一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备LIZn纳米粒子。

将5mg DPPC和1mg胆固醇溶解于10mL氯仿中形成反应液，在56℃下旋蒸至干燥，在瓶壁上得到脂质体薄膜薄膜。加入氯化锌溶液(2.726mg溶于2mL去离子水中)，充分水化脂质体薄膜，水化完毕后，将溶液在涡流和超声条件下混合至澄清状液体。10000rpm离心30min，收集沉淀，再超声复溶到2mL水中，制得LIZn纳米粒子。

(2)制备肿瘤细胞膜。

将长满的两瓶50ml培养瓶的胰腺癌细胞(KPC细胞)离心5min，在pH＝7.4的PBS中洗涤2次，加入1mL无菌水使细胞涨破，用细胞破碎仪超声至离心管壁微热，5000rpm离心8min，取上清，即得肿瘤细胞膜。

(3)制备MCo复合物。

将500μL氯化钴溶液(8mg/mL)逐滴添加到1mL的肿瘤细胞膜溶液中，然后重复涡流和超声，10000rpm离心40min，收集沉淀，分散于1mL水中，制得MCo复合物。

(4)制备LIZn@MCo纳米粒子。

将LIZn纳米粒子滴加到MCo复合物中(体积比为1：1.2)，在涡流和超声条件下混合，依次采用0.7μM、0.4μM、0.1μM滤膜过滤8次，10000rpm离心40min，收集沉淀，重复洗涤，制得LIZn@MCo纳米粒子。

(5)制备LIZn@MCo@M纳米粒子。

将1.5mL的LIZn@MCo纳米粒子与1mL的肿瘤细胞膜在涡流和超声条件下混合，依次采用0.7μM、0.4μM、0.1μM滤膜过滤4次，10000rpm离心40min，收集沉淀，洗涤三次，制得平均粒径为149nm的LIZn@MCo@M纳米粒子，即得。

实施例3

本实施例提供了一种用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备LIZn纳米粒子。

将10mg DPPC和5mg胆固醇溶解于10mL氯仿中形成反应液，在56℃下旋蒸至干燥，在瓶壁上得到脂质体薄膜。加入氯化锌溶液(2.726mg溶于2mL去离子水中)，充分水化脂质体薄膜，水化完毕后，将溶液在涡流和超声条件下混合至澄清状液体。20000rpm离心20min，收集沉淀，再超声复溶到2mL水中，制得LIZn纳米粒子。

(2)制备肿瘤细胞膜。

将长满的两瓶50ml培养瓶的胰腺癌细胞(KPC细胞)离心5min，在pH＝7.4的PBS中洗涤4次，加入1mL无菌水使细胞涨破，用细胞破碎仪超声至离心管壁微热，9000rpm离心3min，取上清，即得肿瘤细胞膜。

(3)制备MCo复合物。

将500μL氯化钴溶液(15mg/mL)逐滴添加到1mL的肿瘤细胞膜溶液中，然后重复涡流和超声，20000rpm离心20min，收集沉淀，分散于1mL水中，制得MCo复合物。

(4)制备LIZn@MCo纳米粒子。

将LIZn纳米粒子滴加到MCo复合物中(体积比为1：1.5)，在涡流和超声条件下混合，依次采用0.9μM、0.5μM、0.2μM滤膜过滤12次，20000rpm离心20min，收集沉淀，重复洗涤，制得LIZn@MCo纳米粒子。

(5)制备LIZn@MCo@M纳米粒子。

将2.5mL的LIZn@MCo纳米粒子与1mL的肿瘤细胞膜在涡流和超声条件下混合，依次采用0.7μM、0.4μM、0.1μM滤膜过滤6次，20000rpm离心20min，收集沉淀，洗涤三次，制得平均粒径为149nm的LIZn@MCo@M纳米粒子，即得。

对比例1

本对比例提供了一种氯化锌溶液(3.667mg溶于2mL去离子水中)。

对比例2

本对比例提供了一种氯化钴溶液(10mg/mL)。

对比例3

本对比例提供了氯化锌溶液(3.667mg溶于2mL去离子水中)和氯化锌溶液(10mg/mL)的混合物，体积比为1：1。

对比例4

本对比例提供了一种脂质体，其制备方法请参阅实施例1中的步骤(1)中脂质体部分，具体包括：将7mg DPPC和3mg胆固醇溶解于10mL氯仿中形成反应液，在56℃下旋蒸至干燥，在瓶壁上得到脂质体薄膜，加水进行水化后获得脂质体，记为LIVN。

对比例5

本对比例提供了一种LIZn纳米粒子，其制备方法请参阅实施例1中的步骤(1)。

对比例6

本对比例提供了一种LIVN@MCo纳米离子，其制备方法包括：

将7mg DPPC和3mg胆固醇溶解于10mL氯仿中形成反应液，在56℃下旋蒸至干燥，在瓶壁上得到脂质体薄膜，加水进行水化后得到脂质体，记为LIVN。

将LIVN纳米粒子滴加到按照实施例1中步骤(2)和(3)制备获得的MCo复合物中(体积比为1：1)，在涡流和超声条件下混合，依次采用0.8μM、0.45μM、0.2μM滤膜过滤10次，15000rpm离心30min，收集沉淀，重复洗涤，制得LIVN@MCo纳米粒子。

实验例一：离子释放效果

实验方法包括：通过将实施例1获得的LIZn@MCo@M纳米粒子在不同pH的环境下检测其离子释放效果。

实验结果请参阅图5。

结果表明：LIZn@MCo@M纳米粒子在pH＝7.4时，Zn

实验例二：杀伤性实验

将不同处理组分别在突变型p53蛋白高表达的胰腺癌KPC细胞中进行了纳米粒子杀伤性实验。

不同处理组包括：空白对照组(CON)、对比例1(Zn

实验方法包括：使用小鼠胰腺癌细胞KPC，通过MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT)评价LIZn@MCo@M的细胞毒性。将所有细胞(8,000个细胞/孔)接种于96孔板中并孵育24小时(37℃，5％CO2)。不同离子浓度(0、3、5、10、15、20μg/mL)的LIZn@MCo@M与KPC细胞孵育24h。在除去含有LIZn@MCo@M的培养基后，向每孔中加入100μL含有10μL MTT的完全培养基，并孵育4小时。测量490nm处的吸光度。

将对比例1-6提供的产品稀释至离子浓度为20μg/mL的ZnCl

实验结果请参阅图6。

从图6中a可以看出，随着LIZn@MCo@M纳米粒子的浓度增大，KPC细胞存活率逐渐降低，因此适宜的LIZn@MCo@M纳米粒子浓度为3-20μg/mL。从图6中b可以看出，单独的Zn

实验例三：蛋白表达实验。

将不同处理组分别在突变型p53蛋白高表达的胰腺癌KPC细胞中检查p53(DO-1)、TBK1、p-TBK1、STING和p-STING表达情况。

不同处理组包括：空白对照组(Control)、对比例4(LIVN)、对比例5(LIZn)、对比例6(LIVN@MCo)、实施例1(LIZn@MCo@M)。

实验方案包括：蛋白质印迹测定：将细胞裂解物上样到SDS-PAGE凝胶上并转移至PVDF膜(Millipore)。将指定的一抗孵育过夜，并使用HRP连接的羊抗兔IgG(宝科)作为二抗。使用Amersham Imager 600系统(GE Healthcare Life Sciences，匹兹堡，美国)通过ECL使印迹信号可视化。

实验结果请参阅图7。

从图7中a和b可以看出，LIZn@MCo@M纳米粒子能够下调突变型p53的表达并且上调p-TBK1和p-STING的表达。

实验例四：抗癌实验。

将不同处理组分别在胰腺癌KPC模型鼠中进行了载药纳米粒子抗癌实验。

不同处理组包括：空白对照组(Control)、对比例4(LIVN)、对比例5(LIZn)、对比例6(LIVN@MCo)、实施例1(LIZn@MCo@M)。

实验方案包括：采用C57BL/6小鼠(6周，雄性)作为动物模型。KPC细胞被皮下注射到小鼠体内。当肿瘤体积为75-100nm

实验结果请参阅图8。

从图8中a可以看出，LIZn@MCo@M纳米粒子治疗KPC模型鼠的肿瘤体积显著低于其他处理组，从图8中b可以看出，LIZn@MCo@M纳米粒子治疗KPC模型鼠的肿瘤重量也显著低于其他处理组，从图8中c可以看出，肿瘤的变化效果更为明显，比空白对照组的治疗效果提升了将近8倍。

实验例五：免疫细胞的流式实验。

将不同处理组分别在胰腺癌KPC模型鼠中进行了免疫细胞的流式实验。

不同处理组包括：空白对照组(Control)、对比例4(LIVN)、对比例5(LIZn)、对比例6(LIVN@MCo)、实施例1(LIZn@MCo@M)。

实验方案包括：采用C57BL/6小鼠(6周，雌性)作为动物模型。KPC细胞被皮下注射到小鼠体内。当肿瘤体积为75-100nm

实验结果请参阅图9。

从图9可以看出，LIZn@MCo@M纳米粒子的免疫细胞被明显激活，LIZn@MCo@M纳米粒子组的被激活的免疫细胞数最多。

综上所述，本申请提供的用于治疗p53突变肿瘤的双离子基纳米粒子(LIZn@MCo@M纳米粒子)最外层肿瘤细胞膜能够靶向到肿瘤部位，具有更高的药效，同时还可以保护内层的Co

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。