一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是鱼类胚胎冷冻保存。

背景技术

由于鱼胚体积大(直径为≥1mm)、双层膜结构、绒毛膜通透性差、卵黄囊含水量多等特点,其冷冻保存比哺乳类胚胎困难许多。到目前为止,只有极少数品种的鱼胚能够成功冷冻保存。对于鱼类胚胎等大体积的生物样本，冷冻保存的方法通常只能采用玻璃化法，玻璃化法是一种利用较高的抗冻剂浓度与极快的降温速率，使溶液达到无冰晶的玻璃化状态，从而减少生物样品受到的机械损伤的一种方法。该方法因其简便、快速、低成本以及更好地保护胚胎避免受到冷冻带来的细胞损伤已被广泛采用。Zhang等人使用含有丙二醇、甲醇、甘油、蔗糖的冷冻保护剂对石斑鱼胚胎进行了超低温保存的初步研究,得到了6.32％的存活率，存活胚胎中有39.85％最终孵化成功。丁等人采用程序降温方法和玻璃化方法对真鲷胚胎冷冻进行保存，取得液氮区胚胎冷冻复活的突破性进展,然后通过检测胚胎存活率，得到结果丙二醇对真鲷胚胎的毒性最低，毒性最高的为甲醇。

中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林和田永胜教授曾发表关于海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法。方案如下：鱼类胚胎收集：选用出膜前期的胚胎；玻璃化液配制：是基础液和抗冻剂的混合液，基础液(BS2)为：NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl

由于现有技术缺少针对淡水经济鱼类蒙古鲌胚胎的冷冻保存技术；同时，现有技术采用0.25mL麦管保存鱼类胚胎，保存方式粗糙，降温升温无法做到均匀稳定，保存效果不佳。另外，现有技术无法完全避免玻璃化溶液复温过程中的重结晶现象，实验结果存在偶然性，可重复性较差。

发明内容

针对现有技术缺乏针对淡水经济鱼类蒙古鲌的胚胎的冷冻保存技术的问题，本发明提供一种蒙古鲌胚胎冷冻保存液试剂盒及冷冻保存方法，以克服现有技术的不足。

一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，包括如下步骤：

(1)蒙古鲌胚胎先后在平衡液一ES1和平衡液二ES2中，分别平衡8-12min；

将冷冻保护剂与稀释液按1：1.8-2.4体积比混合配制平衡液一；将冷冻保护剂与稀释液按1.8-2.4:1体积比混合配制平衡液二；

所述稀释液以水作为溶剂，含有6-10g/L氯化钠、0.3-0.7g/L氯化钾、12-18g/L葡萄糖；

所述冷冻保护剂以水为溶剂，含有体积分数8％-15％甲醇、体积分数10％-20％丙二醇、体积分数10％-20％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/L氯化钠、0.2-0.4g/L氯化钾、7-11g/L葡萄糖、0.5-1.5mmol/L褪黑素和0.5-1.5mg/L Fe

(2)蒙古鲌胚胎转移至冷冻保护剂CPA中，收集单个蒙古鲌胚胎，置于液氮冷却的金属块上8-12s，放于冻存容器内并封口，保存于液氮中。

优选的，所述的蒙古鲌胚胎处于尾芽期。

Fe

优选的，可以用上述稀释液为溶剂，加入甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、褪黑素和Fe

优选的，所述稀释液含有7-9g/L氯化钠、0.4-0.6g/L氯化钾、14-16g/L葡萄糖。所述冷冻保护剂含有体积分数9％-12％甲醇、体积分数12％-16％丙二醇、体积分数12％-16％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/L氯化钠、0.2-0.4g/L氯化钾、8-10g/L葡萄糖、0.8-1.2mmol/L褪黑素和0.8-1.2mg/L Fe

优选的，步骤(1)中，所述平衡液一由冷冻保护剂与稀释液按1：2体积比混合而成；所述平衡液二由冷冻保护剂与稀释液按2:1体积比混合而成。

在本发明的一个优选方式中，所述的稀释液以水作为溶剂，含有8g/L氯化钠、0.5g/L氯化钾和15g/L葡萄糖。

所述的冷冻保护剂含有体积分数15％二甲基亚砜、体积分数10％甲醇、体积分数15％丙二醇、1mmol/L褪黑素和1mg/L Fe

步骤(2)中，优选的，使用冷冻钩收集单个蒙古鲌胚胎；所述的冻存容器优选为冷冻环套。收集的蒙古鲌胚胎放在置于液氮冷冻中的金属块上，降温10s，插到已放置在液氮上进行冷冻的冷冻环套中，热机封口，放入液氮罐速冻保存；以液滴的形式保存单个胚胎。金属块可以选用铝合金金属块。

本发明提供了一种蒙古鲌胚胎冷冻保存试剂，包括稀释液和冷冻保护剂中的至少一种。

所述稀释液以水作为溶剂，含有6-10g/L氯化钠、0.3-0.7g/L氯化钾、12-18g/L葡萄糖；

所述冷冻保护剂含有体积分数8％-15％甲醇、体积分数10％-20％丙二醇、体积分数10％-20％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/L氯化钠、0.2-0.4g/L氯化钾、7-11g/L葡萄糖、0.5-1.5mmol/L褪黑素和0.5-1.5mg/L Fe

优选的，所述稀释液含有7-9g/L氯化钠、0.4-0.6g/L氯化钾、14-16g/L葡萄糖。所述冷冻保护剂含有体积分数9％-12％甲醇、体积分数12％-16％丙二醇、体积分数12％-16％二甲基亚砜，并含有3.5-5.0g/L氯化钠、0.2-0.4g/L氯化钾、8-10g/L葡萄糖、0.8-1.2mmol/L褪黑素和0.8-1.2mg/L Fe

作为优选，所述稀释液以水作为溶剂，含有8g/L氯化钠、0.5g/L氯化钾和15g/L葡萄糖。所述冷冻保护液以上述稀释液为溶剂，其体积分数为60％，加入甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、褪黑素和Fe

使用时可以将稀释液和冷冻保护剂混合，分别配置平衡液一和平衡液二。

将稀释液和冷冻保护剂CPA按1.8-2.4：1体积比混合，可以配制平衡液一，

优选的，稀释液和冷冻保护剂CPA按2：1体积比混合，配制平衡液一。

将稀释液和冷冻保护剂CPA按1：2体积比混合，可以配制平衡液二；

优选的，稀释液和冷冻保护剂CPA按1：2体积比混合，配制平衡液二。

上述方法对蒙古鲌胚胎进行冷冻保存后，进行解冻的方法为：冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.4-0.6mol/L和0.15-0.35mol/L蔗糖溶液中，室温平衡8-12min，最后转移至上述稀释液中。

优选的，冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.45-0.55mol/L和0.2-0.3mol/L蔗糖溶液中，室温平衡9-11min。

在本发明的一个优选方式中，冷冻的蒙古鲌胚胎依次置于0.5mol/L和0.25mol/L蔗糖溶液中，室温平衡时间均为10min。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种蒙古鲌胚胎冷冻保存方法，采用多种溶剂和抗氧化剂褪黑素混合的冷冻保存液配方，降低了单一有机溶剂的毒性，减少了细胞受到的毒性损伤和在冷冻保存过程重点氧化损伤，提高了冷冻保存的效果，胚胎孵化率达到19.57％。

本发明在冷冻保护剂中添加Fe

本发明采用固体表面玻璃化法，以液滴的形式保存单个胚胎，流程更加精细化，确保每颗胚胎的升降温过程都能做到温度变化均一，提高保存效果和保存方案的可重复性。

附图说明

图1为使用冷冻环挑取单个蒙古鲌尾芽期胚胎；

图2为将冷冻环置于金属块降温；

图3为将冷冻环插入冷冻环套；

图4为用热封口机将冷冻环套封口；

图5为解冻复苏后孵化成功的蒙古鲌幼鱼。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例及对比例作详细说明：

实施例1：使用本发明的蒙古鲌胚胎冷冻保存技术，保存胚胎并检测存活情况，具体如下：

步骤1)：稀释液的配制，溶质添加顺序无特别要求，配方如表1：

表1稀释液的成分及用量

步骤2)：冷冻保护剂(CPA)的配制，溶剂为步骤1)配制的稀释液，溶质添加顺序无特别要求，配方如表2：

表2冷冻保护剂(CPA)配方

注：Fe

步骤3)：平衡液ES1与ES2的配制，将步骤2配制的CPA与步骤1配制的稀释液按照1:2的比例混合，得到三分之一CPA浓度的平衡液ES1；将步骤2配制的CPA与步骤1配制的稀释液按照2:1的比例混合，得到三分之二CPA浓度的平衡液ES2。

步骤4)：收集蒙古鲌胚胎，观察胚胎发育过程，挑选尾芽期胚胎用于冷冻保存。

步骤5)：将降温用铝合金制冷冻金属块置于液氮中，并将冷冻环套插入液氮中。

步骤6)：将蒙古鲌尾芽期胚胎转移至平衡液ES1中，平衡10min后再转移到平衡液ES2中平衡10min，最后转移到冷冻保护剂CPA中。

步骤7)：用冷冻环挑取单个蒙古鲌尾芽期胚胎，如图1；迅速置于金属块上降温10s进行玻璃化，如图2；然后插入冷冻环套中，整个过程均在液氮上进行，如图3。单个胚胎以液滴形式进行保存。

步骤8)：用热封口机将冷冻环套封口，如图4，然后转移至液氮罐中保存。

胚胎在液氮中冷冻10-30s后取出，按照以下方法解冻并继续孵化。

A)从液氮中取出保存有蒙古鲌胚胎的冷冻环套，用剪刀剪开封口处，取出冷冻环，迅速插入28℃的0.5mol/L蔗糖溶液中，室温平衡10min。

B)将蒙古鲌胚胎转移至0.25mol/L蔗糖溶液中，室温平衡10min，最后转移至稀释液中。

解冻的蒙古鲌胚胎在养殖水中继续孵化，不同批次的蒙古鲌胚胎冷冻保存后存活率结果见表3。

表3蒙古鲌胚胎冷冻保存后存活率

冻存后孵化蒙古鲌幼鱼图片，见图5。

本发明在蒙古鲌胚胎冷冻保存过程中，采用固体表面玻璃化法，以液滴的形式保存单个胚胎，流程更加精细化，确保每颗胚胎的升降温过程都能做到温度变化均一，提高蒙古鲌胚胎保存效果和保存方案的可重复性。