菲利普孢囊线虫感病相关的小麦基因TraesCS3B23、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菲利普孢囊线虫感病相关的小麦基因TraesCS3B23、编码蛋白及其应用。

背景技术

小麦孢囊线虫(cereal cyst nematodes，CCN)是一类危害禾谷类作物的重要病原线虫，主要由12个有效种及几个未知种组成，其中禾谷孢囊线虫（

虽然我国禾谷孢囊线虫比菲利普孢囊线虫分布更为广泛，但菲利普孢囊线虫比禾谷孢囊线虫毒力更强，对小麦根系的侵染周期更长，同时可诱发多种小麦土传真菌病害，对小麦造成的危害更大。在对河南省18个地市的调查中发现，菲利普孢囊线虫在16个地市发生危害，占调查地区的88.89%。在对河南许昌地区的调查中发现，许昌地区菲利普孢囊线虫存在冬前侵染现象，并在12月下旬可见明显白雌虫，菲利普孢囊线虫检出率占孢囊样品总数的91.67%。菲利普孢囊线虫侵染小麦后严重影响了小麦的生长发育，致使小麦植株萎蔫发黄、分蘖减少甚至枯死，造成小麦减产。菲利普孢囊线虫已成为河南省小麦生产的一种重要的新型土传病害，具有严重的潜在威胁。

在自然界中，植物会受到多种病原菌的攻击，细菌可以通过气孔、排水器或者伤口侵入植物细胞，并在细胞间隙增殖；线虫和蚜虫通过针刺直接从植物细胞吸取营养；真菌则可以直接侵入植物表皮细胞，甚至将菌丝延伸到细胞顶部、细胞之间直至整个细胞。与动物不同，植物缺少可移动的防御系统和自我适应的免疫系统。因此，植物只能依赖于自身免疫系统以及体内的分子信号途径来抵御病原菌的侵染。在实际农业生产中，利用植物自身的抗性是防治植物病害最经济、有效的途径。近年来，随着分子生物学的发展和对植物抗病机制的研究，学者己经对一些主要农作物的重要抗病基因进行了克隆和遗传学研究。而抗病基因的成功克隆和对功能的深入剖析，大大加深了人们对植物抗病性的认识，也更进一步促进了人们对抗病机制的研究，同时为利用基因工程手段控制植物病害开辟了新途径。抗病基因的成功克隆和对功能的深入剖析，大大加深了人们对抗病性的认识，也促进了人们对抗病机制的研究，同时为利用基因工程手段培育抗病小麦品种提供强有力的理论基础和技术支持。

发明内容

本发明提供一种小麦基因TraesCS3B23及其编码蛋白，试验表明该基因与菲利普孢囊线虫的抗病性相关，可用于植物抗菲利普孢囊线虫的靶基因。

本发明小麦基因TraesCS3B23，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述小麦基因TraesCS3B23的编码蛋白，以下称TraesCS3B23蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

TraesCS3B23基因或蛋白在抑制菲利普孢囊线虫对植物的寄生与危害，或抑制菲利普孢囊线虫对植物的致病性，或抑制菲利普孢囊线虫发育中的应用。

所述菲利普孢囊线虫为菲利普孢囊线虫二龄时期、三龄时期或四龄时期。

所述植物为小麦或大麦，如小麦矮抗58、大麦Morex。

本发明在小麦中发现了TraesCS3B23蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，并确定编码该蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。实验表明，在感染菲利普孢囊线虫的小麦植株根部，该TraesCS3B23蛋白表达量更高，表明该TraesCS3B23蛋白与感染菲利普孢囊线虫相关。

本发明具有以下积极有益效果：

利用VIGS技术沉默植物植株的TraesCS3B23基因后，接种菲利普孢囊线虫7 d后与清水对照组相比，根内二龄幼虫数量显著降低，50 d后根部白雌虫调查数据显示沉默植株产生的白雌虫数量明显低于对照，多次试验结果证实了TraesCS3B23基因与菲利普孢囊线虫致病性相关，发挥着重要的作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因，对于菲利普孢囊线虫致病机理及其防治具有重要价值。

附图说明

图1 为

图2 为

图3 为VIGS沉默

图中A：VIGS沉默后

图4 为济麦22突变体对

图中A：接种7 d和14 d后，不同处理对线虫侵染量影响，B：接种14 d后，不同处理对线虫发育影响，C：接种50 d后，不同处理对白雌虫数量影响。图中数据为平均值±标准误。

实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明均为市售。本申请所用试验材料均可对公众发放。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取其平均值。

实施例

TraesCS3B23

1、取2 cm长的小麦叶片于2 mL无RNA酶离心管中，立即采用Trizol法进行小麦总RNA的提取，利用SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System试剂盒反转录得到cDNA。

2、以cDNA为模板，采用上游引物TraesCS3B23-F：5’-ATGGCCACGGCCGGGGTC-3’、下游引物TraesCS3B23-R：5’-AATGTAACCACCGCCGCCA-3’进行PCR扩增。扩增体系为：KOD OneTMPCR Master Mix，25µL；正向引物 (10 mmol/L)，反向引物 (10 mmol/L) 各1µL；cDNA第一链模板，4µL；ddH

3、使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收DNA，然后进行T载体的连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落送测序，见SEQ ID NO：1。测序结果表明，扩增产物中具有序列表的SEQ ID NO：1所示的开放阅读框，编码序列表的SEQ ID NO：2所示的蛋白质，将序列表的序列2命名为TraesCS3B23蛋白，将其编码基因命名为

实施例

TraesCS3B23

1、将大量菲利普孢囊线虫的孢囊置于100目纱网上，平铺于9cm玻璃皿中，加入适量无菌水，于16℃温箱中黑暗条件下孵化，3d后收集孵化池中的2龄幼虫（J2），并配制成500条/mL的悬浮液备用。

2、选取菲利普孢囊线虫感病品种矮抗58进行催芽，待小麦根长为2-3cm时，在高15cm、直径3cm的PVC管中加入100mL灭菌沙土（V沙：V土=1 : 3），每管播种1粒小麦，并在其根部加入1mL线虫悬浮液（500条/mL），表层覆盖2cm沙土后于光照培养箱中（白天：黑夜=16h：8h）18/14℃培养。在接种后3d、5d、7d、10d和15d取小麦的根部、茎部和叶部样品，以不接菲利普孢囊线虫的小麦根部、茎部和叶部作为对照。将小麦根系用无菌水冲洗干净后放置在灭过菌的滤纸上吸干水分，用液氮冷冻后，立即放入-80℃冰箱中保存，每个处理3个重复。

3、采用Trizol法进行小麦总RNA的提取，利用SuperScript™ IV First-StrandSynthesis System试剂盒反转录得到cDNA。

4、实时荧光定量检测小麦

5、qRT-PCR的结果如图2所示，

实施例

利用VIGS技术沉默

1、根据TraesCS3B23基因的cDNA序列设计引物，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，并在引物的5’端前加上PacI和NotI的酶切位点和保护性碱基，正向引物的5’端前加CCTTAATTAA，反向引物的5’端前加TATGCGGCCGC。

VIGS引物序列如下：

V23-1F：5’-

V23-1R：5’-

V23-2F：5’-

V23-2R：5’-

V23-3F：5’-

V23-3R：5’-

2、重组载体的构建

用上述特异性引物扩增

3、载体线性化

提取病毒载体α、β、γ0、γ-PDS及重组γ质粒。α、γ0质粒用MluI；β质粒用SpeI；γ-PDS及重组γ质粒用BssHII分别进行酶切。37℃孵育2 h，取0.5 μL稀释后电泳检测，确定线性化完全。65℃温育15 min使酶失活。

4、体外转录

使用RiboMAX

5、取α、β、γ0（或重组的γ）体外转录产物各2.5 mL，按1：1：1比例混合，用DEPC处理水等体积稀释，取2.5 mL混合液加入45 μL FES缓冲液，取8-10 mL混合物摩擦幼苗第二叶叶片3次。接种后喷少许DEPC处理水，室温保持23 ± 2˚C，保湿、避光24 h，再进行正常16/8 h光暗周期培养。每次独立实验均设置接FES缓冲液的阴性对照、γ0空白对照及γ-PDS阳性对照，定期观察病毒侵染症状及PDS表型。

6、在小麦接种病毒后10 d，观察到γ-PDS植株出现明显白化表型，取样检测

7、结果表明，与WT和γ0相比，沉默植株的

由此证明

实施例

利用六倍体小麦济麦22突变体验证

1、将候选基因在济麦22基因突变库（http://39.98.48.156:8822/#/）中比对，找到

2、对突变体小麦种子进行催芽，待小麦根长为2-3 cm时，在高15 cm、直径3 cm的PVC管中加入100 mL灭菌沙土（V沙：V土=1 : 3），每管播种1粒小麦，并在其根部加入1 mL线虫悬浮液（500条/mL），表层覆盖2 cm沙土后于光照培养箱中（白天：黑夜=16 h : 8 h）18/14℃培养。

3、接种7 d、14 d后分别取各处理3株小麦进行酸性品红染色，显微镜下统计根内线虫数量，50 d后使用简易漂浮法收集白雌虫，显微镜下计数。

4、结果表明：与野生型济麦22植株相比，7 d时突变体植株线虫侵染量无显著差异（图4中A），14 d时突变体植株线虫侵染量无显著差异（图4中A），但14 d时突变体植株J2向J3转化率明显降低（图4中B），50 d时白雌虫形成数显著下降（图4中C），下降了65.31%，植株抗病能力明显增强。

由此证明，