一种同时检测多种水溶性维生素的方法及应用

技术领域

本发明涉及水溶性维生素的检测技术领域，尤其涉及一种同时检测多种水溶性维生素的方法及应用。

背景技术

水溶性维生素主要包括维生素B

随着现代分析技术的发展，采用高效液相色谱法、液相-质谱联用法可同时测定多种水溶性维生素，但品种一般不全，且许多需要使用辛烷磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵等离子对试剂，离子对试剂不仅损害仪器、色谱柱，且色谱柱不易平衡，易造成保留时间漂移和洗脱顺序发生变化，影响测定结果的准确性和重现性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种同时检测多种水溶性维生素的方法，该方法重现性良好，准确可靠，能够同时检测至少13种水溶性维生素。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种同时检测多种水溶性维生素的方法，包括以下步骤：

制备混合标准工作液，所述混合标准工作液中包括L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、维生素B

利用高效液相色谱仪-二极管阵列检测器对所述混合标准工作液进行检测，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以磷酸二氢钾溶液为流动相B进行梯度洗脱，得到每种水溶性维生素的浓度与峰面积之间对应的标准曲线；

取供试品溶液，利用高效液相色谱仪-二极管阵列检测器在相同的条件下进行检测，得到所述供试品溶液中每种水溶性维生素的检测峰面积，根据所述标准曲线得到所述供试品溶液中每种水溶性维生素的浓度。

在一种实施方式中，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～5min，流动相A为0，流动相B为100％；

5min～15min，流动相A从0→15％，流动相B从100％→85％；

15min～25min，流动相A从15→33％，流动相B从85％→67％；

25min～35min，流动相A从33％→10％，流动相B从67％→90％；

35min～40min，流动相A从10％→0％，流动相B从90％→100％。

在一种实施方式中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.05mol/L～0.15mol/L。

在一种实施方式中，所述磷酸二氢钾溶液的pH值为2.7～2.8。

在一种实施方式中，进行梯度洗脱时，流动相的流速为0.5mL/min～0.6mL/min。

在一种实施方式中，进行梯度洗脱时，柱温为28℃～30℃。

在一种实施方式中，每种水溶性维生素的检测波长如下：

泛酸、生物素的检测波长为205nm；

L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸的检测波长为260nm；

维生素B

吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、叶酸的检测波长为290nm；

维生素B

在一种实施方式中，采用下述方法完成制备混合标准工作液：

取L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、维生素B

取维生素B

取泛酸、生物素、维生素B

取叶酸与氨水混合，制得混合液D；

将所述混合液A、混合液B、混合液C、混合液D混合，即得所述混合标准工作液。

在一种实施方式中，所述供试品溶液采用下述方法制得：

取维生素B

取L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸样品，与偏磷酸溶液混合，超声处理后过滤即得；

取泛酸、生物素和维生素B

取叶酸样品与氨水混合，超声处理后过滤即得。

在一种实施方式中，所述超声处理中，功率为400W～600W，处理时间为20min～30min。

本发明还提供了上述的同时检测多种水溶性维生素的方法在(1)中的应用：

(1)同时检测样品中L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、维生素B

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明建立了一种同时检测多种水溶性维生素的方法，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)，以乙腈-磷酸二氢钾梯度洗脱条件来实现多种水溶性维生素的同时分离测定，以解决同时测定的水溶性维生素种类偏少、不全面、普通紫外检测器灵敏度低及因离子型试剂使用色谱柱较难平衡，指标成分保留时间易漂移，色谱柱易损耗寿命短等问题。

附图说明

图1是梯度洗脱条件1的色谱图；

图2是梯度洗脱条件2的色谱图；

图3是梯度洗脱条件3的色谱图；

图4是梯度洗脱条件3的色谱图的局部图；

图5是梯度洗脱条件4的色谱图；

图6是梯度洗脱条件5的色谱图；

图7是梯度洗脱条件6的色谱图；

图8是流速为0.4ml/min的色谱图；

图9是流速为0.5ml/min的色谱图；

图10是流速为0.6ml/min的色谱图；

图11是柱温为25℃的色谱图；

图12是柱温为28℃的色谱图；

图13是柱温为30℃的色谱图；

图14是空白溶液的专属性考察色谱图；

图15是混合对照品溶液的专属性考察色谱图；

图16是供试品溶液的专属性考察色谱图。

具体实施方式

为使目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

1仪器、试剂和试药

仪器：高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(1260，安捷伦公司)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂[ShimadzuShim-packScepterC18-120(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱]；万分之一电子分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，十万分之一电子分析天平(XS105DU，梅特勒-托利多公司)，数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)。

试剂：盐酸(广州化学试剂厂)、氨水(西陇科学股份有限公司)分析纯；磷酸(科密化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)为色谱级，水为纯净水(华润怡宝饮料(控股)有限公司)。

试药：磷酸二氢钾(上海麦克林生化科技有限公司)分析纯；维生素B

2色谱条件

对梯度洗脱、流速、柱温、波长进行考察，确定最佳的色谱条件。

(1)梯度条件的考察

以乙腈为流动相A，以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值至2.7～2.8)为流动相B，流速0.5ml/min，柱温30℃，按表1-表6中6个不同的梯度条件进行考察，测试结果见图1-图7，由图可知，梯度洗脱条件1的各组分未达到分离；梯度洗脱条件2的各组分未达到分离；梯度洗脱条件3色谱图中除吡哆醇与烟酰胺分离度达不到要求，吡哆醇与烟酰胺分离度仅为0.33，其余各组分基本达到较好的分离；梯度洗脱条件4色谱图的吡哆醇与烟酰胺分离度为1.02，达不到要求；梯度洗脱条件5色谱图的吡哆醇与烟酰胺分离度为0.51，达不到要求；梯度洗脱条件6的吡哆醇与烟酰胺分离度有了明显的提高，为1.34；根据特征峰分离效果，选择梯度洗脱条件6。

表1梯度洗脱条件1

表2梯度洗脱条件2

表3梯度洗脱条件3

表4梯度洗脱条件4

表5梯度洗脱条件5

表6梯度洗脱条件6

(2)流速的考察

以乙腈为流动相A，以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.7～2.8)为流动相B，按梯度洗脱条件6，柱温30℃，流速分别为0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min。测试结果见图8-图10，由图可知，流速为0.4ml/min时，吡哆醇与烟酰胺分离度为0.37，达不到要求；流速为0.5ml/min时，吡哆醇与烟酰胺分离度为1.44；流速为0.6ml/min时，吡哆醇与烟酰胺分离度为1.44；根据特征峰分离效果，选择流速为0.5ml/min。

(3)柱温的考察

以乙腈为流动相A，以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.7～2.8)为流动相B，按梯度洗脱条件6，流速0.6ml/min，柱温分别为25℃、28℃、30℃。测试结果见图11-图13，由图可知，柱温为25℃时，吡哆醇与烟酰胺分离度为1.34；柱温28℃时，吡哆醇与烟酰胺分离度为1.56，达到要求；柱温30℃时，吡哆醇与烟酰胺分离度为1.44；根据特征峰分离效果，选择柱温为28℃。

(4)波长的考察

各组分由DAD检测器在190～500nm波长范围内扫描，获得各组分的吸收光谱图，泛酸的光谱在202nm处有强吸收峰、生物素的光谱在200nm处有强吸收峰，L(+)-抗坏血酸的光谱在252nm处有强吸收峰，D-异抗坏血酸的光谱在252nm处有强吸收峰，维生素B

(5)色谱条件的确定

综合梯度洗脱条件、流速、柱温及波长考察结果，确定最佳色谱条件为梯度洗脱条件6，柱温为28℃，流速为0.5ml/min，具体如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至2.7～2.8)为流动相B，按表7中的规定进行梯度洗脱；流速为0.5ml/min；柱温28℃进行梯度洗脱；进样量10μl；泛酸、生物素检测波长为205nm；L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸检测波长为260nm；维生素B

表7确定的梯度洗脱条件

3标准储备液的制备

储备液A：精密称取L(+)-抗坏血酸33.125mg、D-异抗坏血酸28.05mg、维生素B

储备液B：精密称取维生素B

储备液C：精密称取泛酸29.3mg、生物素4.34mg和维生素B

储备液D：精密称取叶酸2.78mg，置25ml容量瓶中，加0.5％氨水溶液，制成每1ml各含105.4176μg的溶液，即得。

4标准系列工作溶液的制备

储备液A、B、C、D各精密吸取0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml分别置于10ml的容量瓶中，用水稀释至刻度，即得系列混合标准工作液，经0.45μm的水相微孔滤膜过滤备用。

5供试品溶液的制备

维生素B

L(+)-抗坏血酸、D-异抗坏血酸：取均匀样品0.05-0.2g，精密称定，置50ml棕色容量瓶，加入20g/L偏磷酸溶液约30ml，超声(功率500W)20min，放冷，加20g/L偏磷酸溶液定容至刻度，摇匀离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

生物素和维生素B

泛酸：精密量取“生物素和维生素B

叶酸：取均匀样品0.5-1g，精密称定，置50ml棕色容量瓶，加入0.5％氨水溶液约30ml，超声(功率500W)20min，放冷，加水定容至刻度，摇匀离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

6方法学验证

(1)专属性考察

取试剂空白、混合标准溶液及供试品溶液，按照“2(5)”项下色谱条件进样测定，结果见图14～图16，结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，且阴性空白无干扰，说明该方法专属性良好。

(2)线性考察

分别精密吸取“4”项下系列混合标准工作液，注入液相色谱仪，分别以13种水溶性维生素的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制系列标准曲线。结果见表8，结果表明，各组分在上表线性范围内各浓度与峰面积线性关系良好。

表8 13种维生素的线性回归方程、线性关系和线性范围

(3)精密度考察

分别精密吸取“4”项下混合标准工作液，按照“2(5)”项下色谱条件重复进样6次，进样体积10μl，测定各组分的峰面积，分别计算峰面积RSD，结果见表9，结果表明，各组分精密度的RSD均小于3％，说明仪器精密度良好。

表9 13种维生素的精密度考察结果汇总表

(4)重复性考察

取复配维生素(GlanbiaRE35490/A)(批号：FS2304004)分别按“5”制备“L(+)-抗坏血酸、维生素B

表10多种维生素的重复性考察结果汇总表

7样品测定

取复配维生素(Glanbia RE35490/A)(批号：FS2304004)，复合维生素(瑞普221025B-02-20)(批号：FS2302027)；多种维生素矿物质片(批号：YF23032405)；维生素B片(批号：YF23032404)样品按“5”项下的供试品溶液制备方法，制备相应的供试品溶液，按“2(5)”项下的色谱条件，将上述供试品溶液进样测定，记录供试品溶液的色谱图各组分的峰面积，根据“6(2)”项下绘制的标准曲线得到供试品溶液中各水溶性维生素的浓度。结果见11。

表11各组分检测结果汇总表

综上，本发明能实现药品、保健食品及普通食品中维生素B

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为保护范围。