鉴别中华拟迷孔菌的分子标记、引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于真菌的生物学检测技术领域，尤其涉及一鉴别中华拟迷孔菌的分子标记、引物组、试剂盒及方法。

背景技术

木材腐烂真菌可以通过菌丝体在木材中传播并分泌一系列酶来分解木材中相互缠绕的长链大分子纤维素、半纤维素和木质素。同时，真菌可以利用产生的淀粉和糖作为满足自身生长和繁殖的营养。木材腐烂真菌有具有重要的生态、经济、食用、药用价值。首先，一些小分子木材腐烂真菌降解的物质可用于工业生产，例如：生物乙醇生产；此外，木材腐烂真菌产生的酶系统降解过程有多种应用，例如：漆酶可用于降解污染物，还可以合成抗生素、氨基酸和其他大分子化合物。其次，许多木材腐烂真菌既可以食用，又可以入药。再次，木材腐朽真菌是森林生态系统的重要组成部分，在退化和减量化方面发挥着重要作用。

中华拟迷孔菌(Daedaleopsis sinensis(Lloyd)Y.C.Dai)是戴玉成教授于1996年根据长白山地区调研结果发表并命名的新种，是自然界中很常见一种白腐真菌，主要分布于黑龙江、吉林等地天然林中，主要感染桦树和赤杨树的树干，导致木材白色腐烂，野生中华拟迷孔菌如图1所示。目前，我国拟迷孔菌属物种有5种，包括：中华拟迷孔菌(Daedaleopsis sinensis(Lloyd)Y.C.Dai)、裂拟迷孔菌(Daedaleopsis confragosa(Bolton)J.

因此，研发快速、定量检测中华拟迷孔菌及其相关制品的真伪及含量技术对产业的健康发展具有重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供能够用于快速检测中华拟迷孔菌子实体、菌株及相关制品的分子标记，该分子标记的特征性核苷酸序列来源于中华拟迷孔菌的基因组序列(NCBI:GCA_033807695.1)，定位9号染色体(chromosome 9：206510-206909)。该分子标记序列为中华拟迷孔菌特有，共包含400个碱基。在此基础上，本发明还进一步筛选设计了特异性的引物组，提供了相关检测试剂盒及方法，实现了对中华拟迷孔菌的特异性检测。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

一个方面，本发明提供鉴别中华拟迷孔菌的分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，具体为：

ATGCACGCACGCACGCACGCACCTCGTACGTCGCTCCCCGCCGTTCCCATACCGCCGCT

CACCGACACGGTCTGTGCCCAGCCGTGGCCCGACGTACGCGGATCGTCGCCGATGCTGA

CATGAACGACAGCCTGCGATACGCGGGACGCGCCGGCGCACGCGCGCGCGCGACATCT

GCAGGGGATCGCAGGATCGCAGACGGGTGAGTCCCGCGTGCACTCGCCACCGGGCACC

GAGTACCGAGTACTGAGCGGCCTCTCCCGATAGGCAGCATGTGCTCGCCAGCGGACGGA

CAGGTGAGACTGCGCACGGTCGAGAGCGCAGAGCGCTGACGGACCGACCACCAGGCCGGGGGGCCCGCGCGGGCACGTATCGCTGTTCGCGAGGGGACACGGGGTGA。经NCBI比对可知，与该鉴别中华拟迷孔菌的分子标记相比，拟迷孔菌属其他物种及其他属物种都没有相同或高度相似的序列，如图2-a)所示，仅1条序列(兴透翅蛾属)有34个碱基相似，如图2-b)所示。

另一个方面，本发明还提供鉴别中华拟迷孔菌的引物组，包括上游引物SinF和下游引物SinR；所述SinF的核苷酸序列为ACAGCCTGCGATACG，即SEQ ID NO.2；所述SinR的核苷酸序列为GCGAACAGCGATACG，即SEQ ID NO.3。

再一个方面，本发明还提供鉴别中华拟迷孔菌的试剂盒，包括所述的引物组。

优选地，所述的鉴别中华拟迷孔菌的试剂盒，还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR反应试剂。

更优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包括Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP、DNA模板和MgCl

相应地，本发明还提供鉴别中华拟迷孔菌的方法，包括如下步骤：

S1：提取待测样品，得到DNA样品液；

S2：以所述DNA样品液作为PCR扩增的模板，将所述的引物组作为扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S3：将所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

优选地，所述PCR扩增的反应条件包括：94℃预变性4min；94℃变性30s、46℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

优选地，所述步骤S3中，若样品的电泳检测结果出现257bp片段，则该样品为中华拟迷孔菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明提供能够用于快速检测中华拟迷孔菌(包括菌株、子实体及其相关制品)的分子标记，该分子标记为中华拟迷孔菌特有，经NCBI比对可知，拟迷孔菌属其他物种及其他属物种都没有相同或高度相似的序列。

(2)本发明基于发现的鉴别中华拟迷孔菌的分子标记，进一步设计了包括上游引物SinF和下游引物SinR的引物组，SinF和SinR的退火温度相近，且引物组不与裂拟迷孔菌、紫色拟迷孔菌、三色拟迷孔菌和海南拟迷孔菌发生反应，仅与中华拟迷孔菌有极高的结合特异性，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测可检测出荧光条带。更进一步地，本发明还包括引物组的鉴别中华拟迷孔菌的试剂盒，特异性好，使用方便。

(3)本发明还提供了鉴别中华拟迷孔菌的方法，方法简单，特异性好，检测用时短(1h内可完成)，利用本发明提供的特异性引物组，通过PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳检测可以快速的对中华拟迷孔菌(包括菌株、子实体及其相关制品)进行鉴别，无须测序。

附图说明

图1野生中华拟迷孔菌的示意图。

图2本发明提供的鉴别中华拟迷孔菌的分子标记进行NCBI比对的结果示意图。

图3本发明提供的鉴别中华拟迷孔菌的分子标记序列及第一引物组的位置关系图。

图4利用本发明提供的引物组进行PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，1为中华拟迷孔菌，2为裂拟迷孔菌，3为紫色拟迷孔菌，4为三色拟迷孔菌，5为海南拟迷孔菌，M为Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中，所涉及的试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。

实施例1鉴别中华拟迷孔菌的引物组

根据本发明提供鉴别中华拟迷孔菌的分子标记，筛选设计了鉴别中华拟迷孔菌的第一引物组和第二引物组。第一引物组包括上游引物SinF和下游引物SinR；所述SinF的核苷酸序列为ACAGCCTGCGATACG，即SEQ ID NO.2；所述SinR的核苷酸序列为

GCGAACAGCGATACG，即SEQ ID NO.3。设计的第一引物组和第二引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鉴别中华拟迷孔菌的分子标记序列及第一引物组的位置关系如图3所示。第二引物组包括上游引物9022FP：GAGTACCGAGTACTGAGCGG和下游引物9022RP：TCGCGAACAGCGATACGTG。

实施例2鉴别中华拟迷孔菌的方法

准备中华拟迷孔菌、裂拟迷孔菌、紫色拟迷孔菌、三色拟迷孔菌和海南拟迷孔菌5个物种子实体，用于鉴定。使用北京德曼特尔生物科技有限公司生产的快速无毒植物DNA提取试剂盒(FH Plant DNAKit)进行DNA样品液的提取：首先分别向离心管1-5中分别加入PL1缓冲液100μL，室温放置2分钟，然后加入PL2缓冲液600μL，室温放置2分钟并上下混匀数次，室温10000rpm离心30秒；用200μL移液枪将上清液分别转入DNA吸附柱1-5中，室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液；向吸附柱中加入PL2缓冲液300μL，室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液；继续向吸附柱中加入漂洗液WB 600μL，室温室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液；最后将吸附柱开盖2分钟，挥发残余酒精，继而加入65℃预热洗脱缓冲液EB 30μL，静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，洗脱DNA并保存于新的离心管1-5中，最终分别获得5种拟迷孔菌属DNA样品液。

将上述获得的5种拟迷孔菌属DNA样品液分别作为PCR扩增的模板，将实施例1设计的第一引物组(包括上游引物SinF和下游引物SinR)作为扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；反应体系为50μL总体积：DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL，上游引物SinF(10μmol/L)1μL，下游引物SinR(10μmol/L)1μL，10×Buffer 5μL，2mmol/LdNTP 5μL，25mmol/LMgCl

上述结果表明：本发明提供的第一引物组(包括上游引物SinF和下游引物SinR)特异性好，专一性强，可以用于快速鉴别中华拟迷孔菌；第二引物组虽然理论上可能具有可行性，但经实验验证，难以用于快速鉴别中华拟迷孔菌。将中华拟迷孔菌经第一引物组的特异性扩增片段送去测序，其序列与图三相符，其长度为257bp。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。