与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于动物育种、遗传学与分子生物学技术领域，具体地说，涉及用于与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用。

背景技术

家养水牛分为两种主要类型——河流型和沼泽型，我国以沼泽型水牛为主。沼泽型水牛有两种常见毛色——瓦灰色和白色，瓦灰色水牛躯体瓦灰色，四肢下部毛色较浅，呈灰白色，颈下部和胸前有浅灰色或白色条带；白色水牛数量较少，呈全身白毛带粉红色皮肤，眼珠黑色。目前为止，国内外尚未见报道水牛白毛色的遗传机制及分子标记辅助选择白毛色的方法。

水牛白毛色性状基因定位和机理研究，不仅有助于揭示被毛着色的分子机制，丰富人们对毛色形成机理的认识，还可以开发水牛毛色特征的分子标记，用于品种纯度判定和标记辅助选择，为中国水牛的保护和选育利用提供科学手段。

发明内容

本发明的目的是提供与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用。

为了实现本发明目的，本发明在中国南方水牛产区，随机采集沼泽型水牛63头，其中瓦灰色水41头，白色水牛22头。采集这些水牛的耳组织样本，通过全基因组重测序，获得覆盖全基因组SNP基因型信息，进而利用全基因组关联分析寻找与水牛白毛色性状显著相关的SNP分子标记。过程如下：(1)提取待测水牛耳组织样本的基因组DNA；(2)将水牛DNA样品通过HiSeq Xten测序平台进行全基因组重测序，所得测序数据比对到水牛参考基因组，进而获得基因型数据；(3)采用卡方检验统计方法，进行毛色表型与SNP基因型的全基因组关联分析，检测与水牛白毛色性状关联显著的SNP位点；(4)利用生物信息学工具，对显著关联的SNP位点进行基因注释。通过全基因组关联分析最终得到2个与水牛白毛色性状相关的SNP分子标记，g.19953331和g.19970628，它们分别位于水牛基因组14号染色体19953331碱基位置处和19970628碱基位置处(基因组版本号GCF_003121395.1_UOA_WB_1)，均位于ASIP基因内含子区域内。这两个分子标记分别为

(1)SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的T/C突变，或

(2)SEQ ID NO.2所示序列的第101位碱基的G/A突变。

本发明提供了用于检测所述的分子标记的特异性引物对。

本发明设计的针对上述2个分子标记的特异性引物对其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3-4，或SEQ ID NO.5-6所示。

本发明提供了上述特异性引物对在制备用于鉴定水牛白毛色或瓦灰色试剂盒中的应用。

本发明提供了上述分子标记或用于所述分子标记的特异性引物对在水牛育种、遗传改良或标记辅助选择中的应用。

本发明提供了上述分子标记或用于所述分子标记的特异性引物对在培育白毛色水牛或瓦灰毛色水牛中的应用。

本发明提供了上述分子标记或用于所述分子标记的特异性引物对在鉴定水牛白毛色基因型中的应用。

上述的应用，是对待检水牛样品的上述分子标记进行检测，可以采用本发明提供的特异性引物对，也可以采用其他特异性引物，只要能实现对本发明所述分子标记的检测即可；

当检测到SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的基因型为CC时，则待检水牛为白毛色基因纯合子，表型为白毛色；

当检测到SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的基因型为CT时，则待检水牛为白毛色基因杂合子，表型为白毛色；

当检测到SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的基因型为TT时，则待检水牛为瓦灰毛色基因纯合子，表型为瓦灰毛色。

当检测到SEQ ID NO.2所述序列的第101位碱基的基因型为AA时，则待检水牛为白毛色基因纯合子，表型为白毛色；

当检测到SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的基因型为AG时，则待检水牛为白毛色基因杂合子，表型为白毛色；

当检测到SEQ ID NO.1所述序列的第101位碱基的基因型为GG时，则待检水牛为瓦灰毛色基因纯合子，表型为瓦灰毛色。

本发明具有以下优点：本发明提供的2个与水牛白毛色表型相关的SNP分子标记可以单独或组合用于遗传学上鉴定水牛的体毛颜色，根据育种水牛目标性状的不同需要，选择白毛色基因纯合子或瓦灰毛色基因纯合子的水牛，进行分子辅助育种，为不同毛色的水牛育种提供了便捷、准确的方法。

附图说明

图1PCR产物电泳胶图，(A)为g.19953331标记PCR产物的琼脂糖电泳胶图，(B)为g.19970628标记PCR产物的琼脂糖电泳胶图。

图2为g.19953331标记CC基因型测序结果(白毛色纯合基因型)。

图3为g.19953331标记TT基因型测序结果(瓦灰毛色基因型)。

图4为g.19953331标记CT基因测序结果(白毛色杂合基因型)。

图5为g.19970628标记测序结果标记AA基因型测序结果(白毛色纯合基因型)。

图6为g.19970628标记测序结果标记GG基因型测序结果(瓦灰毛色基因型)。

图7 g.19970628标记AG基因测序结果(白毛色杂合基因型)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

实施例1与水牛白毛色表型相关的分子标记的获得

1、样本采集

在中国南方水牛产区，随机采集沼泽型水牛63头，其中瓦灰色水41头，白色水牛22头。样本为耳上皮组织，放于75％酒精的样品管中，-80℃储存。

2、水牛基因组DNA提取

(1)溶液配制：组织裂解液(1L)：1.2114g固体Tris-Base(121.1)，37.22g固体乙二胺四乙酸二钠(EDTA，372.24)，5.0g固体十二烷基硫酸钠(SDS)溶于800mL双蒸水中，完全溶解后补加双蒸水定容至1L，调节pH为8.0。

蛋白酶K溶液(20mg/mL)：100mg蛋白K黄色晶体，加5mL去离子水溶解，分装后于-20℃保存。

(2)取水牛耳组织200mg置于1.5mL离心管中，用灭菌小剪刀仔细剪碎。

(3)加600μL裂解液、5μL蛋白酶K溶液，混匀后于55℃水浴摇床中，消化过夜。

(4)将上述消化后的离心管取出，向管中加入500μL Tris饱和酚(注意将吸管伸入瓶子下层，不要吸出上层的保护液)，上下颠倒摇动离心管直至混匀。

(5)4℃，12000r/min，离心10min，吸上清至新的1.5mL离心管，弃沉淀。

(6)加250μL苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混合10min，4℃，12000r/min，离心10min，吸上清至新的1.5mL离心管，弃沉淀。

(7)加500μL氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混合10min，4℃，12000r/min，离心10min，吸上清至新的1.5mL离心管，弃沉淀。

(8)加入500μL无水乙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀后DNA呈白色絮状物析出，4℃，12000r/min，离心10min，弃上清留沉淀。

(9)再用预冷的无水乙醇漂洗一次，4℃，12000r/min，离心10min，弃上清，自然干燥DNA沉淀。

(10)加入20-100μL去离子水溶解DNA，用NanoDrop2000核酸蛋白分析仪进行质量检测，A260/A280在1.7-2.1之间，A260/A230在1.8-2.2之间，判定为质量合格，后于-20℃保存。

3、基因组测序和变异检测

对22头白色水牛和41头瓦灰色水牛通过Illumina HiSeq Xten测序平台进行全基因组重测序，目标测序深度10×。使用BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)MEM方法将测序所得reads比对到水牛参考基因(GCF_003121395.1_UOA_WB_1)上，平均比对率99.55％，覆盖度为98.27％。利用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)进行变异检测和质控，共得到34318893个SNP用于后期分析。

4、数据整理和分析

(1)基因型数据质控

利用PLINK软件(http://www.cog-genomics.org/plink2)对多态性较差和检出率较低的SNP位点进行质控，具体质控标准如下：个体检出率sample call rate＞90％；SNP检出率SNP call rate＞90％；最小等位基因频率MAF＞5％；哈代温伯格平衡HWE＞10

(2)全基因组关联分析

利用PLINK软件对两种毛色水牛进行病例-对照(Case-control)全基因组关联分析，采用基于显性遗传模型的卡方检验统计方法。Bonferroni校正0.05显著性阈值作为确定SNP位点是否达到全基因组显著的标准。

(3)SNP注释

利用SNPEFF软件(http://snpeff.sourceforge.net/)对该全基因组关联显著区域内的SNP进行注释，分析突变类型及可能的功能效应。首先利用水牛基因组FASTA文件和注释GFF文件构建水牛snpEFF注释库，利用snpEff.jar对SNP数据VCF格式文件进行注释。

5、结果分析

(1)基因型数据质控

SNP检出率SNP call rate＞90％剔除274245变异位点；哈代温伯格平衡HWE＞10

(2)全基因组关联分析

在水牛14号染色体上检测到明显的信号，最大显著性-log10(P)值12.71。Bonferroni校正0.05显著性阈值等于8.34，显著SNP数目407个，显著区域19.33-20.39Mb，该区域包含著名的毛色基因ASIP。

(3)SNP注释

鉴于ASIP基因的重要作用，本发明利用SNPEFF软件对ASIP基因附近显著SNP进行注释，该区域内共发现0.05水平显著水平SNP数目62个，7个位于基因间区，8个SNP位于上游调控区，47个SNP位于ASIP基因内含子区域。

注释的SNP中，g.19953331和g.19970628(基因组版本号GCF_003121395.1_UOA_WB_1)这两个SNP是全基因组关联分析显著性最高的位点。因此，本发明将这两个SNP作为与水牛白毛色性状相关的分子标记进行辅助选择。

实施例2SNP标记g.9953331的验证

该g.9953331位点基因分型结果如表1所示。

表1 SNP位点g.19953331基因型频率分布

*注：C-突变，T-正常。

根据本发明的数据统计结果，g.19953331标记基因型为CC时，有100％的把握可以推测该个体为白毛色，g.19953331标记基因型为CT时有95.2％(20/21×100％＝95.2％)的把握可以推测个体为白毛色，g.19953331标记基因型为TT时有100％的把握可以推测个体为瓦灰毛色。

实施例3SNP标记g.19970628的验证

该g.19970628位点基因分型结果如表2所示。

表2 SNP位点g.19970628基因型频率分布

*注：A-突变，G-正常。

根据本发明的数据统计结果，g.19970628标记基因型为AA时，有100％的把握可以推测该个体为白毛色，g.19970628标记基因型为AG时有95.2％(20/21×100％＝95.2％)的把握可以推测个体为白毛色，g.19970628标记基因型为GG时有100％的把握可以推测个体为瓦灰毛色。

因此，可以在中国水牛群体中对这个两个标记基因型检测，保留白色纯合型水牛个体，可使得白毛色基因纯合子的比例快速提高。

实施例4g.9953331和g.19970628的Sanger测序检测(1)引物设计

基于SNP标记上下游序列信息，设计特异性引物如下(5’-3’)。

表3引物序列及扩增片段长度

(2)PCR扩增

PCR反应体系：总体积25μL，其中10×Buffer 2.5μL，dNTP混合物(各2.5mM)2μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，上下游引物各(20μM)0.5μL，基因组DNA模板1μg。

PCR反应条件：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸7min。仪器为Applied Biosystems 9700型PCR仪。

(3)PCR产物的凝胶电泳检测及测序

制作浓度为2％的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物3μL点样，在TAE缓冲液中110V电压下电泳40min，在凝胶成像系统中观察电泳结果。PCR产物进行Sanger测序。

(4)PCR产物测序和基因型判定

PCR产物胶图如图1所示。图1的A是标记g.19953331，产物长度为309bp；图1的B是标记g.19970628，产物长度为368bp。M为DNA Maker，共有6条DNA片段，参照物片断(bp)：100，200，300，400，500，600。样本1和样本2为白色纯合样品，样本3和样本4为白色杂合样品，样本5和样本6为瓦灰色纯合样品。

将PCR产物进行Sanger测序，根据测序峰图可以清晰判定每个SNP标记的三种基因型。白色纯合基因型个体扩增产物核苷酸序列如图2和图5所示；瓦灰色个体扩增产物核苷酸序列如图3和图6所示；白色杂合基因型个体扩增产物核苷酸序列如图4和图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用

<130> KHP191113287.3

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> n is t or c

<400> 1

atcagggctc acagtttcag catcatctta ttatctctga atgtgggatc cccactcctc 60

acccaccctg tgcatgttct tgctatcgta tctggactta ntagttaggt ggcactagag 120

gtgaagaacc tgcctgccat aggagatgta ggagacttgg gttgggaaga tcccctggag 180

gagggcatgg caacccaccc c 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<222> (101)..(101)

<223> n is g or a

<400> 2

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ctgaaccaag gacagaactt g 201

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagggctca cagtttcagc atca 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggcttgagt gcgtgctgag t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actgacaagg gcagaggcat ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtcctttgg gctgctctgg gt 22