一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体及应用，属于生物技术领域。

背景技术

胸苷激酶1(TK1)是一种特殊激酶，催化胸苷(TdR)为1-磷酸胸苷酸(TMP)，是癌变细胞DNA合成必需的前体物，它参与DNA补救合成途径，是DNA合成的特殊标志酶。TK1是细胞周期依赖酶，主要存在于细胞质中。TK1的表达与肿瘤细胞增殖密切相关，是一种公认的细胞增殖特异性标志物，临床上用于监测、动态评估体内细胞的异常增殖速度。

健康人细胞多处于静止状态，为非增殖细胞，血清中的TK1酶含量极微，当增殖类疾病发生时，尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中TK1酶的含量出现显著升高，超过健康人平均水平2倍甚至10倍以上。所以，通过检测血清中TK1浓度水平的变化，能够敏感地发现细胞增殖异常，动态评估细胞增殖发展趋势，为提前干预治疗高风险癌前病变、遏制肿瘤进程提供重要信息。与常用的肿瘤标志物不同之处在于肿瘤标志物CEA、AFP、PSA等只能发现部分器官的临床期肿瘤，而TK1细胞增殖检查，能更准确的排查病变部位的癌变风险，是肿瘤标志物不能替代的。

目前采用影像学的肿瘤检测手段对于早期肿瘤几乎无能为力，免疫检测方法是检测血清中的TK1水平的最理想方法。无论是基于免疫组化的定性/半定量分析，还是基于ELISA和免疫化学发光的定性/定量分析，都离不开高质量的TK1特异性抗体。目前行业内应用的TK1特异性抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，前者主要是来自鸡的IgY，后者主要是来自于小鼠的IgG；而兔单克隆抗体的出现带来了许多不一样的好处，它较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点；首先，兔抗血清通常含有高亲合力抗体，可以比鼠抗血清识别更多种类的表位；其次，兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原；第三，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能；从免疫原性方面，目前主要是应用TK1蛋白中的免疫原性多肽(表位肽)，包括羧基端的多肽和氨基端的多肽，免疫鸡或者小鼠得到抗体，其中，部分抗体是应用全长的TK1蛋白作为免疫原。

综上所述，在现有技术中，尚无采用兔单克隆抗体制备技术制备TK1兔单克隆抗体的报道，因此，寻找合适的具有免疫原性的TK1抗原表位肽、利用具有免疫原性的TK1抗原表位肽，制备特异性的TK1兔单克隆抗体、以及开发定量检测TK1的试剂盒即成了重点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体，并将兔单克隆抗体应用在建立人血清中TK1的酶联免疫检测法中，同时利用兔单克隆抗体制备人血清中TK1体外检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

本发明公开一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体，利用抗原使兔源免疫产生兔单克隆抗体；所述抗原分别由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的肽或氨基酸序列为SEQ ID NO:2的肽与第一载体蛋白或第二载体蛋白偶合组成；所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B。

本发明公开如上所述的一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体在建立人血清中TK1的酶联免疫检测法中的应用。

进一步地，所述酶联免疫检测法采用双抗体夹心法进行检测；所述兔单克隆抗体A为捕获抗体；所述兔单克隆抗体B为结合抗体。

本发明还公开如上所述的一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体在制备用于检测人血清中TK1的试剂盒中的应用。

本发明还公开一种针对人血清中TK1体外检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有如上所述的兔单克隆抗体A的酶标板、结合抗体、酶标记物、显色剂、终止液、TK1标准品、洗涤缓冲液和稀释缓冲液。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的由氨基酸序列为SEQ ID NO:1的肽或氨基酸序列为SEQ ID NO:2的肽与第一载体蛋白或第二载体蛋白偶合组成的抗原，其具有良好的抗原性，使兔源免疫产生针对人血清中TK1的兔单克隆抗体，能够高度特异地与血清样本中的TK1结合，同时本发明提供的针对于人血清中TK1的兔单克隆抗体相较于现有技术中的鸡源或鼠源的单克隆抗体，具有更高的亲和力，可识别更多的新型表位、特异性较高，而且由于兔的脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能，大大降低成本。

2、本发明将针对人血清中TK1的兔单克隆抗体应用在建立人血清中TK1酶联免疫检测法中，同时也将其应用在制备检测人血清中TK1的试剂盒上，可以有效地检测血清样本中TK1的水平，可用于肿瘤的早期筛查。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但提供这些实施例是为了帮助理解本发明，本发明不限于这些实施例。

本发明公开了一种针对人血清中TK1的兔克隆抗体及应用，具体如下各实施例所述；

实施例1兔单克隆抗体制备方法

兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B通过以下方法获得：

1、抗原的制备：

用BDB法将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的肽或氨基酸序列为SEQ ID NO:2的肽分别与第一载体蛋白或第二载体蛋白偶联制备形成抗原A或抗原B，第一载体蛋白与第二载体蛋白为相同或不同的钥孔血蓝蛋白；取氨基酸序列为肽1或肽2 10.0mg，用1mL 0.1M的PBS缓冲液(pH为7.4)溶解；钥孔血蓝蛋白(KLH)10mg，用20mL 0.2M硼酸盐缓冲液(pH为8.6)溶解；然后将两者混合，冷却至0℃，取BDBCl

其中，SEQ ID NO:1：YAKDTRYSSSFCTHDRNTMEA

SEQ ID NO:2：AALDGTFQRKPFGA

2、动物免疫：

第一次免疫：取上述制备的抗原A或抗原B(l.0mg抗原/只)，将抗原A或抗原B溶于PBS缓冲液中等体积加入预先混匀的福氏完全佐剂，剧烈震荡使之充分乳化，用1mL注射器抽取乳化液，排除气泡；从笼中取出兔子用固定器固定兔子，在5个不同的部位进行皮下注射，兔脊柱两旁(颈、胸、腰椎各两点)选4-6点皮下注射；剃去兔子背部毛，碘伏消毒，将针头以相对皮肤15°进针，进针深度为l-2cm，不要刺入肌肉中，注射抗原溶液；每次注射后，将针在注射处放置10s后再轻轻拔出，并在注射处消毒，在5个部位重复上述操作；

第二次免疫(0.5mg抗原/只)：第21天(隔3周)后，福氏不完全佐剂混合量减半的相同抗原，制备方法和注射操作同第一次，但部位选择与第一次不同点，进行注射；并在注射后的第28天收集血液，收集2管抗凝流式检测用4mL，1管不抗凝ELISA检测用4mL；其操作步骤基本与耳缘静脉注射相似；

第三次免疫(0.5mg抗原/只)：第35天(隔2周后)，注射方法和剂量同第二次，并在注射后的第42天收集血液；

第四次免疫(0.5mg抗原/只)：第49天(隔2周后)，注射方法和剂量同第二次,并在注射后的56天收集血液；

3、细胞融合

四次免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，在颈动脉采全血后，无菌取脾脏；脾脏分离方法如下：先在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织。用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛，用1640培养液悬浮后离心，转速为1400rpm，离心5min，弃上清后，重复洗涤一次，再用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液，稀释后，用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×10

在细胞融合实验前一周左右，传代培养240E细胞，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的PEG，融合前取240E细胞培养上清液作为阴性上清对照；分别取2×10

4、杂交瘤细胞的筛选

融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO

5、抗体亲和性测定

采用间接竞争ELISA法进行抗体亲和性测定，将系列浓度的TK1溶液与兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B(均稀释2500倍后)同时加入到包被有包被抗原的96孔酶标板中，以抑制率为纵坐标，TK1浓度对数为横坐标绘制亲和曲线，测得达到50％抑制率时的TK1的质量浓度值(IC50值)，确定兔单克隆抗体对TK1的亲和性；

抑制率的计算公式如下：

抑制率＝100％－(OD

其中，OD

结果表明：兔单克隆抗体A达到50％抑制率时TK1的浓度是介于200pg/mL～600pg/mL之间，兔单克隆抗体B达到50％抑制率时TK1的浓度是介于100pg/mL～300pg/mL之间，说明本发明制得的兔单克隆抗体对TK1有很高的亲和力；

6、兔单克隆抗体的特异性鉴定

以ELISA进行检测兔单克隆抗体的特异性，分别以人TK1蛋白、TK2蛋白、S-100B蛋白，神经元特异性烯醇化酶NSE为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA法分别检测本发明所制备的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B与该人TK1蛋白的特异性反应，兔血清作阴性对照，PBS液作空白对照；结果表明，本发明制得的兔单克隆抗体A和兔单克隆抗体B分别只与TK1反应为阳性，而与S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE、TK2蛋白反应为阴性，说明本发明的兔单克隆抗体A和B具有特异性。

实施例2针对人血清中TK1的兔单克隆抗体建立酶联免疫检测法

酶联免疫检测法采用双抗体夹心法，本发明提供的针对人血清中TK1的兔单克隆抗体A为捕获抗体，兔单克隆抗体B经HRP标记后作为结合抗体；

酶联免疫检测法的具体步骤：

(1)使用碳酸盐缓冲液(pH为9.6，浓度0.05M)将捕获抗体进行包被，4℃孵育过夜后洗涤缓冲液洗板；

(2)用1(w/v)％BSA-0.05M封闭；

(3)将标准样品、待测样品用样品缓冲液洗涤稀释后，加入到酶标板中，常温条件下孵育30-60min，然后用洗涤缓冲液洗板；

(4)加入用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的兔单克隆抗体B，常温条件孵育30-60min，然后用洗涤液洗板；

(5)加入显色剂，常温显色15min，加终止液终止显色，然后分别于450nm和630nm下测定吸光值，OD

实施例3针对人血清中TK1的兔单克隆抗体建立酶联免疫检测法

酶联免疫检测法采用双抗体夹心法，利用现有的针对人血清中TK1的鼠单克隆抗体为捕获抗体；本发明提供的兔单克隆抗体A或B作为结合抗体。

酶联免疫检测法的具体步骤：

(1)使用碳酸盐缓冲液(pH为9.6，浓度0.05M)将捕获抗体进行包被，4℃孵育过夜后洗涤缓冲液洗板；

(2)用1(w/v)％BSA-0.05M封闭；

(3)将标准样品、待测样品用样品缓冲液洗涤稀释后，加入到酶标板中，常温条件孵育30-60min，然后用洗涤缓冲液洗板；

(4)加入用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的兔单克隆抗体A或B，常温条件孵育30-60min，然后用洗涤液洗板；

(5)加入HRP标记的山羊抗兔IgG，常温条件孵育30-60min，然后用洗涤液洗板；

(6)加入显色剂，常温显色15min，加终止液终止显色，然后分别于450nm和630nm下测定吸光值，OD

实施例4TK1体外检测试剂盒

在本实施例中，TK1体外检测试剂盒包括包被有鼠单克隆抗体的酶标板、根据实施例1制备的兔单克隆抗体、酶标记物、显色剂、终止液、TK1标准品、洗涤缓冲液和稀释缓冲液；

TK1体外检测盒的制备和操作如下：

1.各种缓冲液及试剂的配制：

A、包被缓冲液：浓度为0.050M、pH为9.4-9.6的碳酸盐缓冲液

Na

B、样品/洗涤缓冲液：pH为7.2的10×PBS-Tween 20

Na

C、酶标记物稀释液

10×PBS-Tween 20：10ml、FCS(小牛血清)：20ml、蒸馏水溶至1000ml、酶稳定剂：1g、生物防腐剂：1ml；

D、显色剂A

柠檬酸：35.5g、过氧化脲：10g、蒸馏水溶至1000ml、Tween 20：10ml；

E、显色剂B

柠檬酸：120g、EDTA-2Na：1g、TMB·2HCl：2g、蒸馏水溶至1000ml；

F、终止液：浓度为2M的H

浓硫酸(95-98％)：22.2ml、蒸馏水：177.3ml，配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀；

2.包被板的制备：

将针对人血清中TK1的鼠单克隆抗体溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板上每孔按0.1μg/孔加入100μL，置4℃放置18-24h，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16h、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。

3.结合抗体和酶联物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。

4.试剂盒的组成：

包被板：48/96孔

TK1校准品：6个：6×1.0ml(浓度分别为20pM、10pM、5pM、2pM、1pM、0pM)

结合抗体：1×10ml(经1:5000稀释)

酶联物：1×10ml(经1:5000稀释)

浓缩洗涤液(25×PBS-Tween 20)：1×20ml

显色剂A：1×6.0ml

显色剂B：1×6.0ml

终止液：1×6.0ml

5.试剂盒的操作步骤：

在包被板的各孔中分别加入待检血清以及校准品100μL/孔，均为双孔，37℃孵育60分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；在各孔内加入TK1结合抗体100μL/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；再在各孔内加入酶联物100μL/孔，37℃孵育30min，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干；加入显色剂A、B液，每孔各50μL，混匀，37℃孵育15分钟；加终止液50μL/孔终止反应，用酶联检测仪(型号RT-6000，可购自雷杜公司)用双波长(450nm、620nm)检测吸光度。

6.结果判定：

表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值

以校准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R

实施例5体外检测试剂盒性能测试

采用实施例3的试剂盒与某市售TK1检测试剂盒进行最低检测限及特异性比较研究。

1.最低检测限比较研究

取浓度为0pM的内控参考品，分别用两种试剂盒检测20次，20次检测结果(OD.值)的平均值

表2最低检测限结果计算

说明本发明实施例制成的TK1体外检测试剂盒的产品检测灵敏度明显优于市售试剂盒产品。

2.试剂盒特异性的比较研究

取可能的交叉反应物，分别用两种试剂盒检测，计算各个交叉物样本平行两次测值(OD.值)的平均值，从相应的试剂盒校准曲线计算出各个样本浓度值与交叉反应物自身浓度比较，计算交叉反应率如下表3：

表3交叉反应结果计算

结果表明，本发明实施例的产品检测特异性明显优于市售试剂盒产品。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 福建亿彤生物科技有限公司

<120> 一种针对人血清中TK1的兔单克隆抗体及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser Phe Cys Thr His Asp Arg

1 5 10 15

Asn Thr Met Glu Ala

20

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala

1 5 10