α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用

技术领域

本发明属于肝病药物技术领域，具体涉及α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是一种以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的综合性临床疾病，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化和肝硬化一系列病变。非酒精性脂肪性肝病是目前世界上最常见的慢性肝病，已成为一个世界性的健康问题。尽管近年来对阐明非酒精性脂肪性肝病的发病机理，确定治疗靶点和推进药物开发方面一直取得稳步进展，但仍存在重大未解决的挑战。

在过去的几十年中，基础研究和转化研究增加了对非酒精性脂肪性肝病发病机理的了解，并确定了一些潜在的治疗目标。目前，非酒精性脂肪性肝病的主要治疗手段包括通过生活方式干预治疗、药物治疗等。近年来，FXR激动剂、粪菌移植疗法等新型的技术也逐步应用于NAFLD治疗中，虽然能取得一定的治疗效果，但这些治疗手段毕竟是将外源成分用于机体，常常面临机体自身的免疫反应，副作用较大，使其临床应用可能存在障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种内源性化合物α-酮丁酸(α-ketobutyrate)在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用，可消除自身免疫反应，副作用较小，使α-酮丁酸临床治疗新型非酒精性脂肪性肝病成为可能。

本发明提供了结构具有如式I所示的α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用；

优选的，所述α-酮丁酸通过降低肝脏脂肪累积和脂肪细胞大小来制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

优选的，所述α-酮丁酸通过降低胰岛素抵抗来治疗非酒精性脂肪肝。

优选的，所述α-酮丁酸通过降低肝功能损伤和血脂水平来治疗非酒精性脂肪肝。

优选的，所述肝功能损伤的的指标包括丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶。

优选的，所述血脂水平包括血清中甘油三酯和总胆固醇的含量

优选的，所述非酒精性脂肪肝是高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝。

优选的，所述药物的剂型包括口服剂。

优选的，所述α-酮丁酸的给药剂量不低于100mg/kg体重小鼠。

本发明提供了结构具有如式I所示的α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。试验表明，α-酮丁酸治疗会有效地降低高脂饮食(HFD)喂食小鼠体重和肝脏重量；α-酮丁酸治疗降低高脂饮食(HFD)喂食小鼠肝脏脂肪累积和脂肪细胞大小；α-酮丁酸治疗降低高脂饮食(HFD)喂食小鼠胰岛素抵抗；α-酮丁酸治疗降低高脂饮食(HFD)喂食小鼠肝功能损伤和血脂水平。同时，α-酮丁酸为机体内源性化合物，药理作用强，副作用小，避免引起过敏反应，因此为临床治疗非酒精性脂肪肝提供基础。

附图说明

图1A为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的体重结果；

图1B为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)共4周的肝体积结果；

图2为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的肝脏组织的HE和油红O染色结果；取小鼠肝脏组织进行HE和油红O染色；

图3为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的染色结果；

图4A为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的葡萄糖检测结果；

图4B为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的胰岛素检测结果；

图5A为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的ALT、AST水平检测结果；

图5B为在高脂饮食(HFD)满12周后，进行α-酮丁酸治疗(灌胃100mg/kg)4周的血脂检测结果。

具体实施方式

本发明提供了结构具有如式I所示的α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用；

在本发明中，α-酮丁酸的分子式为C4H6O3，α-酮丁酸的分子量为102.09。本发明对α-酮丁酸的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的α-酮丁酸的来源即可。在本发明实施例中，所述α-酮丁酸购自上海麦克林生化科技有限公司，货号为C12040413。

在本发明中，以高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝模型为实验对象，通过α-酮丁酸灌胃给药治疗4周，结果表明所述α-酮丁酸通过降低高脂饮食(HFD)喂食小鼠体重和肝脏重量、降低肝脏脂肪累积和脂肪细胞大小、降低胰岛素抵抗、降低肝功能损伤和血脂水平，来达到治疗非酒精性脂肪肝的目的。其中，所述肝功能损伤的指标优选包括丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶。所述血脂水平优选包括血清中甘油三酯和总胆固醇的含量。因此，本发明优选提供了α-酮丁酸在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型优选包括口服剂。本发明对所述口服剂的种类不做具体限定采用本领域所熟知的口服剂的种类即可，例如颗粒剂、片剂等。所述α-酮丁酸的给药剂量优选不低于100mg/kg体重小鼠，更优选为110～140mg/kg体重小鼠。

下面结合实施例对本发明提供的α-酮丁酸在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝模型的建立

1.小鼠的喂养方法

雄性C57BL/6J小鼠，6周龄，SPF级，体质量(20±2)g，购自昆明医科大学实验动物学部(SCXK(滇)K2020-0004)。小鼠6只/笼，饲养在12h的光暗循环和温控环境下。温度26±2℃，相对湿度55％±5％，自由饮食饮水。实验动物饮用水是高压灭菌后分装自来水。本实施例的所有动物实验均按照动物实验规定开展。昆明医科大学动物伦理委员会对本研究动物伦理审核并批准。

2.高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝模型小鼠的喂养

高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝模型的建立参考Tong Zou等人ScientificReports(2018)所描述的方法进行。将购买得到的雄性C57BL/6J小鼠适应饲养一周，根据体重随机分为2组，每组10只，设置正常饲料喂食(Normal Diet，ND)组和高脂饲料喂食(Highfat diet，HFD)组。其中，高脂喂食饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司(HD001，HFD:45kcal％)，对照喂食饲料(ND:10kcal％)购自北京科澳协力饲料有限公司。正常对照喂食饲料和高脂喂食饲料采用自由饮食饮水喂食小鼠。通过检测小鼠的体重和肝组织的油红O染色来确定高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立，其中小鼠的体重达到42g，并且肝组织的油红O的累积达到视野面积的30％表明成功建立非酒精性脂肪肝小鼠模型。

实施例2

α-酮丁酸(α-kB)给药治疗高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型的方法

1.对照组和给药组分组方法

共分为正常组(正常小鼠组)、高脂饮食组(HFD组)和给药组(HFD+α-kB)，每组3只小鼠，每组重复3次。其中，给药组为小鼠造模达12周后开始给药，α-酮丁酸按照100mg/kg体重的标准给药，通过灌胃的方式给药，每天一次，持续给药4周。正常组和高脂饮食组小鼠继续按各自饮食方式喂养。实验期间每周称取并记录各组小鼠体重，观察小鼠精神状况以及食物摄入量等。

结果见图1A和图1B。结果显示，给药组(HFD+α-kB)小鼠体重和肝重明显比HFD组小鼠减轻。

2.小鼠肝脏组织脂肪组织病理学检测

将上述各组小鼠给药4周后处死小鼠，分离肝组织。收集的肝组织并用固定液固定肝组织。对肝脏组织进行HE染色(进行苏木素、伊红染色)和油红O染色检测。

结果见图2。结果显示，与正常组(ND)小鼠相比，HFD组小鼠肝脏有明显的脂肪积累。α-酮丁酸干预后，小鼠肝组织脂肪累积比HFD组显著减少。

将上述各组小鼠给药4周后处死小鼠，分离脂肪组织。收集的脂肪组织用固定液固定。对脂肪组织进行HE染色(进行苏木素、伊红染色)检测。

结果见图3。染色结果显示，与正常组(ND)小鼠相比，HFD组小鼠脂肪细胞显著增大。α-酮丁酸治疗后显著降低HFD组小鼠脂肪细胞大小。

3.口服葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验

对给药组和非给药组(空白组和高脂饮食组)进行葡萄糖耐受检测试验(Oralglucose tolerance test，OGTT)需提前一天将喂食饲料清空(超12h)，次日先测空腹血糖值，再给实验动物灌胃20％葡萄糖溶液(2.0g/kg体重)，计时检测灌葡萄糖后的15、30、60、90、120min时的血糖值。做出曲线统计时间点上的差异。

血糖检测方法为将血糖试纸插入罗氏血糖仪激活仪器，在小鼠尾尖用手术刀划开约2mm长的缺口，挤出一滴血至血糖试纸血样槽端，待血充满整个血样槽，仪器显示屏即显示小鼠血糖值(mmol/L)。

结果见图4A。结果显示，α-酮丁酸可以改善HFD小鼠葡萄糖耐量(GTT)。

对治疗组和非治疗组进行胰岛素耐受实验(Insulin tolerance test，ITT)需提前4h以上清空喂食饲料。先测空腹血糖值，再腹腔注射1U/kg体重的胰岛素至小鼠体内，检测15、30、60、90min时的血糖值。用胰岛素注射后血糖值除以空腹血糖值，做曲线图进行比较。

胰岛素检测方法为制备好的血清样本置于冰上待用。试剂盒4℃保存，使用时预先拿出冰箱，平衡至室温。用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(小鼠胰岛素酶联免疫吸附检测试剂盒)(江苏碧云天，货号：PI602)来检测血清胰岛素，按操作步骤进行检测。

结果见图4B。结果显示，α-酮丁酸可以提高HFD小鼠胰岛素敏感性(ITT)。

4.血清病理学检测

4.1将上述各组小鼠给药4周后处死小鼠，采集血液，分离血清。血清样本进行肝功能损伤指标丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)的检测。

其中丙氨酸氨基转移酶的检测利用丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(山东科立森生物股份有限公司，货号：161091)—ALT(IFCC速率法)进行。检测原理根据ALT催化L-丙氨酸的氨基转移，生成丙酮酸。丙酮酸与NADH在LDH的催化下反应生成乳酸和NAD+NADH在340nm处有特异的吸收峰，其被氧化的速率与血清中ALT的活性呈正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出ALT活性。

天冬氨酸氨基转移酶的检测利用天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(山东科立森生物股份有限公司，货号：161101)(天门冬氨酸底物法)；根据AST催化L-天冬氨酸的氨基转移，生成草酰乙酸。后者与NADH在苹果酸脱氢酶的催化下反应生成苹果酸和NAD+NADH在340nm处有特异的吸收峰，其被氧化的速率与血清中ALT的活性呈正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出AST活性。

结果见图5A。结果显示，与正常组(ND)小鼠对比，HFD组小鼠血清中ALT、AST水平显著升高，α-酮丁酸治疗后，小鼠血清中ALT、AST水平则显著性降低，表明肝损伤得到一定程度恢复。

4.2检测血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的含量

利用甘油三酯测定试剂盒(GPO-PAP法)(山东科立森生物股份有限公司，货号：164031)检测甘油三酯。检测原理为甘油三酯被脂肪酶分解生成甘油，甘油又在甘油激酶的作用下生成甘油三磷酸，甘油三磷酸又在甘油磷酸氧化酶的作用下形成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下将染料显色，并在500nm形成最大吸收，颜色的强度与血清中甘油三酯的含量呈正比。

利用总胆固醇测定试剂盒(CHOD-PAP法)(山东科立森生物股份有限公司，货号：164021)检测总胆固醇。检测原理为酯化的胆固醇经酶水解后，经胆固醇氧化酶氧化，所产生的H

结果见图5B。结果显示，与正常组(ND)小鼠相比，HFD组小鼠血清甘油三酯(TC)和总胆固醇(TG)含量显著升高，经过α-酮丁酸治疗后，HFD小鼠血清TG含量显著降低，TC含量出现下降趋势，但差异无统计学意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。