一种胎生睡莲的快速繁殖方法

技术领域

本发明属于睡莲植物组织培养技术领域，具体涉及一种胎生睡莲的快速繁殖方法。

背景技术

睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)的多年生草本花卉，睡莲科植物在系统进化上具有极高的研究价值。睡莲植物类群众多，分布广泛，花色丰富，花叶俱美，在园林水景中扮演重要角色。同时，睡莲属植物富含黄酮、生物碱等多种活性成分，具有抗菌消炎、降血糖和降血压等多种功效；睡莲的根能吸附水中重金属，净化水体；睡莲的花香成分可以用来制作香水，在美容行业中也发挥了一定的作用。此外，睡莲在文学、艺术等社会科学领域都具有重要地位。

睡莲的繁殖方式多样，兼具有性繁殖和无性繁殖。传统的睡莲繁育通常采用种子、块茎或球茎组织进行繁殖，然而，大多数睡莲结实率低，种子小且实生苗在早期长势较弱，容易遭藻类或蚊虫破坏。长期采用块茎和球茎进行的无性繁殖容易造成病原菌的积累，导致睡莲资源的品质下降、品种退化，同时无性繁殖也受气候条件影响大，尤其是热带睡莲在秋冬季节种质资源严重缺乏，无性繁殖效率低，难以满足市场需求。

叶片胎生作为一种特殊的无性繁殖方式，在部分睡莲种的叶片叶脐部位产生胎生芽进而分化形成独立植株，胎生苗完全由母体叶片提供营养。然而，胎生芽还未分化形成完整的独立植株时，母叶就已经开始发黄腐烂，胎生苗的生长受温度光照等多种因素影响，尤其在秋冬季节仍有多数胎生芽发育受阻，最终并未能产生真正胎生苗。此外，胎生苗必须尽早接触土壤生根保证营养供给，然而受水中浮力作用，脱离母体的胎生苗经常漂浮在水面，营养供给不充分，长势弱最终发黄腐烂。尤其到了冬季，受气候条件影响，即便是长在温室的胎生睡莲，其叶片胎生芽也基本处于发育停滞状态。

中国专利201810858776.5公开了“一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法”，该专利中以‘蓝鸟’睡莲块茎为材料进行无菌芽诱导的方法，此方法以块茎作为外植体培养，睡莲块茎作为外植体数量极其有限，导致繁殖系数偏低。

中国专利201710212711.9公开了“一种利用睡莲组织快速育种的方法”，该方法在睡莲叶茎交汇处用植物生长精激活因子激活处理，从而提高睡莲的繁殖系数。

中国专利202210146030.8公开了“一种热带睡莲叶脐胎生体的快速繁育方法”，热带睡莲‘鲁比’和‘黑美人’胎生体通过施肥移栽实现快速育苗的方法，这两个方法都是直接利用池塘里睡莲母株作为研究材料，通过喷施激素或者施肥管理来进行繁殖育苗，缺点是母株繁殖系数低，对环境温度要求高，培养周期长，仅适合热带和亚热带地区生长，没有考虑睡莲的生态差异，尤其是热带睡莲在温带地区越冬繁殖问题存在巨大限制，胎生芽产量低且发育受阻，以上专利均未提及这一现实问题。

目前有关睡莲叶片胎生特性方面的研究较少，胎生苗的生长发育受季节影响极大，水域环境和生长空间也影响母体植株长势，导致叶片胎生的繁殖系数和发育周期不稳定，难以满足市场和科研需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胎生睡莲的快速繁殖方法，通过组织培养的方式实现胎生睡莲的快速繁殖，操作简便、所需时间短、繁殖系数高，能有效解决耐寒睡莲在秋冬季节胎生发育缓慢、资源缺乏等问题，减少了气候环境对睡莲发育的影响，提高了胎生睡莲的繁殖率。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胎生睡莲的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体取材和消毒

将成熟睡莲叶脐部位带有1～3mm的胎生芽连同叶柄切下来作为外植体，用清水冲洗，并在体视显微镜下将外植体表面棉毛去除，用刀片切除周围多余组织，经清洗和消毒后备用；

2)不定芽诱导

在无菌条件下，将消毒后的外植体接种于诱导培养基中，直至外植体分化产生3～5片叶原基；

其中，所述的诱导培养基为固液双层培养基，其下层为固体培养基，上层为液体培养基，且上层培养基与下层培养基配方相同；

所述诱导培养基包括：MS培养基，TDZ：1.0～3.0mg/L，IAA： 0.5～3.0mg/L；

3)增殖培养与分化

取步骤2)获得的组织接种于增殖培养基中，培养15～20天，直至新生叶片叶脐部分诱导产生新的胎生芽，将带有胎生芽的叶片从叶柄处单独切下，放入增殖培养基中培养，获得带有多于10个叶片的簇状胎生苗；

其中，所述增殖培养基为固体培养基，具体包括：MS基本培养基， TDZ：1～3mg/L，IAA：0.1～0.5mg/L；

4)生根与移栽

将步骤3)获得的簇状胎生苗直接移栽到泥土中，加水并使簇状胎生苗完全浸没在水中，培养10～15天后基部产生若干细长白根。

优选的，所述MS培养基包括：MS：4～5g/L，蔗糖：20～30g/L，琼脂：5～10g/L，pH5.7～5.8。

进一步，步骤1)中，切除外植体周围多余组织后的清洗消毒步骤为：先用自来水冲洗至少30min，接着将其转入70～75％乙醇中浸泡处理45～ 60s后，再用无菌水清洗3～5min，随后用15～20％次氯酸钠溶液浸泡处理10～15min，浸泡过程中晃动不少于三次，最后用无菌水清洗三至五次，每次3～5min。

如无特殊说明，本发明所述的单位mg/L或g/L是指在1升培养基中各组分的含量。

本发明以成熟睡莲叶脐部位带有1～3mm的胎生芽连同叶柄切下来作为外植体，我们前期观察到，胎生芽既具有极强的分化潜力，能持续发育产生新的植物组织和器官，它又保留了物种的遗传特性，是研究睡莲胎生特性的关键组织。同时，在提高繁育系数方面，胎生芽相较于基部根茎组织而言，数量众多，具有取材更加方便、快捷容易的优点，对植物的伤害也最小。

外植体清洗过后，需要在体视显微镜下用镊子将外植体表面的棉毛去除。附着在胎生芽上的毛状结构对于早期胎生芽的发育具有保护作用，同时毛状物具有一定锁水功能，使胎生芽处于湿润环境，这对于水生植物而言十分重要。然而棉毛结构容易粘附众多杂质和菌类物质，极易导致外植体的污染，大量棉毛附着在胎生芽表面也影响了对芽组织发育过程的观察，因此，要尽可能去掉棉毛。外植体上少量短小棉毛的存在影响不大，消毒彻底并不会导致后续的污染。

本发明在不定芽诱导过程中采用固液双层培养基进行培养，能较快的诱导外植体产生叶原基，减轻外植体的褐化程度，并且产生的叶原基数量多，叶柄短而壮。

此外，本发明在增殖培养后，将获得的带有多个叶片的簇状胎生苗直接移栽在泥土中，一周后，发现其开始产生大量白色细根。而不是像传统的快繁方法一样在生根培养基中培养至生根后再移栽到泥土中。

需要注意的是，将增殖培养后的呈现多个叶片的簇状胎生苗移栽入泥土中，需要加入足够多的水，保证加入的水全部没过植株，因为植株一旦因缺水暴露在空气中便会干枯，难以成活。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1)采用本发明方法进行胎生睡莲的快速繁殖，操作简便，从开始培养到移栽到土壤中生根成为完整独立植株仅需一个月的时间，所需时间较常规睡莲繁殖时间大大缩短，在短期内获得大量与母体遗传性状一致的睡莲幼苗，对于种子资源的保存、生产和创新具有重要意义。

2)采用本发明方法每个原始的胎生芽经过培养后获得的带有胎生芽的叶片数平均每株超过7片，将带有胎生芽的叶片单独切割培养后均能发育成独立植株，极大地提升了胎生芽的繁殖系数，缩短了胎生苗的发育周期，打破了气候和地域条件对睡莲胎生发育的限制，对于种植资源利用提供了保障，有利于繁殖名优睡莲品种，同时规模化生产能满足国内外市场需求。

3)本发明提出在早期外植体不定芽诱导阶段使用固液双层培养基，而在增殖阶段选择固体培养基，且增殖培养后无需更换生根培养基，直接进行移栽，该技术操作简便，不需另外配制生根培养基，大大降低了配制培养基的药品、试剂，降低了成本。

附图说明

图1为本发明实施例1外植体在诱导培养基上培养的照片。

图2为本发明实施例1外植体在诱导培养基上培养10天后的照片。

图3为本发明实施例1外植体在增殖培养基上培养1周后的照片。

图4为本发明实施例1外植体在增殖培养后的照片。

图5为本发明实施例1经液体培养基诱导后的胎生组织叶柄细长，转至增殖培养基两周后的状态。

图6为本发明实施例1在移栽过程中的照片。

图7为本发明实施例1移栽10天后的照片。

图8为本发明对比例1中外植体在诱导培养基中培养5天后的照片。

图9为本发明对比例3在生根培养基上培养后的照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

一种胎生睡莲的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体取材和消毒

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的‘小花’睡莲，将成熟睡莲叶脐部位2mm左右的胎生芽切取下来作为外植体，在清水冲洗掉胎生芽周围的泥土，并在体视显微镜下用镊子将外植体表面棉毛去除，用刀片切除芽周围组织，仅保留短截叶柄方便后续夹取，后将外植体放在自来水冲洗30min，接着将其放入75％乙醇中处理1min，从乙醇中取出后用无菌水冲洗3min，随后放入20％次氯酸钠溶液中处理10min，最后用无菌水冲洗三次，每次5min，获得的外植体备用；

2)不定芽诱导

在无菌条件下，用刀切下芽组织，使胎生芽基部与母叶连接处裸露出来，随后将其接种于诱导培养基中，培养条件为：温度25±2℃，光照时间为每天16h，光照强度为60μmol·m

其中，所述诱导培养基为固液双层培养基，其下层为固体培养基，上层为液体培养基，且上层培养基与下层培养基配方相同；

所述诱导培养基包括：MS基本培养基，TDZ：1.0～3.0mg/L，IAA： 0.5～3.0mg/L；

3)增殖培养与分化

在无菌条件下，取步骤2)获得的组织接种于增殖培养基中，培养2 周左右，直至新生叶片叶脐部分诱导产生新的胎生芽，将带有胎生芽的叶片单独切下，继续在增殖培养基中培养，获得带有多个叶片的簇状胎生苗；

其中，所述增殖培养基为固体培养基，具体包括：MS基本培养基， TDZ：1～3mg/L，IAA：0.1～0.5mg/L；

4)生根与移栽

将步骤3)获得的带有多个叶片的簇状胎生苗直接移栽到泥土中，加水并使水没过泥土，一周左右，直至基部产生若干细长白根。

优选的，所述MS培养基包括，MS：4～5g/L，蔗糖：20～30g/L，琼脂：5～10g/L，pH5.7。

图1为本发明实施例1外植体在诱导培养基上培养的照片，将2mm 左右的胎生芽经消毒处理后转至诱导培养基上培养。

图2为本发明实施例1外植体在诱导培养基上培养10天后的照片，从图2可以看出，本发明实施例1中的外植体在诱导培养基上培养10天后，胎生芽分化产生幼叶。

图3为本发明实施例1增殖培养基上培养1周后的照片，将诱导后的组织转移到增殖培养基中培养1周后，部分叶片叶脐处出现胎生芽，将该叶片连同叶柄切下，之后将其放置在增殖培养基培养，后续可发育成独立植株。

图4为本发明实施例1外植体在增殖培养后的照片，将带有叶片的胎生芽在增殖培养基上持续培养，产生带有生长点的新生叶片的数量逐渐增多，胎生苗呈“叶生叶”簇状。

图5为本发明实施例1经液体培养基诱导后的胎生组织叶柄细长，转至增殖培养基两周后的状态。

图6为本发明实施例1在移栽过程中的照片，对胎生苗进行移栽，移入泥土后，浇水使其没过幼苗。

图7为本发明实施例1移栽10天后的照片，叶柄伸长，同时产生大量白色细根。

对比例1

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的小花睡莲，除诱导阶段诱导培养基采用固体培养基外，其余步骤与本发明实施例1相同。参见图8外植体在诱导培养基中培养5天后的照片，胎生芽出现了严重褐化现象，开始分化产生黄绿色叶原基。

对比例2

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的小花睡莲，除诱导阶段诱导培养基采用液体培养基外，其余步骤与本发明实施例1相同。参见图6外植体经诱导培养分化产生叶原基后转入固体增殖培养基，15天后的照片，胎生苗叶柄细长。

对比例3

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的小花睡莲，除诱导阶段和增殖阶段培养基组分为基础MS培养基外，其余步骤与本发明实施例1相同。

对比例4

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的小花睡莲，在增殖培养后，将获得的带有多个叶片的簇状胎生苗接种到生根培养基中，其中生根培养基包括：MS基本培养基，NAA：0.1～0.5mg/L，IBA：0.1～0.5mg/L，其余步骤与本发明实施例1相同。

参见图9，“叶生叶”的胎生苗在生根培养基上生长多日，未见根的伸长，胎生苗逐渐干枯死亡。

对比例5

取上海辰山植物科学研究中心睡莲资源圃所培养的小花睡莲，在增殖培养后，将获得的带有多个叶片的簇状胎生苗接种到生根培养基中，其中生根培养基包括：MS基本培养基，NAA：1～3mg/L，IBA：1～3mg/L，其余步骤与本发明实施例1相同。

根据本发明实施例1和对比例1和对比例2可知，在不定芽诱导过程中，诱导培养基分别选择固液双层培养基、固体培养基和液体培养基。

观察比较睡莲胎生芽在三种不同类型培养基模式下的生长状态，培养 5天后实施例1中外植体上肉眼可见多处绿色叶原基的伸出，基本没有褐化；对比例1中的外植体上仅有少数叶原基伸出，胎生芽的诱导速度较慢，且在培养前几天胎生芽褐化严重；对比例2中的外植体上叶仅有少数叶原基伸出，颜色为淡绿色，液体培养基中的胎生芽褐色较轻，但诱导的叶原基出现时间比较晚，同时叶片小，叶柄细长且方向性较乱，幼苗长势较弱有稍微褐化。胎生芽在固液双层培养基中的生长速度最快，褐化程度最轻，产生的叶原基数量多，叶柄短而壮，胎生苗长势良好。

根据本发明实施例1和对比例3的比较可知，培养基组分在胎生芽的诱导和增殖过程中也发挥作用。在诱导阶段，基础MS培养基和添加了植物激素TDZ和IAA的诱导培养基均能导致叶原基的分化，没有明显区别，这可能与胎生芽存在内源激素有关，胎生芽在早期分生组织发育过程中积累了植物激素，这对于叶原基等后期组织的发育提供了基础。在增殖阶段，即新生叶片持续诱导胎生芽的过程中，添加了植物激素的培养基作用更明显，产生具有胎生特性的叶片数量比基础MS培养基多3～5片，说明睡莲胎生能力与植物激素息息相关。

根据本发明实施例1和对比例4、对比例5的比较可知，外植体经过诱导培养和增殖培养后，产生的新幼苗保留了母体植株的胎生特性，将带有胎生芽的新生叶片从叶柄处切下，单独进行增殖培养，也能够发育形成独立植株，依旧保留胎生特性。

此外，本发明在增殖培养后将胎生苗直接移栽到泥土中生根，10天后，发现胎生苗基部开始产生大量白色细根。而对比例中，将增殖培养后的胎生苗移入生根培养基中培养，胎生苗在生根培养基上并没能诱导产生根，同时随着培养时间的延长，胎生苗逐渐呈现白化并干枯致死。