一种放线菌培养物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及一种放线菌培养物及其制备方法与应用。

背景技术

现代高密度集约化养殖，会向环境中直接排放或通过粪便发酵大量氨气、甲烷、硫化氢、二氧化硫等恶臭气体，这些对养殖现场和周围的空气、水体和土壤都会造成不同程度的污染。我国针对畜禽养殖污染防治的法规性文件《畜禽规模养殖污染防治条例》2014年1月1日施行，国家和各地纷纷出台不同畜禽养殖环境污染防治法规和办法，重视养殖生态环境保护，提倡标准化、现代化的绿色健康养殖。饲料原料价格飙升、养殖减抗大势所趋，面对养殖环境管理各项法规，我国畜禽养殖企业面临经营和环保的双重压力。只有通过饲料营养技术手段，才能在不增加生产运营成本的条件下，在较短时间内实现最大化利用饲料价值、降低环境污染。

近年来，放线菌在饲料、畜禽领域主要作为发酵饲料菌剂(刘晓飞，2020)、环境除臭剂(周美君，2016)；主要同枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酿酒酵母菌等一种或多种微生物混合，以混合菌剂(周美君，2016；李家勤，2022，刘玲子，2019)，制备除臭剂或发酵饲料(张春青，2022；崔梦鸽，2021)等产品。关于放线菌作为饲料添加剂的研究和产品，目前尚未发现放线菌的培养物、或利用酿酒酵母培养物、或放线菌同微生物培养物混合的研究和产品报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种放线菌培养物及其制备方法与应用，该放线菌培养物通过结合精准营养、低蛋白日粮等饲料营养技术手段，可实现饲料利用率提高、肠道微生物结构改善，进而达到降低有害气体、病原微生物和过量营养元素的排放，提高养殖环保和生产效益。

为此，本发明的第一方面提供了一种放线菌培养物，其通过放线菌发酵酿酒酵母培养物制备得到；所述放线菌为马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)；所述酿酒酵母培养物通过酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)SC-HKB100发酵大豆糖蜜制备得到。

根据本发明的技术方案，所述马杜拉放线菌的菌种保藏号为CGMCC No. 17015。所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)SC-HKB100于2019年9 月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019769。

进一步，所述酿酒酵母培养物的制备方法包括，将所述酿酒酵母菌 SC-HKB100的种子液接种到大豆糖蜜液体培养基中进行有氧发酵，制备得到酵母菌液体发酵培养物；将所述酵母菌液体发酵培养物接种至固体培养基中进行厌氧发酵，制备得到酵母菌固体发酵培养物；对所述酵母菌固体发酵培养物进行破壁，即制备得到所述酿酒酵母培养物。

进一步，所述种子液的接种量为18％-25％。

进一步，所述有氧发酵的温度为28℃-32℃，发酵时间为24-36h，通气量为1-4L/min。

进一步，所述大豆糖蜜液体培养基通过将大豆糖蜜用水稀释2-3倍，并调节pH值为5.8-6.8制备得到。

进一步，所述厌氧发酵的温度为28-35℃，发酵时间28-36h。

进一步，所述厌氧发酵具体包括：按重量份数将大豆糖蜜2份、液体发酵酵母菌培养物3份混合均匀制备得到发酵剂；按重量份数将玉米胚芽粕1-2份、麦麸5-6份，玉米芯5-6份混合均匀，经灭菌制备得到固体培养基；将所述发酵剂和所述固体培养基按照质量比1：2进行混匀，调节水分含量为50％；然后进行厌氧发酵。

进一步，通过以下步骤进行所述破壁：向所述酵母菌固体发酵培养物加入破壁剂进行处理。

进一步，所述加入所述破壁剂的质量百分比为1-5％，例如1％、1.2％、2％、 3％、4％、5％等；所述处理时间为3-6h，例如3h、4h、5h、6h等。

进一步，所述破壁剂按重量份数计包括：β-葡聚糖酶5份、甘露聚糖酶5 份、纤维素酶10份，氯化锌8份。

进一步，所述放线菌发酵酿酒酵母培养物的条件包括：发酵温度为28℃ -35℃，发酵时间为12-24h。

本发明的第二方面，提供所述放线菌培养物的制备方法，其包括：

S1、对所述放线菌进行菌种活化，制备得到活化后的放线菌；

S2、将所述活化后的放线菌接种至种子液培养基中，经种子液扩大培养制备得到放线菌种子液；

S3、将所述放线菌种子液接种至液体培养基中，进行液体扩大培养；制备得到放线菌培养液；

S4、将所述放线菌培养液接种至所述酿酒酵母培养物中，进行固体发酵，制备得到放线菌固体发酵培养物；对所述放线菌固体发酵培养物进行干燥及粉碎处理，即制备得到所述放线菌培养物。

进一步，所述菌种活化采用斜面培养，所述菌种活化的培养基为高氏1号培养基，其含可溶性淀粉20g/L、KNO

进一步，所述菌种活化步骤中，培养温度为28℃-30℃，培养时间为24-48 h。

进一步，所述种子液培养基含可溶性淀粉24g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖1 g/L、酵母水解物5g/L、蛋白胨3g/L、碳酸钙4g/L，pH值为7.0。

进一步，所述种子液扩大培养步骤中，培养条件为28℃恒温摇床培养，转速为180r/min，培养时间为36-60h。

进一步，所述液体扩大培养步骤中，液体培养基含可溶性淀粉18g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖1g/L、酵母水解物5g/L、蛋白胨3g/L、碳酸钙4g/L，pH 值为7.2。

进一步，所述液体扩大培养步骤中，所述活化后的放线菌的接种量为5％，发酵条件为28℃恒温，转速180r/min，发酵时间为36-60h。

进一步，所述固体发酵步骤中，所述放线菌培养液的接种量为5％-8％，发酵温度为28℃-35℃，发酵时间为12-24h。

本发明的第三方面，提供所述放线菌培养物在畜禽养殖中的应用；所述放线菌培养物作为饲料添加剂。

进一步，所述畜禽包括猪、奶牛、鸡等。

进一步，当所述放线菌培养物作为生猪饲料添加剂时，添加量为3-5kg/t；当所述放线菌培养物作为鸡饲料添加剂时，添加量为1-3kg/t；当所述放线菌培养物作为奶牛养殖饲料时，添加量为100-150g/(头·d)。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)本发明提供的放线菌培养物由放线菌在特定的酿酒酵母培养物上再发酵制备得到，该酿酒酵母培养物通过酵母菌发酵大豆糖蜜制备得到，含有少量棉籽糖、水苏糖等功能性低聚糖，有利于促进肠道有益菌生长；该酿酒酵母培养物充分破壁，释放的酵母细胞内容物有利于放线菌发酵，从而代谢产生生物活性物质。

(2)本发明提供的放线菌培养物，由于含有放线菌代谢产物，可有效抑制白色念球菌、金黄色葡萄球菌等致病菌，降低病原微生物向环境排放和抑制排泄物中病原微生物的生长。

(3)本发明提供的放线菌培养物可以提高动物对饲料养分的消化利用率，降低胃肠道微生物原虫、拟杆菌等微生物丰度，降低碳、氮等元素以氨气、甲烷等环境污染气体形式向环境排放的量。

(4)本发明提供的放线菌培养物可作为饲料添加剂，结合低蛋白日粮技术进行应用，可在降低蛋白质原料的基础上保障动物生长和健康，有助于缓解蛋白质饲料原料短缺的问题，对推动畜禽养殖产业提质增效和生态化健康发展具有重要现实意义。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1：马杜拉放线菌培养物产品对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌实验结果图；

图2：马杜拉放线菌培养物产品对混合指示菌的抑菌实验结果图；

图3：马杜拉放线菌培养物产品对(30-60kg)猪的盲肠微生物菌群的影响的检测结果；

图4：马杜拉放线菌培养物产品对猪粪便中吲哚浓度的影响的检测结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1酿酒酵母培养物的制备

(1)斜面菌种活化：将冷冻保藏的酿酒酵母SC-HKB100(保藏编号CCTCC NO：M2019769)接种到含有麦芽膏粉130g/L、氯霉素0.1g/L，琼脂20g/L 的斜面培养基上，静置恒温30℃，培养36h，得到活化后的酵母菌种。

(2)种子液的制备：将活化后的酵母菌种用1环接种至含有麦芽浸出粉 145g/L、氯霉素0.08g/L，pH值为6.2的液体培养基中，在30℃恒温摇床培养，转速180r/min；培养30h。

(3)大豆糖蜜发酵：将制备好的种子液以20％接种量接种到稀释的大豆糖蜜培养基中，大豆糖蜜的稀释倍数为2.5倍，即：加水将大豆糖蜜稀释为大豆糖蜜质量的2.5倍，pH值为6.1，进行扩大培养，控制通气量为3L/min，温度为29℃，发酵时间为30h。得到发酵液体菌种液。

(4)固体厌氧发酵：按重量份数将玉米胚芽粕1份、麦麸6份，玉米芯5 份混合后，80℃高温灭菌5分钟后获得固态发酵原料；按重量份数将大豆糖蜜 2份、酵母菌种液3份充分混合后获得发酵剂；将发酵剂和固态发酵原料按照质量比1：2进行混匀，添加水调节发酵前物料水分含量为50％；于可控温发酵罐中进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，发酵时间32h。得到固态发酵产物。

(5)获得酿酒酵母培养物：向固态发酵产物中投放1.2％破壁剂(按重量份数计由以下成分组成：β-葡聚糖酶5份、甘露聚糖酶5份、纤维素酶10份，氯化锌8份)，混匀3h，制备得到酿酒酵母培养物，将其用于后续马杜拉放线菌的发酵培养。

实施例2马杜拉放线菌的发酵培养

(1)斜面菌种活化：将冷冻保藏的保藏号为CGMCC No.17015的马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)接种到含可溶性淀粉20g/L、KNO

(2)种子液制备：从高氏培养基上刮取1环马杜拉放线菌孢子，接种于含可溶性淀粉24g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖1g/L、酵母水解物5g/L、蛋白胨3g/L、碳酸钙4g/L(pH 7.0)的种子液培养基中，在28℃恒温摇床培养，转速180r/min，培养2d后，得到马杜拉放线菌种子液。

(3)液体扩大培养：将马杜拉放线菌种子液以5％的接种量分别接种到含可溶性淀粉18g/L、牛肉膏3g/L、葡萄糖1g/L、酵母水解物5g/L、蛋白胨3g/L、碳酸钙4g/L(pH 7.2)的液体发酵培养液中，在28℃恒温、转速180r/min，扩大培养48后，得到马杜拉放线菌发酵液。

(4)固体发酵：将扩大培养后的马杜拉放线菌发酵液以5％的接种量接种到实施例1制备得到的酿酒酵母培养物中，发酵温度为28℃，持续发酵48h后，干燥、粉碎得到马杜拉放线菌培养物产品，将其用于后续实施例的检测、应用中。

(5)对制备得到的马杜拉放线菌培养物产品的主要成分进行检测，如表1 所示。

表1马杜拉放线菌培养物产品的主要成分(干物质基础，wt％)

由表1可知：本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品中含有丰富的粗蛋白质、甘露聚糖和酚酮类物质，其中甘露聚糖是酵母细胞壁成分，酚酮类物质是马杜拉放线菌发酵代谢活性物质；另外少量棉籽糖和水苏糖是大豆糖蜜被酿酒酵母SC-HKB100利用后残留的功能性低聚糖，少量存在的该低聚糖有利于畜禽肠道微生物区系平衡。

实施例3马杜拉放线菌培养物产品的体外抑菌效果

(1)采用牛津杯方法，观察实施例2制备得到的马杜拉放线菌培养物产品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果。抑菌效果的检测结果如图1所示，统计结果如表2所示，根据统计结果，马杜拉放线菌培养物产品对上述细菌均有较好的抑菌效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，白色念珠菌其次。

表2马杜拉放线菌培养物产品的体外抑菌效果

(2)采用牛津杯方法，观察实施例2制备得到的马杜拉放线菌培养物产品在不同温度和pH条件下对混合指示菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌混合)的抑菌效果。抑菌效果的检测结果如图2所示，统计结果如表3-4 所示。

表3马杜拉放线菌培养物产品在不同温度下对混合菌的抑菌效果(pH7.0)

表4马杜拉放线菌培养物产品在不同pH下对混合菌的抑菌效果(室温)

根据表3结果，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可以在饲料加工的高温制粒条件下保持抑菌活性；根据表4结果，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可耐受胃酸，在肠道中保持抑菌活性。

实施例4马杜拉放线菌培养物产品用于生长猪饲料

1.试验设计和日粮

选用(30±2.15)kg杜×长×大三元杂交生长猪54头，采用单因子随机试验设计，随机分为3组，每组为一个处理，每组6个重复，每个重复3头猪，各处理分别是对照组(记为CON，饲喂低蛋白日粮)，0.3％微生物培养物组(记为0.3％YC，饲喂低蛋白日粮+0.3％马杜拉放线菌培养物产品)，0.5％微生物培养物组(记为0.5％YC，饲喂低蛋白日粮+0.5％马杜拉放线菌培养物产品)。

表5低蛋白日粮组成及营养水平(干物质基础)

基础日粮是参考NRC(2012)标准和《中国猪饲养标准》(2020版)采用米糠粕、次粉等原料降低豆粕使用量，配制成玉米-豆粕型低蛋白日粮，粗蛋白水平为14.80％。

各处理组分别饲喂对应饲料，其他养殖条件均相同；试验期为35天。

2.检测指标

生长性能、肠道微生物、猪粪吲哚浓度和猪粪致病菌数量等指标。

3.结果

3.1马杜拉放线菌培养物产品对(30-60kg)猪的生长性能的影响

饲喂35天的生长指标如表6所示，其结果表明，在此低蛋白饲料中添加 0.3％、0.5％的本发明微生物培养物产品，可有效提高采食量和饲料转化效率，提高了商品猪生长性能，增加低蛋白日粮条件下生猪养殖效益。

表6马杜拉放线菌培养物产品对(30-60kg)猪的生长性能的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

3.2马杜拉放线菌培养物产品对(30-60kg)猪的肠道微生物的影响

对生长猪肠道微生物组成进行分析，分析结果如图3所示，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品增加了猪的盲肠乳酸菌占比，减少了梭状芽胞杆菌占比，改善了猪盲肠微生物组成结构，和部分盲肠微生物物种的丰度。尤其采用 0.3％的添加量时，显著增加了肠道微生物丰度，并且乳酸杆菌、普氏栖粪杆菌的占比显著提升，这对仔猪肠道抗炎、排泄微生物安全有显著改善作用。

3.3马杜拉放线菌培养物产品对(30-60kg)猪的粪便中吲哚浓度的影响

吲哚是色氨酸代谢标志物，也是猪排泄的气体中臭气的标志物。对猪粪便中吲哚浓度进行检测，统计结果如图4所示，根据图4可知，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可显著降低猪粪便中吲哚浓度，表明其提高了氨基酸消化吸收，降低了养猪过程中臭气的排放。

实施例5马杜拉放线菌培养物产品用于奶牛饲料

1试验设计和日粮

奶牛基础日粮组成：青贮玉米30.54份、羊草12.00份、苜蓿干草8.00份、甜菜粕2.50份、棉籽粕9.00份、玉米22.00份、玉米DDGS 5.00份、豆粕5.00 份、小麦麸2.50份、石粉0.50份、磷酸氢钙1.00份、食盐0.40份、小苏打0.70 份、氧化镁0.15份、维生素矿物质预混料0.50份、过瘤胃赖氨酸0.10份、过瘤胃蛋氨酸0.06份、过瘤胃苏氨酸0.03份、过瘤胃色氨酸0.02份。最终饲料粗蛋白质水平为14.15％。

试验选用60头2～4胎、泌乳50d左右、体重接近的荷斯坦黑白花奶牛，随机分为对照组、试验1组和试验2组，每组20头牛。对照组饲喂基础日粮，试验1组饲喂基础日粮和100g/(头·d)马杜拉放线菌培养物产品，试验2组饲喂基础日粮和150g/(头·d)马杜拉放线菌培养物产品。

试验期共计42d，其中预试期7d，正式期35d，按照牧场流程正常饲喂，在试验期间对奶牛产奶性能、奶品质、瘤胃微生物和甲烷排放等指标监测。

2试验结果

2.1马杜拉放线菌培养物产品对奶牛产奶性能的影响

对奶牛的日均产奶量进行统计，统计结果如表7所示。

表7马杜拉放线菌培养物产品对奶牛日均产奶量的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

根据表7可知，饲喂本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可提高泌乳奶牛的产奶量。随着试验时间的延长，试验正式期后，各个阶段产奶量均明显增加，在正式试验3周时，产奶量趋于稳定。试验全期，试验1组和试验2组奶牛日均产奶量较对照组分别提高了4.26％和4.97％。

对奶牛的乳品质进行检测进行统计，结果如表8所示。

表8马杜拉放线菌培养物产品对奶牛乳品质的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

由表8数据可知，通过饲喂本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品提高了牛奶中乳蛋白和乳糖的含量，有效改善了奶牛乳品质。

2.2马杜拉放线菌培养物产品对奶牛瘤胃微生物的影响

对各组奶牛瘤胃微生物进行检测和统计，结果如表9所示。

表9马杜拉放线菌培养物产品对奶牛瘤胃微生物区系的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

表9结果显示，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品增加了奶牛瘤胃中微生物的丰度，其中厚壁菌门、放线菌门增加明显，这表明瘤胃中纤维分解菌和乳酸利用菌数量增加，而产甲烷菌(古菌门、原虫等)的丰度显著降低。

2.3马杜拉放线菌培养物产品对奶牛甲烷排放的影响

对各组奶牛的甲烷排放量进行检测和统计，结果如表10所示。

表10马杜拉放线菌培养物产品对奶牛甲烷排放的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

表10结果显示，试验1组、试验2组的肠道甲烷排放量与对照组相比，分别降低14.48％和19.37％，差异极显著。2个试验组以甲烷/干物质采食量(L/kg) 和甲烷/产奶量/(L/kg)计算的甲烷排放强度均较低，其中甲烷/干物质采食量 (L/kg)差异明显。该结果可能与本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品能显著降低产甲烷微生物丰度有正向关联。

3结论

将本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品通过日粮添加饲喂给泌乳牛，能够提高奶牛产奶量、改善乳品质，显著提高奶牛泌乳性能，并且通过改善瘤胃微生物组成，显著降低甲烷排放量，降低奶牛养殖的环境污染安全隐患。

实施例6马杜拉放线菌培养物产品用于肉鸡低蛋白饲料

1 试验设计和日粮

1.1 基础日粮组成

肉鸡前期料(1-21d)组成：玉米68.68份、豆粕16.54份、葵花籽粕2.50 份、花生仁粕3.00份、玉米蛋白粉4.20份、大豆油1.00份、石粉0.70份、磷酸氢钙1.20份、食盐0.20份、L-赖氨酸0.80份、DL-蛋氨酸0.28份、L-苏氨酸 0.25份、L-色氨酸0.20份、L-异亮氨酸0.15份、L-亮氨酸0.15份、L-缬氨酸 0.15份。

肉鸡后期料(22-42d)组成：玉米70.33份、豆粕12.00份、葵花籽粕4.50 份、花生仁粕4.80份、玉米蛋白粉1.20份、大豆油2.80份、石粉1.20份、磷酸氢钙1.60份、食盐0.35份、L-赖氨酸0.55份、DL-蛋氨酸0.15份、L-苏氨酸 0.12份、L-色氨酸0.10份、L-异亮氨酸0.10份、L-亮氨酸0.10份、L-缬氨酸 0.10份。

1.2试验动物

选用1日龄AA肉鸡360只，随机分为2个处理，对照组和试验组在不同栋的鸡舍中饲养(以便测鸡舍氨气浓度)，每个处理6个重复，每个重复30只鸡(分成上中下三层笼饲养)。对照组饲喂基础日粮，试验组在饲喂肉鸡前期料(1-21d)时添加0.1％马杜拉放线菌培养物产品，在饲喂后期料(22-42d)时添加0.2％马杜拉放线菌培养物产品。

1.1饲养管理

试验期42d，试验按照AA肉鸡饲养标准实行，正常免疫，采用自由采食和饮水方式，按时打扫，保持禽舍清洁卫生。

1.3测定指标

生长性能、肉品质和鸡舍氨气浓度等指标。

2试验结果

2.1马杜拉放线菌培养物产品对肉鸡生长性能和饲料转化效率的影响对肉鸡的生长指标进行检测和统计，统计结果如表11所示。

表11马杜拉放线菌培养物产品对肉鸡生长性能的影响

注：不同字母表示差异显著，P＜0.05

根据表11，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可有效改善肉鸡后期的日增重、饲料转化率，其效果平均到整个42天饲养期，仍具有显著效果。

2.2马杜拉放线菌培养物产品对肉鸡肉品质的影响

对各组肉鸡肉品质进行检测和统计，结果如表12所示。

表12马杜拉放线菌培养物产品对肉鸡肉品质的影响

注:不同字母表示差异显著，P＜0.05

根据相关研究报道，肉仔鸡死后15min时，pH<5.7可以认定为白肌肉， pH>6.4为黑干肉。由表12数据可知，对照组和试验组的pH值分别为6.06和 6.01，差异不显著，都属于正常范围，表明鸡肉颜色也在正常范围内。

2.3马杜拉放线菌培养物产品对肉鸡氮排放的影响

对各组鸡舍日平均氨气浓度进行检测和统计，结果如表13所示。

表13马杜拉放线菌培养物产品对鸡舍日平均氨气浓度(ppm)的影响

注:不同字母表示差异显著，P＜0.05

表13数据显示，试验组的肉鸡畜舍内氨气浓度显著低于对照组鸡舍，这说明本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品可有效降低肉鸡氮排放，减少鸡舍氨气浓度，改善养殖环境。

3结论

综上，本发明提供的马杜拉放线菌培养物产品应用于肉鸡全阶段养殖中，可显著改善肉鸡的生长性能，提高肉鸡的饲料转化效率，提升鸡肉肉品质，并且能够降低氮排放，改善环境污染。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。