一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌及其培养方法和应用。

背景技术

炎症性肠病(IBD)，主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，是一种主要累及肠道的非特异性、慢性、复发性炎症性疾病。研究认为，IBD多见于西欧和北美地区，与西方的高脂肪、高蛋白和高糖饮食等生活方式密切相关。IBD既往在中国罕见，但近20年来，由于国人的饮食习惯、生活节奏以及环境等明显改变，中国IBD的发病率快速增长，以珠江三角洲地区和长江三角洲地区増长最快，目前已经成为我国消化系统常见疑难疾病之一。然而，当前临床上仍缺乏有效治疗IBD的药物。近年来的研究表明肠道菌群失调与IBD的发生发展关系密切，维持肠道菌群平衡可有效缓解IBD及降低其复发率。因此，以肠道菌群为靶点被认为是治疗和预防IBD的一种新的方式。

根据WHO定义，益生菌(Probiotics)是一种活的微生物，当摄入足够量时，能给宿主带来益处。大量研究证实益生菌能有效调节肠道菌群组成和功能，改善胃肠道稳态和健康。然而，目前有关益生菌缓解胃肠道健康的研究主要集中在便秘和腹泻，针对预防或治疗IBD的研究较少。短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)主要包括乙酸、丙酸及丁酸等，是肠道菌群的主要代谢产物之一。研究证实SCFAs具有中和炎症、抑制条件致病菌生长、维护肠屏障功能和增强免疫等功效，因此，被认为是肠道菌群发挥作用的关键物质基础。目前，人们越来越期望于通过扩增肠道内的短链脂肪酸的量来预防和治疗IBD，因此产短链脂肪酸的菌株成为研究关注的对象。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌及其培养方法和应用，通过提高肠道中的短链脂肪酸含量，用来预防和治疗IBD。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

本发明的目的之一在于，提供一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)I1/53，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：61720。

进一步的，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸中的一种或多种。

本发明的另一个目的在于，提供一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌的培养方法：将肠膜明串珠菌I1/53菌株以体积比1％-5％的接种量接种于适于产短链脂肪酸的含益生元的培养基中，控制温度25℃-45℃、pH5.0-7.0下，培养12h-36h，最终获得培养液。

进一步的，所述益生元为异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇、菊粉、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖、葡聚糖、膳食纤维中的一种或多种。

进一步的，所述培养基包括以下组分：葡萄糖2.0％-5.0％、牛肉浸粉0.5％-2.0％，蛋白胨0.5％-5.0％，酵母浸膏0.5％-5.0％，乙酸铵0.2％-1.0％，硫酸镁0.02％-0.2％，硫酸锰0.01％-0.5％，氯化钙0.1％-1.0％，柠檬酸氢二铵0.1％-1.0％，吐温-800.1％-0.5％，磷酸氢二钾0.1％-1.0％，益生元1％-5％；所述培养基调节pH5-7，121℃灭菌20min。

进一步的，所述培养基中的益生元单独灭菌，其他成分一起灭菌，然后无菌操作混合在一起。

本发明的另一个目的在于，提供一种产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌在制备预防和治疗炎症性肠病的药物中的应用。

进一步的，所述预防和治疗炎症性肠病的药物的剂型为口服粉剂、胶囊或片剂。

进一步的，所述口服粉剂、胶囊或片剂中包含肠膜明串珠菌I1/53的菌粉。

进一步的，所述肠膜明串珠菌I1/53的添加量为10

进一步的，所述肠膜明串珠菌I1/53的菌粉为活菌粉或死菌粉，通过其发酵培养物的上清液经过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到。

本发明的突出效果为：本发明提供的肠膜明串珠菌I1/53能产短链脂肪酸；通过动物试验，可以证实其菌粉制剂能有效改善炎症性肠病，缓解炎症性肠炎引起的腹痛、腹泻等症状。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明采用的常见试剂的配方如下，在后续实施例中不再赘述。

MRS培养基成分：15g/L葡萄糖，10g/L牛肉膏，10.0g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，300mg/L硫酸镁，600mg/L硫酸锰，2g/L柠檬酸氢二铵，1mg/L吐温-80，2g/L磷酸氢二钾，pH6.4。

实施例1产短链脂肪酸菌株的筛选、分离、鉴定

本实施例提供一种短链脂肪酸菌株的筛选及鉴定方法，包括如下步骤：从蔗汁的若干样品中，用无菌水溶解，梯度稀释，取适宜梯度1mL于无菌培养皿(每个稀释度作5个平行)，用MRS-碳酸钙培养基浇注，待凝固后，37℃倒置培养72h。共选择了50株具有溶钙圈(以溶钙圈直径表述，单位mm)的菌株，标号1-50，其中选取溶钙圈较大的前10个菌株编号数据，结果如表1所示：

表1溶钙圈排名前10的菌株情况表

注：数据上标为不同小写字母(ab)的表示存在显著性差异(P<0.05)。

实施例2产短链脂肪酸能力较强的菌株筛选及鉴定

本实施例通过高效液相色谱法分析实施例1中溶钙圈较大的前10个菌株的发酵液中SCFAs组成和含量，具体方法为，将菌液，在4℃下，14000rcf离心30min，得到的上清液用尼龙膜孔径为0.22μm过滤，采用高效液相色谱仪对滤液中的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸)进行检测，色谱条件如下：

仪器：Waters 2965；色谱柱为Aminex HPX-87H，300×7.8mm；流动相为10mM H

所述的肠膜明串珠菌I1/53具有下述所述生物学特征：

菌体特征：为革兰氏阳性菌，在pH为5.0-7.0，微好氧性，厌氧培养生长良好。

菌落特征：在MRS培养基上的菌落形态呈圆形或豆形，菌落直径小于1.0mm，表面光滑，乳白色，不产生任何色素；细胞形态呈球形、豆形或短秆形，有些成对或以短链排列、不运动、无芽孢。

生物特性：该菌株为兼性厌氧菌，但是在厌氧条件下生长最佳，生长温度范围2℃-53℃，最适生长温度30℃-40℃；耐酸性强，生长最适pH为5.5-6.2，在pH≤5的环境中可以生长，而在中性或初始碱性条件下生长速率降低。

表2产短链脂肪酸的肠膜明串珠菌

/>

实施例3肠膜明串珠菌I1/53最优发酵底物确定及发酵条件优化

本实施例提供一种肠膜明串珠菌I1/53最优发酵底物确定及发酵条件优化，包括以下步骤：

将筛选所得肠膜明串珠菌I1/53接种到发酵培养基中；葡萄糖2.0-5.0％、牛肉浸粉0.5-2.0％，蛋白胨0.5-5.0％，酵母浸膏0.5-5.0％，乙酸铵0.2-1.0％，硫酸镁0.02-0.2％，硫酸锰0.01-0.5％，氯化钙0.1-1.0％，柠檬酸氢二铵0.1-1.0％，吐温-80 0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.1-1.0％，益生元1-5％，培养基灭菌条件为：121℃灭菌20min。其中益生元(异麦芽酮糖、菊粉、异麦芽酮糖醇、水苏糖等)培养基成分单独灭菌，其他成分一起灭菌，之后在无菌操作下加入到培养基中或不添加。将灭好的发酵培养基1-10％的接种量进行接种，培养温度为25-45℃，pH5.0-7.0，培养时间为12-36h，获得培养液；按照实施例2中的方法检测发酵液中SCFAs。结果如表3所示，肠膜明串珠菌I1/53在添加益生元的培养基发酵液上清中的短链脂肪酸的产量明显较高，且在益生元为异麦芽酮糖时SCFA含量最高，因此，选用异麦芽酮糖为肠膜明串珠菌I1/53的最优底物。

表3编号12菌株不同益生元共培养下的短链脂肪酸产量表

注：数据上标为不同小写字母(ab)的表示存在显著性差异(P<0.05)。

实施例4产短链脂肪酸肠膜明串珠菌I1/53在预防和治疗IBD中的应用

40只6-7周龄雄性SD大鼠平均分为4组，即健康对照组、模型对照组、给药组(高、低剂量)。除健康对照组(饮正常水)外，其余3组均饮用含3％葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导IBD模型，所有动物自由饮食，饲养条件相同。与此同时，健康对照组和模型对照组每天灌胃200μL生理盐水，而高和低剂量组分别灌胃肠膜明串珠菌I1/53(10

表4肠膜明串珠菌I1/53对结肠的影响

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。