一种与绵羊剩余采食量性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记的技术领域，具体涉一种与绵羊剩余采食量性状相关的分子标记及应用。

背景技术

饲料效率是绵羊的重要经济性状之一，在舍饲养羊生产中，饲草料成本约占总饲养成本的65％～70％。特别是近年来，现有舍饲养羊规模的扩大，饲料原料价格的不断上涨，以及草原生态环境保护战略的实施和碳达峰、碳中和对羊产业发展的新要求，因此如何提高饲料效率是当前育种工作者的研究重点。目前，饲料效率(Feed conversion rate，FCR)和剩余采食量(Residual feed intake，RFI)作为衡量饲料利用效率高低的常用经济指标。但FCR又称为饲料报酬或料重比，是指特定时间段内动物所消耗饲料的总量与增重的比值，当动物出现负增重时，很难准确评价其饲料效率的高低。因此需要引入更为准确、科学的指标评价饲料利用效率。1963年，Koch等人首次提出了剩余采食量(Residual feedintake，RFI)，作为一种估测畜禽饲料利用效率的指标，是指畜禽实际采食量与预期的根据生产性能(体增重、产奶量和产蛋数等)需要和维持体重需要的标准而计算得出的采食量之差(Koch，R.M.，et al.，Efficiency of feed use in beef cattle[J].J Anim Sci.1963，22(2):486-494)。RFI属于中等遗传力的复杂数量性状，受遗传控制且能通过有效个体的选育对群体进行遗传改良，反映的是畜禽本身由遗传背景决定的代谢差异而导致的饲料利用效率的差异，其与畜禽的体型大小及生产性能，甚至是屠宰性能和肉品质等性状相互独立，计算过程中既考虑了畜禽的体增重，也校正了其代谢体重。并在对RFI进行遗传改良的同时，不会对生长及生产性状造成不良影响或影响很小，这也是FCR不可比拟的优势之一。因此，RFI是一项准确评价饲料利用效率的理想育种指标。

但在绵羊上缺少自动化测定采食量的设备，使得RFI的测定耗时耗力。因此筛选与RFI相关的分子标记并用于早期选育对提高绵羊的饲料效率具有重要意义。近年来，随着测序技术的快速发展以及绵羊高质量参考基因的公布，使得全基因组关联分析(Genomic-wide association study，GWAS)被广泛应用于畜禽重要经济性状分子标记和关键基因的筛选。但是目前还没有利用GWAS分析策略筛选与绵羊RFI相关的分子标记的报道，也没有在大群体中进行群体遗传效应分析，如何确定大效应的SNP位点应用于分子标记辅助选择和基因组选择，能有效加速自主知识产权的节粮型优质肉羊新品种的培育进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与绵羊剩余采食量相关的分子标记和应用。本发明的分子标记是通过对207只具有RFI表型值记录的湖羊群体进行GWAS研究，通过对GWAS结果的分析得到一个影响绵羊RFI的SNP(位于绵羊第20号染色体上的ZSCAN12基因下游448bp处即chr20 g.32767656)位点。由于该位点处的碱基有一个G/A突变，从而导致了在该位点的G/A多态性。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

本发明提供了一种与绵羊剩余采食量性状相关的分子标记，该分子标记是基于GWAS结果分析以及对该位点所在的基因组序列进行扩增获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列的第133bp位的R示G或A，由于上述序列在第133位碱基处有一个G/A突变，从而导致了绵羊在该位点的G/A多态性。

SEQ ID NO.1：ATAGTAATGTCAGAGCCACTCTCTCTAATCTGACT GCTCAGTAGAATGCAGTTATTATTTTAAACTTGCTCTCTATTCTTCAGTGCTGTTATTAGCAGTCTCTCCAGTTCATCTGCTTAACATGTTCTCTCARTGCACTCAAGTTCCTCCATTTCCCTCTCAAGTAAAGAGAACTGTAAAGGAACCATAAACAAAGACCCAGAACAATGGACTATGCCTATTATATAGAAGAATGCAGTTCACAACTTATTTAAATTGTGGGAGGTTTGTTCTGGTTGTTTCTTATGCTTAAATACAACTGTGCCAAAAAAAGGGGGGTGCATTG GCATGGGATTTCCAGGTAGGCATCAAAGGGGTCAAACTAGTCCACGATAAGGAAAAGGTAAAAGGTTACCAAATGGAACTAAATTGGCAACAGA。

本发明提供了一种检测上述分子标记的PCR引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或扩增包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

正向引物M-F(SEQ ID NO.2):5＇-ATAGTAATGTCAGAGCCACT-3＇；

反向引物M-R(SEQ ID NO.3):5＇-TCTGTTGCCAATTTAGTTCCA-3＇。

此外，本发明还提供可用于检测SEQ ID NO.1所示的分子标记的Sequ enom SNP检测的PCR引物对和延伸引物，优选地，其PCR引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4，第二引物的核苷酸序列如RSEQ ID NO.5所示序列；延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示序列。

其中，SEQ ID NO.4：5＇-ACGTTGGATGACTTGAGAGGGAAATGG AGG-3＇，

SEQ ID NO.5：5＇-ACGTTGGATGAGCAGTCTCTCCAGTTCATC-3＇，

SEQ ID NO.6：5＇-CGGTAAATGGAGGAACTTGAGTGCA-3＇。

一种检测上述分子标记的检测试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的PCR引物对或Sequenom SNP检测的PCR引物对和延伸引物。

如上所述的检测试剂盒，还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl、PC R反应缓冲液和SAP酶。

一种检测与绵羊剩余采食量性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该序列的第133bp位的R表示G或A，所述方法包括利用上述的PCR引物对或Sequenom SNP检测的PCR引物对和延伸引物或检测试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测，对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

具体检测方法包括如下步骤：

S1、提取绵羊的基因组DNA；

S2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR引物对绵羊基因组DNA进行扩增，并进行测序比对分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用Sequenom SNP引物对检测与湖羊剩余采食量相关分子标记的方法，包括如下步骤：

S1、以湖羊血液为样品，提取基因组DNA；使用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的PCR引物对对绵羊基因组DNA进行扩增；

S2、用SAP酶对步骤S1中获得的PCR产物进行消化获得消化后的产物；

S3、以消化后的产物为模板，利用SEQ ID NO.6所示的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

S4、利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定该SNP位点的基因型。

如上所述的分子标记、PCR引物对、Sequenom SNP检测的PCR引物对和延伸引物或试剂盒的检测方法在影响绵羊剩余采食量性状相关的检测中的应用，通过对待测绵羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的剩余采食量性状的高低，进而筛选出低剩余采食量的经济型的绵羊。

如上所述的分子标记及其多态性位点、用于检测分子标记的PCR引物对、SequenomSNP检测的PCR引物对和延伸引物或试剂盒的检测方法在绵羊辅助育种中的应用，通过利用上述的PCR引物对和延伸引物或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品在绵羊第20号染色体上的ZSCAN12基因下游448bp处即SEQ ID NO.1的第133位的基因型，从而可以从中选育出节粮型的湖羊品种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了影响绵羊剩余采食量性状相关的分子标记，利用Sequenom SNP技术检测绵羊该SNP位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。本发明通过对该分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为GG纯合型绵羊作为种羊选留下来用于育种，从而提高绵羊的饲料效率，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为绵羊剩余采食量的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图，其中，横坐标为绵羊的染色体编号；纵坐标为-logP值。

图2为绵羊剩余采食量的全基因组关联分析(GWAS)的QQ图。

图3为本发明中用于作为分子标记的多态性位点基因组片段的凝胶电泳图；其中，M泳道：DL 2000Marker，1-9泳道：多态性位点所在基因组区域扩增结果。

图4为本发明中多态性位点的测序结果。

图5为本发明中绵羊Chr20:g.32767656A>G突变位点Sequenom SNP技术分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，下面实施例所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1湖羊剩余采食量性状的全基因组关联分析

本发明人在民勤县德福农业科技有限公司利用单栏饲养测定了207只湖羊80-180日龄采食量和体重等性状，计算了剩余采食量，利用Illumina NovaSeq 6000平台对其个体的全血液DNA进行了全基因组重测序，获得了全基因组遗传变异信息，使用rMVP中的FarmCPU方法对剩余采食量性状进行了全基因组关联分析，采用Bonferroni校正定义显著阈值，将-log10(0.05/总snp数)定义为全基因组显著性阈值，将-log10(1/总snp数)定义为全基因组提示性阈值。运用的绵羊基因组序列信息版本号为Oar_rambouillet_v1。结果发现在绵羊20号染色体的ZSCAN12基因下游448bp处即第32767656位点存在一个A/G碱基突变(chr20:32767656A>G)(图1和2)，与绵羊剩余采食量具有显著相关性，该研究结果为提高绵羊饲料效率提供了可靠的数据。

实施例2绵羊chr20:32767656A>G位点所在基因组区域的扩增

(1)引物设计

以绵羊chr20:32767656A>G所在基因组区域的序列设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下：

M-F(SEQ ID NO.2)：5＇-ATAGTAATGTCAGAGCCACT-3＇，

M-R(SEQ ID NO.3)：5＇-TCTGTTGCCAATTTAGTTCCA-3＇

(2)绵羊chr20:32767656A>G所在基因组序列的扩增和测序

PCR扩增采用25μL反应体系，其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix12.4μL，正向引物0.8μL，反向引物0.8μL，ddH

将PCR扩增的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，结果显示得到419bp特异扩增片段。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示，该扩增片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在扩增片段的第133bp位点处存在A/G多态性，即该位点为实施例1基于GWAS鉴别的位点相同如图4所示。

实施例3绵羊chr20:32767656A>G位点的应用

基于民勤县德福农业科技有限公司建立的单栏测定羊舍，在相同的饲养管理条件下，测定了1050只湖羊80-180日龄的采食量和体重等数据，计算了RFI，并采集了每只羊的全血样品，于-20℃保存。其中RFI是根据个体的实际采食量与基于平均日增重和(ADG)和平均中期代谢体重(MBW)的预测采食量来计算的，具体的计算方法参照莫负涛(莫负涛.不同RFI育肥羔羊生产性能和体组成及消化代谢研究.兰州：甘肃农业大学，2016.)构建的回归模型，具体模型如下：ADG＝(BW

基于实施例1和2鉴别的SNP位点，设计利用Sequenom SNP技术检测所述SNP位点的引物组，包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述第二引物的核苷酸序列如S EQ ID No.5所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQID No.6所示。利用第一和第二引物对多态性位点所在区域进行扩增，并使用SAP酶消化PCR产物，将消化后的产物作为模板，使用延伸引物进行延伸，以对延伸产物进行分析，判断其基因型。具体如下：

第一引物(SEQ ID No.4)：ACGTTGGATGACTTGAGAGGGAAATG GAGG；

第二引物(SEQ ID No.5)：ACGTTGGATGAGCAGTCTCTCCAGTTC ATC；

延伸引物(SEQ ID No.6)：CGGTAAATGGAGGAACTTGAGTGCA。

利用Sequenom SNP技术检测与绵羊剩余采食量性状相关的SNP分子标记位点的方法，包括以下步骤：

a)用基因组试剂盒提取上述1050只羊的血液基因组DNA；

b)以a)中提取的基因组DNA为模板，使用本发明的第一引物和第二引物进行PCR扩增获得扩增产物；其PCR反应的反应体系为5μL，包括10ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl

c)用SAP酶对步骤b)中获得的PCR产物进行消化获得消化后的产物，使用的SAP酶消化体系为(7μL)：10×SAP Buffer 0.17μL，1.7U/μL SAP Enzyme0.3μL，ddH

d)以消化后的产物为模板，利用所述的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物，其延伸反应体系为(9μL)：消化后的产物7μL，10×iplex Buffer Plus0.2μL，iplexTerminator 0.2μL，0.6-1.3μmol/L primer mix 0.94μL，iplex Enzyme0.041μL，ddH

e)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定该SNP位点的基因型，其中，部分结果可见结果如图5所示，其中，靠近左侧的黄色点表示AA基因型，靠近中间的绿色点表示GA基因型，靠近右侧的蓝点表示GG基因型。

开展Chr20:g.32767656A>G多态性位点与绵羊剩余采食量性状的关联分析，试验共检测了1050只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与剩余采食量进行关联分析。

Y

其中，Y

基因型检测结果表明在1050个个体中AA基因型有734个，GA基因型有287个个体，GG基因型有29个个体，基因型与性状关联分析的结果如表1所示。

表1绵羊Chr20:g.32767656A>G多态性位点与剩余采食量关联分析

注：同行数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

剩余采食量是衡量畜禽饲料效率高低的理想育种指标，低剩余采食量的个体具有高的饲料转化效率，并且剩余采食量与初始体重、末期体重和平均日增重无显著相关，但与饲料转化率和采食量成显著正相关，因此对其剩余采食量的选择，不会影响其生长性状。本发明的结果显示，Chr20:g.32767656A>G位点与湖羊剩余采食量显著相关。其中AA和GA基因型个体的剩余采食量显著高于GG型个体(P<0.05)，因此Chr20:g.32767656A>G多态性位点作为影响湖羊剩余采食量的潜在分子标记。尤其是采用GG基因型种公羊精液进行人工授精，可以用于绵羊育种，保障绵羊机体健康，增加经济效益。