一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种热稳定性和/或酶活提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用。

背景技术

在许多真核生物和在革兰氏阴性细菌中，谷胱甘肽的合成是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(简称为γ-GCS或GSH I)和谷胱甘肽合成酶(简称为GS或GSH II)共同完成的。而在革兰氏阳性细菌中尚未发现以上两种谷胱甘肽合成酶。直到2005年，研究人员相继在一些革兰氏阳性细菌中发现了一种新型双功能谷胱甘肽合成酶(简称为GshF或γ-GCS-GS)，该酶整合了γ-GCS和GS两种酶的催化活性并定义了谷胱甘肽一步合成的新途径：以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为底物，ATP提供能量，合成谷胱甘肽。目前为止，己在李斯特菌、无乳链球菌、巴斯德菌、嗜热链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、血链球菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌中发现了双功能谷胱甘肽合成酶。

近年来，GshF被广泛用来异源表达，通过发酵法或者体外酶催化法生产谷胱甘肽GSH。Wang等人通过不同载体系统在大肠杆菌中对嗜热链球菌来源的GshF进行表达，在分批补料发酵中，GSH产量可积累到15.21g/L。Cao等人用大肠杆菌表达无乳链球菌来源的GshF，利用体外酶法催化生产GSH，通过优化催化条件和联合多聚磷酸激酶使GSH产量达到12.32g/L。Cui等人通过酶分子改造提高了GshF的稳定性和活性，再联合多聚磷酸激酶使催化体系中GSH产量达到30.71g/L。专利CN116042545A提供了一种酶活性提高的谷胱甘肽双功能合成酶突变体S722A及其应用，对谷胱甘肽双功能合成酶722位点进行定点突变，得到了酶活提高的突变体S722A，其相对酶活较亲本提高了48.93％，谷胱甘肽产量为20.1mmol/L，WT为16.57mmol/L，产量提高了21.46％。

GshF在GSH生物法合成领域具有广阔前景，但是由于酶的稳定性限制，如血链球菌和嗜热链球菌来源的GshF在45℃时的半衰期仅为10.61分钟和0分钟，而且GshF的活力较低，酶比活力在0.1-10U/mg之间，造成酶的添加量高，使用成本高，限制了酶法在工业上的大规模应用。

发明内容

针对目前谷胱甘肽双功能合成酶(GshF)的热稳定性不好和活性较差的问题，本申请通过对双功能谷胱甘肽合成酶基因进行DNA重组以及定点突变和多点突变，使其在提高酶热稳定性的同时还能够保持其优异的催化性能，能够满足工业化生产的需求。

一方面，本申请提供了一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体选自如下任一种：

(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变获得，所述突变为选自如下一个或多个氨基酸残基位点发生突变：14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位；

或，

(b)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体与(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列同源性，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同；

或，

(c)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体由(a)所述的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，优选1-10个，更优选1-6个，更优选1-3个氨基酸残基获得，并且具有(a)所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的功能，其中对应于SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的14位、47位、49位、92位、107位、113位、136位、206位、230位、250位、251位、258位、269位、313位、345位、363位、373位、414位、416位、510位、531位氨基酸残基与(a)所述的氨基酸序列中的位点相同。

在一种实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的至少一种：

14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。

在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的任意一种或两种：

14位的S突变为M，47位的A突变为P，49位的S突变为P，92位的A突变为P，107位的K突变为P，113位的V突变为I，136位的L突变为K，206位的V突变为P，230位的F突变为Y，258位的A突变为P，269位的S突变为D，345位的K突变为R，414位的T突变为E，416位的H突变为P，510位的G突变为A，531位的F突变为Y。

在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下突变中的任意一种或两种：

107位的K突变为P，258位的A突变为P，269位的S突变为D，510位的G突变为A，49位的S突变为P。

在优选的实施方式中，所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示序列的如下氨基酸残基位点产生的如下组突变中的任意一组：

14位的S突变为M，113位的V突变为I；

92位的A突变为P，345位的K突变为R；

92位的A突变为P，230位的F突变为Y；

92位的A突变为P，345位的K突变为R；

206位的V突变为P，230位的F突变为Y；

107位的K突变为P，206位的V突变为P；

136位的L突变为K，531位的F突变为Y；

230位的F突变为Y，414位的T突变为E；

206位的V突变为P，531位的F突变为Y；

136位的L突变为K，414位的T突变为E；

107位的K突变为P，258位的A突变为P；

107位的K突变为P，269位的S突变为D；

107位的K突变为P，510位的G突变为A；

258位的A突变为P，269位的S突变为D；

258位的A突变为P，510位的G突变为A；

269位的S突变为D，510位的G突变为A；

136位的L突变为K，206位的V突变为P；

49位的S突变为P，107位的K突变为P；

49位的S突变为P，258位的A突变为P；

49位的S突变为P，269位的S突变为D。

另一方面，本申请还提供了一种生物材料，所述生物材料包括以下材料中的任意一种：

A1)、核酸分子，编码所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体；

A2)、表达盒，含有A1)所述核酸分子；

A3)、重组载体，含有A1)所述核酸分子和/或含有A2)所述表达盒；

A4)、重组微生物，含有A1)所述核酸分子、含有A2)所述表达盒和/或含有A3)所述重组载体；

A5)、重组细胞，含有A1)所述核酸分子、含有A2)所述表达盒和/或含有A3)所述重组载体；

A6)、全细胞催化剂，含有A1)所述核酸分子、含有A2)所述表达盒、含有A3)所述重组载体、含有A4)所述重组微生物和/或含有A5)所述重组细胞。

在一种实施方式中，A1)所述的核酸分子为如下核酸分子中的任意一种：

a11)、将如SEQ ID NO.2所示的野生型谷胱甘肽双功能合成酶的核苷酸序列进行碱基突变形成的核酸分子，且所述核酸分子能够翻译形成所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的氨基酸序列；

a12)、与a11)中限定的核酸分子具有至少95％同一性，优选至少96％、97％、98％、99％同一性，且编码所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的DNA分子；

a13)、在严格条件下与a11)～a12)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码如权利要求1所述谷胱甘肽双功能合成酶突变体的基因组DNA分子。

可选的，所述碱基突变的方式包括但不限于通过设计引物进行定点突变。

在一种实施方式中，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母中的一种或多种，优选大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组载体包括pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pUC系列、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18的质粒载体。

另一方面，本申请还提供了所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，和/或所述的生物材料在生产谷胱甘肽或生产含有谷胱甘肽的药品、食品和/或化妆品中的应用。

另一方面，本申请还提供了所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，和/或所述的生物材料的下述任一种应用：

I、在调控微生物谷胱甘肽的产量中的应用；

II、在构建谷胱甘肽的基因工程微生物中的应用。

另一方面，本申请还提供了一种构建生产谷胱甘肽的基因工程微生物的方法，包括：向目的微生物导入所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体的编码基因，获得所述基因工程微生物。

另一方面，本申请还提供了一种生产谷胱甘肽的方法，包括：

获得能够表达所述的谷胱甘肽双功能合成酶突变体，或能够获得所述的生物材料的重组生物细胞，利用所述重组生物细胞生产谷胱甘肽。

优选的，所述生物细胞为酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞，优选为细菌，更优选为大肠杆菌。

优选的，底物为谷氨酸钠、甘氨酸和半胱氨酸。

本申请至少具有如下有益效果：

本申请通过对双功能谷胱甘肽合成酶StGshF的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)进行定点突变，发现了一系列突变后其酶活和热稳定性能够发生变化的突变位点，并且经实验可得，实施例中对该系列位点进行单个位点的定点突变获得的单突变体，以及两个位点突变获得的双突变体，其酶活和热稳定性相较于野生型均具有显著提升。本申请提供的酶突变体，在生产谷胱甘肽以及构建生产谷胱甘肽的基因工程微生物中具有广阔的应用前景。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

以下实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术，具体可根据Molecular Cloning:ALaboratory Manual(FourthEdition)进行。

技术术语：

酶突变体：是指通过有控制的对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或辅酶专一性，使之更加符合人类的社会生产、生活需要的一种酶。

引物：是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。

同一性：是指在分子进化研究中，两种核酸分子的核苷酸序列之间或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似程度。

重组：广义上讲，任何造成基因型变化的基因交流过程，都叫做重组。

表达盒：表达盒是指由启动子、靶基因和报道基因等组成，能在特定组织中表达并易于检测的一组DNA序列。

重组载体：重组载体就是在克隆载体基本骨架的基础上转入目的基因，进而使目的基因能够表达的载体。

全细胞催化剂：全细胞生物催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化的过程，相应的参与该催化过程的完整的生物有机体即为全细胞催化剂。

工程菌株(重组微生物)：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。

重组细胞：术语“重组细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

在本申请中，20种天然氨基酸中文全称、三字母缩写及其单字母缩写的对应关系为：

精氨酸：Arg，R；

组氨酸：His，H；

赖氨酸，Lys，K；

天冬氨酸，Asp，D；

谷氨酸：Glu，E；

丝氨酸，Ser，S；

苏氨酸，Thr，T；

天冬酰胺，Asn，N；

谷氨酰胺：Gln，Q；

半胱氨酸，Cys，C；

甘氨酸，Gly，G；

脯氨酸，Pro，P；

丙氨酸，Ala，A；

异亮氨酸，Ile，I；

缬氨酸，Vla，V；

亮氨酸，Leu，L；

甲硫氨酸，Met，M；

苯丙氨酸，Phe，F；

酪氨酸，Tyr，Y；

色氨酸，Trp，W。

实施例1：双功能谷胱甘肽合成酶(StGshF)表达载体构建

选取来源于嗜热链球菌S.thermophilus的双功能谷胱甘肽合成酶(StGshF)基因(GenBank:ADD63794.1)，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的PCR产物纯化后，用Nco I和Xho I核酸内切酶进行双酶切消化处理，与经相同酶消化的pET-28a载体用T4连接酶16℃过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含有1.5％琼脂的LB(含100μg/μL的卡那霉素)平板，重组载体命名为pET-28a-StGshF。

实施例2：单个定点突变位点的确定

具体方法如下：

(1)靶位点设计和分析

a.同源建模

通过SWISS-MODEL在线软件对双功能谷胱甘肽合成酶的序列进行同源建模，获得其三维空间结构。使用MEGA7.0进行多序列比对，使用PyMol对其模型进行可视化分析和处理。

b.模型验证

利用PROCHECK和Verify-3D程序对模型进行评估。Ramachandran plot用于阐述肽平面内两个二面角(φ与ψ)的比值，以表明氨基酸残基的允许和不允许的构象，通过PROCHECK计算的Psi/Phi Ramachandran图来评估模型的立体化学可靠性。蛋白质侧链氨基酸残基的兼容性通过Verify-3D软件进行评价，至少80％氨基酸残基得分≥0.2则通过验证。

c.酶与配体的分子对接

采用Discoverystudio软件中的分子对接程序进行分子对接，根据其相互作用热区匹配的原理对接到酶的结合口袋中，观察其间的相互作用。

d.拟突变氨基酸及其替换对象的选择

基于不同来源的双功能谷胱甘肽合成酶的同源多序列比对，排除保守氨基酸位点，选择非保守位点上的氨基酸作为拟突变氨基酸，将它们替换为性质相似或其他双功能谷胱甘肽合成酶中出现频率高的氨基酸，形成一系列拟突变酶。

e.突变位点的获得

运用程序分别将各种拟突变酶与配体进行分子对接模拟，分别计算各种对接复合物的结合自由能，其值越低，表明受体与配体之间的亲和力越高，从而以提高酶活力，得到突变位点。

实施例3：单突变体的制备和表达

利用SDM PCR技术，以原始的质粒pET-28a-StGshF为模板进行定点突变，获得携带编码双功能谷胱甘肽合成酶突变体的重组质粒pET-28a-StGshF-X，其中，定点突变方法如下：

PCR程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，64℃退火30s，72℃延伸6min，循环20次；72℃延伸10min。

Dpn I消化：PCR产物19μL，Dpn I 0.5μL，37℃1h。

然后将得到的重组载体pET-28a-StGshF-X分别转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆送交北京擎科生物技术有限公司进行DBA测序分析确定正确的转化子。

本申请实施例中获得突变体所采用的引物序列如表1所示(引物序列中加粗及下划线部分为突变位点对应的碱基)：

表1

将测序正确的质粒转入BL21感受态细胞，挑取单菌落接种于含有100g/L卡那霉素的试管里(10mL LB)过夜培养，转接至50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD 

实施例4：酶活测定

底物谷氨酸钠、甘氨酸和半胱氨酸在StGshF的催化下，以ATP提供能量，生成谷胱甘肽(GSH)。通过测定生成产物GSH的量从而计算出StGshF的酶活。

一个酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 8.0的条件下，单位时间内催化产生1μm谷胱甘肽所需的酶量定义为1U。

具体的测试步骤如下：

反应体系的组成及浓度见表2：

表2

反应步骤：于30℃反应5min，然后添加等体积的3M HCl进行终止，12000rpm离心5min测定GSH的含量。

GSH含量的检测方法：使用Wondasil C18柱(4.6×250mm，GL Sciences Inc.，日本)的HPLC系统(Shimadzu，Kyoto，Japan)在25℃，210nm下检测GSH的产生。流动相：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠6.8g与庚烷磺酸钠2.2g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(96：4)为流动相，进样体积10μL。

各单突变体测定的相对酶活力结果见表3：

表3单突变体酶活

由表3的结果可知，本申请所得到的突变体酶活相较于野生型的酶活性显著增加，酶活力最高可提高一倍以上。

实施例5：双突变体的制备与表达

选择与野生型的相对活性相比酶活提高较多的突变位点中的13个变异体，即表2中的G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G10、G11、G13、G16、G17和G18，分析相应基因的碱基序列并分析氨基酸突变信息，进行组合突变并表达，其中表达载体的构建方法和实施例1相同，制备方法与实施例3相同，得到双突变体，并采用与实施例4相同的方法测定获得的双突变体的相对酶活力，所得结果如表4所示：

表4双突变体酶活

由表4的结果可知，本申请所得到的双突变体具有较高的催化活性，其相对于野生型的相对酶活力最高提高243.2％。

实施例6：热稳定性单突变体的酶活残留量测定

将上述纯化的双功能谷胱甘肽合成酶酶液稀释一定倍数后，在40℃下温育10min取出，放于冰上10min，测定30℃下的酶的残余活性，与未经40℃处理的酶液进行酶活力比较。发现描述过的变体比野生型在40℃下的稳定性有所变化，酶活残留结果如表5所示。

其中，酶活力计算公式：

式中：

A：酶活(单位：U/mL)；

C：反应中生成的谷胱甘肽浓度(单位：mg/mL)；

V1：反应体系体积(单位：mL)；

D：酶液的稀释倍数；1000：将产物谷胱甘肽由mg数转化为μg数；

M：生成的产物谷胱甘肽的分子量(307.32)；

T：酶液的反应时间(单位：min)；

V2：加入酶液的体积(单位：mL)。

表5单点突变后酶活力变化

实施例7：热稳定性双突变体的酶活残留量测定

选择突变较优的结果S49P、K107P、A258P、S269D和G510A进行组合突变，突变方法和纯化方法和单点突变一致，将上述纯化的双功能谷胱甘肽合成酶酶液稀释一定倍数后，在40℃下温育30min取出，放于冰上10min，测定30℃下的酶的残余活性，与未经40℃处理的酶液进行酶活力比较，发现比野生型在40℃下的稳定性有所变化，酶活残留结果如表6所示。

表6双点突变后酶活力变化

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。