一种电化学发光芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物芯片与体外诊断交叉领域，具体而言，涉及一种电化学发光芯片及其制备方法与应用。

背景技术

心肌梗死是威胁人类健康的重要心血管疾病之一。早期通过发现心肌梗死引起的心肌细胞损伤和心脏功能不全等情况，对心肌梗死患者疗效及预后的观察、疾病致死率的降低等方面都具有非常重要的临床意义。心肌梗死的标志物是由于心肌梗死发生时，心肌损伤时所致，心肌梗死标志物拥有特异度及灵敏度，是广泛用于心肌损伤或者异常的筛查、诊断、评价预后及随访疗效的标志物。肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)是最常见的心肌梗死标志物。

目前心肌梗死标志物常规检测技术有放射性免疫法、高压液相色谱分析法、电化学分析法、蛋白质分析仪、各种诊断试剂盒及免疫层析试条等，这些技术会存在不同的一些缺点，比如：放射性污染、需要大型仪器、耗时长、不能定量检测或者灵敏度不高、准确度不够等等，在临床上应用具有一定局限性。

现在已有此类型临床检测芯片多为胶体金试纸条外加槽式结构或者观察仓，比如专利文献：CN1363839A，是由载体盒和蛋白质试纸条组成的一种早期心肌梗死诊断生物芯片，又比如专利CN201707336U，公开了一种快速定量检测cTnI的试纸条装置，但该专利只能实现一种心梗标志物cTnI的检测，无法对心肌梗死的严重程度做出更为准确的判断。中国发明专利CN102305866A，一种快速诊断急性心肌梗死的检测装置，可以同时检测三种心肌梗死标志物。但是用荧光标记的方法检测抗原，无法排除激发光对信号检测灵敏度和准确性的影响，同时，由于其存在加样系统和激发检测系统，其配套仪器体积无法小型化。有鉴于此，需要开发一种全新的可应用于临床的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种全新的具有高灵敏度、高准确度和小型化的心肌梗死指标检测方法。

为解决上述问题，本发明第一方面提供一种电化学发光芯片，所述电化学发光芯片从上至下包括PDMS片和玻璃基片，所述PDMS片的面积小于玻璃基片，所述玻璃基片)与PDMS片相互贴合，所述PDMS片开设有穿透PDMS片的进样口和出样口，所述PDMS片的下贴面从进样口至出样口依次开设有第一检测腔、第二检测腔、第三检测腔、第四检测腔，所述进样口与所述出样口之间通过流道连接，所述流道上自进样口至出样口方向依次设置有第一检测腔、第二检测腔、第三检测腔、第四检测腔；所述玻璃基片的上贴面具有第一工作电极、第二工作电极、第三工作电极、第四工作电极，所述第一工作电极外环绕有第一对电极，所述第二工作电极外环绕有第二对电极，所述第三工作电极外环绕有第三对电极，所述第四工作电极外环绕有第四对电极，所述第一对电极、第二对电极、第三对电极、第四对电极均具有开口并允许金属溅射层穿过；所述第一工作电极和所述第一对电极均与被第一检测腔完全贴合覆盖，所述第二工作电极和所述第二对电极均被所述第二检测腔完全贴合覆盖，所述第三工作电极和所述第三对电极均被所述第三检测腔完全贴合覆盖，所述第四工作电极和所述第四对电极均被所述第四检测腔完全贴合覆盖，所述玻璃基片还包括第一焊点、第二焊点、第三焊点、第四焊点、第五焊点、第一金属溅射层、第二金属溅射层、第三金属溅射层、第四金属溅射层、第五金属溅射层，所述第一焊点、第二焊点、第三焊点、第四焊点、第五焊点均位于PDMS片与玻璃基片重叠范围之外，所述第一焊点与所述第一工作电极通过第一金属溅射层电连接，所述第二焊点通过第二金属溅射层与所述第二工作电极电连接，所述第三焊点通过第三金属溅射层与所述第三工作电极电连接、所述第四焊点通过第四金属溅射层与所述第四工作电极电连接，所述第一对电极与所述第五焊点通过第五金属溅射层电连接，所述第二对电极与所述第五焊点通过第五金属溅射层电连接，所述第三对电极与所述第五焊点通过第五金属溅射层电连接，所述第四对电极与所述第五焊点通过第五金属溅射层电连接，所述第一工作电极具有肌钙蛋白Ⅰ单抗修饰，用于检测肌钙蛋白Ⅰ，所述第二工作电极具有肌红蛋白一抗修饰，用于检测肌红蛋白，所述第三工作电极具有血清肌酸激酶同工酶一抗修饰，用于检测血清肌酸激酶同工酶，所述第四工作电极无修饰，用于背景呈现。本发明提供的电化学发光芯片结合微流控技术和电化学发光技术，在使用时需要的检测液极少，灵敏度高、准确度高。

优选地，所述第一金属溅射层、第二金属溅射层、第三金属溅射层、第四金属溅射层第五金属溅射层的材质均选自材质均选自Cr/Au层、铂、银、石墨、ITO、玻碳中的一种或多种。

优选地，所述第一金属溅射层、第二金属溅射层、第三金属溅射层、第四金属溅射层第五金属溅射层的厚度均为50～500nm。

优选地，所述PDMS片的厚度为2～10mm，所述进样口为圆形，所述进样口的直径为1～5mm，所述出样口为圆形，所述出样口的直径为1～5mm。

进一步地，本发明第二方面提供一种前述电化学发光芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1、PDMS片的制备：

S11：采用单晶硅作为衬底，利用旋涂机在硅片上旋涂光刻胶，旋涂结束后进行前烘干，前烘干温度为60～68℃，烘干时间为25～35分钟，前烘干结束后依据设计版图进行光刻，光刻结束后进行后烘干，后烘干的温度为90～98℃，烘干时间为25～35分钟，后烘干结束后利用显影液显影，去除胶并清洗，形成设计高度的微结构，95摄氏度下硬烘30分钟，得到具有不同高度微结构的硅片模具；

S12：将步骤S11制得的硅片模具放入氟硅烷气氛中孵育200～300min，将PDMS预聚物和固化剂混合均匀后进行真空干燥后取出PDMS混合物，在硅片模具中浇铸PDMS混合物，将浇铸后的模具固化，剥离PDMS片，在PDMS片上打孔形成进样口和出样口，将打孔后的PDMS片放入等离子清洗机，真空环境保持50～70min，辉光照射100～120s，取出PDMS片，在进样口和出样口位置处滴加PEG-硅氧烷与丙酮混合溶液(V:V＝1:1)，室温孵育40～80min后使用超纯水进行冲洗；

S2、玻璃基片的制备：采用单抛玻璃基片作为衬底，进行等离子清洗，清洗条件为真空环境保持50～70min，辉光照射100～120s，使用涂胶机将光刻胶涂覆在玻璃基片的抛光表面，进行光刻，光刻条件为曝光15s后显影，得到需要的图案，通过溅射获得金属溅射层，去除多余的光刻胶以及金属，保留Au电极；

S3、抗体修饰：对芯片四个不同工作电极的蛋白修饰，对第一工作电极修饰肌钙蛋白Ⅰ的单抗，对第二工作电极修饰肌红蛋白的一抗，对第三工作点击修饰血清肌酸激酶同工酶的一抗，第四工作电极不做修饰，修饰结束后，进行等离子清洗，清洗条件为真空环境保持50～70min，辉光照射100～120s，取出后以结构面相迎合的方式迅速在显微镜下键合玻璃基片和PDMS片，制得电化学芯片。

优选地，所述步骤S12中，所述PDMS预聚物和固化剂的质量比为(13～17):1。

优选地，所述步骤S12中，真空干燥的环境为真空度为13psi，静置25～40min。

本发明第三方面提供一种前述电化学发光芯片的应用，所述应用包括将前述电化学发光芯片应用于制备治疗和/或预防心肌梗死的药物与试剂盒。

本发明具备的有益效果：本发明提供一种基于电化学发光技术的心肌梗死快速临床诊断芯片，该芯片通过电化学发光和微流控技术相结合，可以同时检测心肌梗死相关的三种标志物肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)，具有检测所需时间短，应用效率高，检测准确度好，配套仪器小，操作简单，所需样品量少，所需试剂量少等优点。

附图说明

图1为本发明具体实施方式提供的电化学发光芯片的整体俯视图；

图2为本发明具体实施方式提供的电化学发光芯片的PDMS下贴面构造图；

图3为本发明具体实施方式提供的电化学发光芯片的玻璃基片上贴面构造图。

附图标记说明：1、PDMS片；2、进样口；3、出样口；4、第一检测腔；5、第二检测腔；6、第三检测腔；7、第四检测腔；8、流道；9、玻璃基片；10、第一焊点；11、第二焊点；12、第三焊点；13、第四焊点；14、第五焊点；15、第一工作电极；16、第二工作电极；17、第三工作电极；18、第四工作电极；19、第一对电极；20、第二对电极；21、第三对电极；22、第四对电极；231、第一金属溅射层；232、第二金属溅射层；233、第三金属溅射层；234、第四金属溅射层；235、第五金属溅射层。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。需要说明的是，以下各实施例仅用于说明本发明的实施方法和典型参数，而不用于限定本发明所述的参数范围，由此引申出的合理变化，仍处于本发明权利要求的保护范围内。

需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

参阅图1，为解决现有心肌梗死检测试剂盒或一起灵敏度低、准确度低、耗时长的缺点，本发明的具体实施方式提供一种电化学发光芯片，该电化学发光芯片自上而下包括PDMS片1和玻璃基片9，且PDMS片1的面积小于玻璃基片9，二者相互贴合，在本实施方式中，PDMS片1上开有两个贯穿上下的孔，分别为进样口2和出样口3，在本实施方式中，进样口2和出样口3为圆形，直径为3mm，在另外一些实施方式中，进样口2和出样口3也可以为方形或其他规则图形，进样口2主要用于样品、清洗液以及反映试剂的进入，出样口3主要用于样品、清洗液或反应后的反应液的流出。

参阅图1和图2，在上述实施方式中，PDMS片1下贴面设置有第一检测腔4、第二检测腔5、第三检测腔6、第四检测腔7，第一检测腔4与进样口2之间通过流道8连接，第一检测腔4和第二检测腔5之间通过流道8连接，第二检测腔5和第三检测腔6之间通过流道8连接，第三检测腔6和第四检测腔7之间通过流道8连接，第四检测腔7和出样口3之间通过流道8连接，在本实施方式中，进样口2与第一检测腔4之间的流道8的宽度为1mm，长度为1cm，高度为50μm，第一检测腔4与第二检测腔5之间、第二检测腔5与第三检测腔6、第三检测腔6与第四检测腔7的流道8的长度为4mm，宽度为200μm，高度为50μm。

参阅图1和图3，在上述实施方式中，电化学发光芯片的玻璃基片9的上贴面上具有四个工作电极、四个对电极和五个焊点，四个工作电极分别为与第一检测腔4相贴合的第一工作电极15、与第二检测腔5相贴合的第二工作电极16、与第三检测腔6相贴合的第三工作电极17、与第四检测腔7相贴合的第四工作电极18，第一工作电极15外环绕有对应的第一对电极19，第二工作电极16外环绕有对应的第二对电极20，第三工作电极17外环绕有对应的第三对电极21，第四工作电极18外环绕有对应的第四对电极22，在本实施方式中，所有的检测腔应将工作电极-对电极全部覆盖，以确保电化学发光的顺利进行。在本实施方式中，第一工作电极15与第一焊点10通过第一金属溅射层231连接，第二工作电极16与第二焊点11通过第二金属溅射层232连接，第三工作电极17与第三焊点12通过第三金属溅射层233连接，第四工作电极18与第四焊点13通过第四金属溅射层234连接，第一对电极19、第二对电极20、第三对电极21、第四对电极22均通过第五金属溅射层235与第五焊点14连接。在本实施方式中，为保证所有的检测腔正常工作，所有的焊点应当外接电压并裸露，不应被PDMS片1覆盖。

参阅图3，在本实施方式中，电化学发光芯片的第一工作电极15修饰肌钙蛋白Ⅰ，第二工作电极16修饰肌红蛋白一抗，第三工作电极17修饰血清肌酸激酶同工酶的一抗，第四工作电极18不做修饰以作为背景参数。

本发明的具体实施方式还提供一种前述电化学发光芯片使用方法，包括基于硅光电倍增管或者光电倍增管的电化学发光检测仪器，以及仪器和芯片搭配使用的检测方法。即基于该芯片，实现心肌梗死的快速临床诊断。(硅)光电倍增管仪器是一种由(硅)光电倍增管作为光敏检测元件的检测仪器，其可以提供电化学发光检测芯片所需要的黑暗环境、所需电压以及电化学发光检测。黑暗环境是指电化学发光芯片在电化学发光反应发生时，仪器检测芯片内反应发出的光信号，因此需要黑暗环境，保证尽量少的信号干扰。仪器提供所需电压是指电化学发光芯片需要工作接入或者给予工作电压才能发生电化学发光反应。因此需要该仪器提供工作电压，保证诊断芯片正常工作。发光信号作为心肌梗死标志物的反应指标，因此仪器需要提供可靠的发光检测。

在使用本发明具体实施方式提供的电化学芯片时，可使用移液枪或自动取样器将待测样品注入进样口2，待测样品注入进样口2后依次通过流道流入第一检测腔4、第二检测腔5、第三检测腔6、第四检测腔7，进行孵育，使芯片内第一工作电极15上的肌钙蛋白Ⅰ一抗、第二工作电极16上的肌红蛋白一抗、第三工作电极17上的血清肌酸激酶同工酶一抗、第四工作电极18与待测样品进行充分反应，反应完成后，将清洗液注入进样口2，从出样口3清洗出未反应的样品，在清洗完成后，向第一工作电极15、第二工作电极16、第三工作电极17加入相应带有电化学发光底物的心肌梗死标志物的二抗，室温孵育后加入清洗液清洗出未反应的二抗，将芯片置于检测仪器中，保证黑暗冰施加电压后，四个检测腔中将发生电化学发光反应，检测仪器对发光信号进行采集后，根据标准曲线可直接确定相关检测物的浓度指标。

实施例1

电化学发光芯片的制备

1.将硅片模具放入氟硅烷气氛中孵育4h，以方便后续PDMS芯片与模具之间的剥离；

2.按照重量比为15：1的比例称量PDMS预聚物和固化剂，置于容器中，将二者用玻璃棒搅拌均匀，将容器放入真空干燥器中，抽真空至真空度为13psi，静置30min除去气泡；

3.取出PDMS混合物，将硅片模具放置在水平台上，浇注PDMS，静置30min，使模具中充满PDMS；将模具放入烘箱中，80℃下加热1h，待PDMS完全固化，将PDMS从硅片上小心地剥离下来；

4.使用特定孔径的针头，在PDMS芯片上的进样口2、出样口3的位置上进行打孔；将PDMS芯片放入等离子清洗机，真空下保持1h，照射辉光2min；

5.取出芯片，在进样口2处滴加PEG(6-9)-硅氧烷与丙酮混合溶液(V:V＝1:1)，利用PDMS芯片内的负压作为驱动力，使混合溶液充满整个芯片内腔及管道，室温孵育1h；之后用超纯水冲洗，使PDMS芯片内各内腔及管道表面均呈亲水性，以减少各内腔及管道对样品中无关蛋白的非特异性黏附。

电极所在玻璃基片9的制作过程如下：用四寸单抛的玻璃基片9作为衬底，首先进行等离子处理及清洗，将玻璃衬底放入等离子清洗机，真空下保持1h，照射辉光2min；使用涂胶机将LC100A光刻胶均匀的涂覆在玻璃基片9抛光表面；光刻：曝光15s后显影，得到需要的图案。溅射：在整块玻璃基板上溅射一层厚度为100/1000a的Cr/Au层

去胶：将不需要图形的光刻胶去掉，同时可以去除多余金属，只保留Au电极块和电极引线。

临床诊断所需抗体的修饰：对芯片四个不同工作电极的蛋白修饰，对工作电极1修饰肌钙蛋白I的一抗，对工作电极2修饰肌红蛋白的一抗，对工作电极3修饰血清肌酸激酶同工酶的一抗，对工作电极4不进行修饰，作为背景参数。

分别制作完成后，将PDMS片1与上述修饰好一抗的电极玻璃基片9放入等离子清洗机，真空状态下辉光照射两分钟，取出后以结构面相迎合的方式迅速在显微镜下对准键合，使两者键合牢固。

实施例2

键合后的心肌梗死电化学发光芯片，通过进样口2加入BSA溶液，待芯片内进满BSA溶液后，室温下孵育5分钟，防止非特异性反应的发生。使用清洗液清洗未反应的BSA，清洗完成后，在进样口2加入不同标准浓度的肌钙蛋白I(cTnI)，待芯片内进满该抗原后，将芯片室温下孵育5分钟，使芯片内的一抗与样品中的待检测物(抗原)充分反应。待反应完成后，从恒温箱中取出芯片，从进样口2加入清洗液，用清洗液清洗出芯片内未反应的样品。清洗完成后，加入带有电化学发光底物的cTnI的二抗。然后置室温下孵育5分钟，使cTnI和二抗充分反应，待反应完成后，再次从进样口2加入清洗液，用清洗液清洗出未反应的二抗。

清洗完成后，将芯片置于检测仪器中，使芯片处于黑暗环境下，使芯片的焊点与仪器相连，仪器可以通过与焊点的连接控制对检测腔施加工作电压，该反应腔进行电化学发光反应，检测仪器电化学发光信号进行采集，可以检测出该抗原钙浓度下的的信号，依次检测出不同标准浓度的cTnI对应的电化学发光信号，即可得出cTnI的标准曲线。

按照前述方法，依次可测试出肌红蛋白(Myo)和血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)的标准曲线。

实施例3

键合后的心肌梗死电化学发光芯片，通过进样口2加入BSA溶液，待芯片内进满BSA溶液后，室温下孵育5分钟，防止非特异性反应的发生。使用清洗液清洗未反应的BSA，清洗完成后，在进样口2加入人血清样品，待芯片内进满血清样品后，将芯片室温下孵育5分钟，使芯片内的一抗与样品中的待检测物(抗原)充分反应。待反应完成后，从恒温箱中取出芯片，从进样口2加入清洗液，用清洗液清洗出芯片内未反应的样品。清洗完成后，加入带有电化学发光底物的心肌梗死标志物的二抗，包括肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)三种标志物的二抗。然后置室温下孵育5分钟，使芯片内的与一抗结合的样品中的待检测物(抗原)和二抗充分反应，待反应完成后，再次从进样口2加入清洗液，用清洗液清洗出未反应的二抗。

清洗完成后，将芯片置于检测仪器中，使芯片处于黑暗环境下，使芯片的焊点与仪器相连，仪器可以通过与焊点的连接控制是否对某个电极所在的反应腔施加工作电压，当对某个反应腔施加工作电压时，特定的反应腔进行电化学发光反应，检测仪器检测电化学发光信号不同时间对不同电极施加工作电压，然后对电化学发光信号进行采集，可以检测出不同反应腔的信号，根据实施例2中的标准曲线，即可得出目标检测物的浓度。

除非另有定义，本文中使用的所有术语、符号和其他科学术语旨在具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况下，本文处于阐明或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中此类限定不应理解为表示与本领域常规理解具有显著差异。本文所述或所引用的技术方法一般已有本领域技术人员充分了解并通过常规方法采用。除非另有说明，涉及市售可得的仪器的使用均按照生产商给出的方案和参数进行。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。