一种含有黄漆木提取物的预防眼损伤组合物

技术领域

本发明涉及一种含有黄漆木(Dendropanax morbifera)提取物作为活性成分的组合物及其用途。

背景技术

由于眼睛是最重要的感觉器官，因此眼睛的功能损伤或丧失是降低生活质量的最大因素之一。现代人将他们的大部分时间花费在诸如计算机和智能电话的各种数字屏幕前面，并且由于LED被频繁地用在智能设备屏幕上，蓝光让眼睛健康恶化。

蓝光是可见光中呈现400nm至500nm范围内的蓝色的光，并且当长时间暴露于蓝光时，其刺激视神经、引起眼睛疲劳并且成为各种眼睛疾病的原因。由于蓝光具有高能量和高穿透能力，因此在照原样进入眼睛时，其使得视网膜上的焦点不透明并且降低锐度，并且长期暴露于蓝光引起视网膜的老化和退化。已知蓝光对人体的影响包含干眼和眼疲劳、视敏度的降低和各种眼病、加速的视网膜老化、黄斑变性和由于褪黑激素产生的抑制引起的失眠(Ganka Gakkai Zasshi.2001Oct；105(10):687–95；Archives of Ophthalmology 1992；110:99–104；Review of Ophthalmology Oct 15 2003；10(10))。

已知代谢副产物由于蓝光的作用而在整个生命中在视网膜细胞中累积，并且特别是，此累积最活跃地发生在视网膜中心下的视网膜色素上皮细胞中，视网膜中心下的视杆细胞光感受器高度集中。这些代谢废物副产物中最重要的一个是脂褐素组分N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2E)，高浓度的A2E成为参与视网膜色素上皮细胞死亡的主要原因。此外，即使在低浓度下，A2E也被蓝光光氧化，并以环氧化物的形式变为过氧A2E和呋喃A2E。A2E的高反应性环氧化物形式引起氧化应激和炎症反应，并改变线粒体蛋白活性，从而诱导凋亡。结果，正常视网膜色素上皮细胞功能的丧失导致感光细胞的继发性死亡。特别是，在其中感光细胞密集集中的黄斑的情况下，其被严重损伤，导致黄斑变性。即，黄斑变性与糖尿病性视网膜病的区别在于黄斑变性是由蓝光引起的视网膜中细胞氧化应激导致的A2E氧化引起的，而糖尿病性视网膜病是由高血糖水平引起的糖化产物和血管生成因子如VEGF的作用引起的。

黄斑变性可以分为两种类型：干性(非渗出性)黄斑变性和湿性(渗出性)黄斑变性。干性黄斑变性占所有黄斑变性患者的约90％，并且干性黄斑变性的特征在于被称为玻璃疣的废物累积在视网膜色素上皮和布鲁赫膜之间，导致黄斑组织萎缩或变薄。相反，湿性黄斑变性占所有黄斑变性患者的约10％，并且它是指其中正常血液和营养物不被供给黄斑，导致异常新血管的形成和其破裂，并因此导致血液或粘液渗漏到黄斑中，从而导致严重的视力丧失的状况。由于干性黄斑变性的早期症状是无症状的，或者即使存在症状，也容易忽略，因为其被认为是老花眼。然而，如果干性黄斑变性的进展没有被抑制或治疗，则由于连续的视网膜损伤可能发生视力丧失，并且它可能进展为湿性黄斑变性并导致失明；因此，重要的是在早期预防干性黄斑变性。

先前发布的与眼睛健康相关的产品是合成治疗，其由于长期使用合成化合物而引起副作用。因此，需要开发源自通常作为食物消费而不是人工合成的特定化合物的天然产品的改善眼睛健康的材料。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种用于预防由蓝光引起的眼睛损伤的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或改善由蓝光引起的眼损伤的健康机能食品。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗由蓝光引起的眼病的组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种用于预防眼损伤的组合物，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

本发明的另一个方面提供了一种用于预防或改善眼损伤的健康机能食品，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

本发明的又一方面提供一种用于预防或治疗眼部疾病的药物组合物，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

有益效果

本发明的含有黄漆木提取物的组合物，具有优异的抑制蓝光引起的A2E氧化的活性，抑制氧化的A2E诱导的视网膜色素上皮细胞死亡的活性，并且抑制玻璃疣的累积的活性，因此可以用于预防蓝光引起的眼睛损伤。另外，本发明的含有黄漆木提取物的组合物，可以开发成由蓝色光引起的各种眼睛疾病的治疗剂和健康机能食品。

本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员从以下描述中将清楚地理解未提及的其它效果。

附图说明

图1是显示在人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中，通过蓝光处理而增加的A2E的光氧化，通过使用黄漆木提取物处理而被显著抑制的图。

图2是显示在人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中，通过使用黄漆木提取物处理，抑制玻璃疣累积的效果的图。

图3是显示在人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中，通过蓝光处理而降低的细胞活性，通过使用黄漆木提取物处理而显著增加的图。

图4显示了在向动物模型投投予试验药物后，通过显微镜观察的视网膜的外核层(ONL)厚度的图，其中诱导了类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失。

图5是显示视网膜外层的厚度的图，其在动物模型中通过光源的过度照射诱导类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失而减少，并通过用黄漆木提取物处理而增加。

图6是显示视细胞活性的图，其在动物模型中通过光源的过度照射诱导类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失而降低，并通过用黄漆木提取物处理而增加。

图7显示了在向动物模型投予试验药物后，视网膜的外核层(ONL)厚度的图，其中通过投予N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)诱导通过显微镜观察到与干性黄斑变性类似的视神经细胞损失。

图8是显示视网膜外核层的厚度的图，其在动物模型中通过投予N-甲基-N-亚硝基脲诱导类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失而减少，并通过用黄漆木提取物处理而增加。

图9显示了通过显微镜观察的位置的图，其中通过向动物模型投予试验药物发生视网膜组织的折叠变形，其中通过投予碘酸钠(NaIO

图10是显示视网膜色素上皮细胞损伤的图，其在动物模型中通过投予碘酸钠(NaIO

图11显示了通过显微镜观察的细胞的图，其中通过向动物模型投予试验药物在视神经的细胞核层中发生TUNEL阳性反应，其中诱导了类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失。

图12是显示动物模型中凋亡反应增加的图，其中诱导了类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失，并通过用黄漆木提取物处理而减少。

图13是显示在诱导了与干性黄斑变性相似的视神经细胞损失的动物模型中，通过用黄漆木提取物处理，使得作为诱导凋亡的促凋亡因子的Bax的表达降低、作为抗凋亡因子的Bcl-2的表达增加、裂解形式的半光天冬酶3的表达增加降低，的图。

图14表示向动物模型投予试验药物后显微镜观察到的ZO-1的图像，该蛋白构成紧密连接，其中位于该模型上部的视网膜组织诱导了形态学变形。

图15是表示黄漆木提取物改善黄斑变性的作用机理的图。

具体实施方式

以下，将详细描述本发明。

本发明的一个方面提供了一种用于预防眼损伤的组合物，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

“黄漆木”属于五加科(Araliaceae)，并当然包含其亚种及其变种。另外，本发明的黄漆木包含在本领域中显而易见的相同属的草药，并且可以用于本发明的预防、改善和治疗目的相同或相似目的。

“提取物”包含提取物本身，以及可以使用液体提取物形成的所有制剂的提取物，例如通过黄漆木的提取处理获得的提取物、提取物的稀释或浓缩溶液、通过干燥提取物获得的干燥产物、提取物的粗产物或纯化产物、及其混合物。例如，本发明的提取物可以在提取后以干粉形式制备并使用。

该黄漆木提取物可从黄漆木的天然、杂交或变异植物中提取，也可从植物组织培养物中提取。此外，该黄漆木提取物可以从黄漆木的叶、茎、根、花、种子中提取。

对上述黄漆木提取物的提取方法没有特别限定，可以按照本领域通常使用的方法进行提取。提取方法的非限制性的例子可以包括：热水提取法、超声波提取法、过滤法、回流提取法等，可以单独使用，也可以组合两种以上使用。

对用于提取上述黄漆木提取物的提取溶剂的种类没有特别限定，可以使用本领域公知的任意溶剂。提取溶剂的非限制性的例子可以包括水；C

“眼损伤”可以由蓝光引起，并且可以具体地表示由蓝光引起的A2E的光氧化及其累积引起的眼损伤。更具体而言，眼损伤可以指由眼睛的氧化损伤、眼睛的老化、眼睛疲劳、眼睛功能的退化、或眼睛疾病引起的眼损伤，但不限于此。

眼病可以是由蓝光引起的眼病，并且可以具体指与蓝光引起的A2E光氧化和玻璃疣累积相关的视网膜疾病。具体而言，所述眼病可以指选自由视网膜变性、黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、斯塔加特病、无脉络膜症、回环萎缩、视网膜脱离、视神经病、和干眼综合征组成的组中的一种或多种类型，但不限于此。

在本发明的一个具体实施方式中，为了确认黄漆木提取物对防止由蓝光引起的眼睛损伤的效果，用黄漆木提取物与蓝光一起处理视网膜色素上皮细胞来测量A2E的光氧化程度，结果，确认了由蓝光引起的A2E的增加的光氧化，通过用黄漆木提取物处理而明显被抑制。

另外，为了确认防止由氧化A2E引起的细胞损伤的效果，用黄漆木提取物与蓝光一起处理视网膜色素上皮细胞来确认细胞活性，结果，确认了由蓝光引起的降低的细胞活性，通过用黄漆木提取物处理而明显增加。

另外，通过照射蓝色光来确认玻璃疣的累积程度，确认了玻璃疣的累积，通过使用黄漆木提取物的处理而减少。

此外，确认了因光照射而变薄的视网膜的外核层的厚度，通过利用黄漆木提取物进行处理而增加，并且视细胞的活性降低通过利用黄漆木提取物进行处理而改善。

此外，确认了在药物诱导黄斑变性的动物模型中，视网膜色素上皮细胞的损伤或变形，通过用黄漆木提取物处理抑制视网膜组织的变形而改善。

此外，确认了用黄漆木提取物处理抑制了由光照射诱导的视网膜细胞死亡，从而改善了视神经细胞的损伤，并维持视网膜色素上皮细胞的紧密连接，从而改善了视网膜色素上皮细胞的损伤。

因此，显然所述黄漆木提取物通过抑制A2E的氧化而防止对视网膜色素上皮细胞的损伤，并且通过抑制玻璃疣的累积而具有抑制视网膜组织萎缩或形态变化的活性，因此，所述黄漆木提取物可有效地用作用于防止眼损伤的组合物中的活性成分。

本发明的另一个方面提供了一种用于预防或改善眼损伤的健康机能食品，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

所述的黄漆木、提取物、和眼损伤如上所述。

由于黄漆木长期以来一直被用作天然材料，并且已经被证明对人体是安全的，因此可以以食物的形式制备和食用，所述食物在正常食用的同时能够防止或改善眼损伤。

“预防”是指通过摄取健康食品抑制或延迟眼睛损伤的所有作用。

“改善”是指通过摄取健康食品来降低与待治疗病症相关的参数，例如症状的严重性的所有行为。

所述健康机能食品除了含有黄漆木提取物外，还可含有营养学可接受的食品添加剂。

食品添加剂是指可以补充加入到食品中的组分，并且可以由本领域技术人员适当地选择和使用，作为被加入以制备各配方的健康机能食品的添加剂。食品添加剂的实例包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、香料(如合成和天然香料)、着色剂和填料、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等，但不限于此。

健康机能食品是指使用具有对人体具有有用机能的原料或成分，以片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂的形式制备和加工的食品。特别是，机能是指在人体的结构和功能方面获得用于健康目的有益效果，例如调节营养或生理功能。本发明的健康机能食品可以通过本领域常用的方法制备，也可在制备过程中加入本领域通常加入的原料和配料来制备。此外，健康机能食品的配方也可以没有限制地制备，只要该配方被认为是健康机能食品。

该健康机能食品可以制成各种类型的制剂，与普通药物不同，其优点在于，由于使用食品作为原料，长期服用不会产生副作用，并且具有极好的便携性；因此，本发明的机能食品的健康可以作为补充剂来增强改善眼损伤的效果。

对健康机能食品的形式没有限制，它可以包含所有常规意义上的食品，并且可以与本领域已知的术语互换使用，例如功能食品。此外，本发明的健康机能食品可以通过将已知的添加剂与可以根据本领域技术人员的选择而包含在食品中的其它合适的辅助成分混合来制备。其可添加的食品的例子包含肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、甜食、披萨、拉面、其它面条、口香糖、包含冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮料、酒精饮料、维生素复合物等，并且可以通过将本发明的提取物作为主要成分添加至果汁、茶、果冻、果汁等来制造。它还包含用作动物饲料的食品。

本发明的又一方面提供一种用于预防或治疗眼部疾病的药物组合物，其含有黄漆木提取物作为活性成分。

黄漆木提取物如上所述。

“预防”是指通过投予本发明的组合物来抑制或延迟眼病发生的所有作用。

“治疗”是指通过投予本发明的组合物改善或有益地改变眼病症状的所有作用。

“眼病”可以是由蓝光引起的眼病，具体指与蓝光引起的A2E光氧化及其累积，或玻璃疣累积和光氧化有关的视网膜疾病。具体而言，所述眼病可以指选自由视网膜变性、黄斑变性、青光眼、色素性视网膜炎、斯塔加特病、无脉络膜症、回环萎缩、视网膜脱离、视神经病、和干眼综合征组成的组中的一种或多种类型，但不限于此。

黄斑变性(MD)是指中心视觉被黄斑损伤所破坏的现象，黄斑变性疾病可以包含干性黄斑变性、湿性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、特发性黄斑变性等，并且具体而言，其可为年龄相关性黄斑变性(AMD)。

尽管年龄相关性黄斑变性的确切病因学尚未确定，但通常已知由于老化而导致的视网膜色素上皮细胞中过量色素物质的累积，出现在年龄相关性黄斑变性的早期；并且由全反式视网膜和乙醇胺的合成产生的A2E，是通常在视网膜上皮细胞中累积的物质，其通过蓝光产生单线态氧，并且在氧化碳碳双键的同时可能导致对视网膜色素上皮细胞的损伤。

通过抑制由蓝光氧化的A2E引起的凋亡或抑制玻璃疣的累积，可以实现眼病的预防或治疗。在本发明的一个具体实施方式中，确认了当在视网膜色素上皮细胞中累积A2E后照射蓝光时发生凋亡，但是用黄漆木提取物处理具有抑制凋亡的效果。此外，确认了当用黄漆木提取物处理视网膜色素上皮细胞时，玻璃疣的累积被抑制。即，本发明的黄漆木提取物，通过抑制因暴露于蓝光而引起的视网膜色素上皮细胞的死亡或抑制玻璃疣的累积，可以有效地用于预防或治疗眼病。

所述药物组合物包含治疗有效量的黄漆木提取物；和药学上可接受的载体。

“治疗有效量”是指足以使本发明的组合物实现治疗或预防由蓝光引起的眼病的量。

药学上可接受的载体是常用于制备制剂的载体，其可以包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。

药物组合物可以口服或肠胃外给药，并且在肠胃外给药的情况下，可以使用静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、或经皮给药。

药物组合物的合适剂量根据诸如配制方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、病理状况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率、和反应敏感性等因素而变化，并且通常熟练的从业者能够容易地确定并开出有效用于所需治疗或预防的剂量。

所述药物组合物的日剂量为0.0001mg/kg至100mg/kg，并优选0.001mg/kg至30mg/kg，每天给药一次或数次。另外，给药周期可以是1天至2个月，但可以无限制地给药直至出现预防或治疗疾病的效果。

所述药物组合物通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂，根据本领域技术人员可以容易地进行的方法配制，以单位剂量形式制备，或者其可以通过将其放置在多剂量容器中来制备。特别是，制剂可以是在油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者可以是提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且可以进一步含有分散剂或稳定剂。

药物组合物也可配制成眼用组合物，例如滴眼剂和眼膏。这种形式可以包含用于眼科领域的用于局部施用于眼睛的所有眼用制剂。滴眼剂通过将活性成分溶解在无菌水溶液(例如盐水和缓冲液)中来制备。滴眼剂可以作为在使用前溶解的粉末组合物提供，或者可以通过与在使用前溶解的粉末组合物组合来提供。眼膏可以通过将活性成分混合到软膏基质中来制备。

以下，通过实施例和实验例对本发明进行详细说明。但是，以下的实施例和实验例仅是对本发明的说明，本发明的内容并不限于以下的实施例和实验例。

具体实施例

[制造例]

黄漆木提取物的制备

在2kg的黄漆木树叶和树枝中加入15倍重量的30％(v/v)的乙醇水溶液，在80℃下提取1–3次，持续8小时，并将每次提取获得的提取物混合。使用5μm过滤器过滤提取物。使用旋转真空浓缩器(BUCHI，R-220)在55℃浓缩滤液。向浓缩液中加入灭菌蒸馏水，稀释至白利糖度20，冷冻干燥，得到210g的黄漆木提取物粉末。

[实验例1]

黄漆木提取物对A2E的光氧化抑制效果

视网膜色素上皮细胞中累积的A2E，其是黄斑变性的原因，已知A2E沉积在视网膜色素上皮细胞中，其在照射蓝光时会发生光氧化，诱导细胞毒性。为了确认黄漆木提取物是否具有抑制A2E光氧化的效果，使用了人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞和A2E。

具体而言，用90μM的A2E(Gene and Cell Technologies)处理ARPE-19细胞(CRL-2302，美国ATCC)，然后用上述制造例中制备的黄漆木提取物以0μg/mL、7.8μg/mL、15.6μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、和250μg/mL处理，然后用蓝光(430nm，强度：2.0mW/cm

结果，如图1所示，在用黄漆木提取物处理的组中，与未用黄漆木提取物处理的阴性对照组相比，氧化A2E的累积抑制了40％至75％。

由上可知，黄漆木提取物具有抑制细胞内A2E累积并抑制A2E光氧化的效果。

[实验例2]

通过黄漆木提取物抑制光氧化和玻璃疣累积的效果

已知当玻璃疣在视网膜上皮细胞中累积时，黄斑组织变薄或萎缩，导致视觉功能和视敏度的损伤，从而诱导黄斑变性。在光氧化后，玻璃疣通过过氧A2E在视网膜细胞中产生活性二羰基物质，例如乙二醛和甲基乙二醛(MGO)(其为细胞毒性物质)，然后其非特异性结合细胞内蛋白以形成在视网膜细胞中累积的MGO修饰的加合物。由于这些MGO修饰的加合物也已知通过作为玻璃疣的一种成分而加重视网膜病变，因此检查了黄漆木提取物是否抑制玻璃疣的光氧化和MGO修饰的加合物的累积。

具体而言，加入0.7mL的以10mg/mL溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的牛血清白蛋白(Sigma，美国密苏里州圣路易斯)和0.1mL的0.22M甲基乙二醛，并用制造例中制备的黄漆木提取物以0μg/mL、7.8μg/mL、15.6μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、和250μg/mL处理至1mL的总体积。将生成物在37℃放置7天以诱导糖化产物的产生。一周后，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

结果，如图2所示，与未用黄漆木提取物处理的阴性对照组相比，在用黄漆木提取物处理的组中，MGO修饰的加合物的累积受到抑制。

由上可知，黄漆木提取物具有抑制玻璃疣的光氧化和MGO修饰加合物的累积、防止眼损伤、抑制黄斑变性的发生和恶化的效果。

[实验例3]

黄漆木提取物对视网膜色素上皮细胞对抗蓝光诱导光氧化的保护效果

考虑到当用蓝光照射时，在视网膜色素上皮细胞中累积的A2E引起光氧化，其诱导导致细胞凋亡的细胞毒性，确认了黄漆木提取物是否能够抑制由蓝光诱导的细胞毒性和细胞凋亡。

具体而言，用上述制造例中制备的0μg/mL和50μg/mL的黄漆木提取物、50μg/mL的绿原酸、50μg/mL的新绿原酸、50μg/mL的豆甾醇或50μg/mL的叶黄素处理ARPE-19细胞24小时，然后用20μM的A2E处理24小时，然后用蓝光照射10分钟。然后，用细胞计数试剂盒(日本同仁化学研究所)测量ARPE-19细胞的细胞活性，并且将每个处理组相对于累积A2E且不照射蓝光的对照组的细胞活性表示为百分比(％)。

结果，累积了A2E并用蓝光照射的阴性对照组的细胞活性与对照组相比显著降低，并诱导了凋亡。相反，确认了与仅用A2E处理的阴性对照组相比，用黄漆木提取物处理的组中的细胞活性增加，并且显示与用叶黄素处理的阳性对照组相比，其细胞活性甚至增加。

由上可知，黄漆木提取物通过抑制视网膜色素上皮细胞中由累积和氧化的A2E引起的细胞凋亡，来预防或治疗黄斑变性。

[实验例4]

黄漆木提取物对视网膜色素上皮细胞对抗蓝光诱导光氧化的保护效果

考虑到当用蓝光照射时，在视网膜色素上皮细胞中累积的A2E引起光氧化，其诱导导致细胞凋亡的细胞毒性，确认了黄漆木提取物是否能够抑制由蓝光诱导的细胞毒性和细胞凋亡。

具体而言，用上述制造例中制备的0μg/mL和50μg/mL的黄漆木提取物、50μg/mL的绿原酸、50μg/mL的新绿原酸、50μg/mL的豆甾醇或50μg/mL的叶黄素处理ARPE-19细胞24小时，然后用20μM的A2E处理24小时，然后用蓝光照射10分钟。然后，用细胞计数试剂盒(日本同仁化学研究所)测量ARPE-19细胞的细胞活性，并且将每个处理组相对于累积A2E且不照射蓝光的对照组的细胞活性表示为百分比(％)。

结果，如图3所示，累积A2E并用蓝光照射的阴性对照组的细胞活性与对照组相比显著降低，并诱导了凋亡。相反，确认了与仅用A2E处理的阴性对照组相比，用黄漆木提取物处理的组中的细胞活性增加，并且显示与用叶黄素处理的阳性对照组相比，其细胞活性甚至增加。

由上可知，黄漆木提取物通过抑制视网膜色素上皮细胞中由累积和氧化的A2E引起的细胞凋亡，来预防或治疗黄斑变性。

[实验例5]

黄漆木提取物对黄斑变性动物模型中感光细胞损伤或变形的改善效果

当由于干性黄斑变性导致玻璃疣在黄斑区域累积时，黄斑区域被光氧化并引起周围组织和视神经细胞的损伤，从而导致视敏度降低，在严重的情况下，发生地图样萎缩，即视神经细胞损失并诱导视网膜凋亡的病症。为了确认在由包含蓝光的光源的过度照射引起视神经细胞损伤和类似于干性黄斑变性的视神经细胞损失的动物模型中，黄漆木提取物是否具有改善感光细胞损伤或变形的效果，测量视网膜的外核层(ONL)的厚度变化。

具体而言，使6周龄雄性BALB/c小鼠(Orient Bio公司)适应一周，然后在暴露于含有蓝光的白色LED之前，从晚上在无光的暗处进行14小时的黑暗适应，然后在第二天早晨用1％托吡卡胺滴眼剂扩大其瞳孔。此后，将小鼠暴露于具有5,000lux亮度的特别制造的冷却白色LED光板0.5小时，然后置于暗室中24小时。在暴露于光之后，每天一次口服投予小鼠试验药物，持续7天。给药的药物浓度如下表1所示。已知通过活化老化的视网膜神经细胞有助于预防黄斑变性的新绿原酸、和广为人知作为眼营养物的组分叶黄素被设定为阳性对照，并且根据上述制造例的黄漆木提取物以各种浓度投予。给药结束后，进行尸检，提取眼球，眼球在10％中和福尔马林中固定一天，然后包埋在石蜡中以制作载玻片切片。用苏木精和曙红(H&E)染色载玻片切片，并在光学显微镜下观察，通过测量视网膜组织外核层厚度的变化来评价感光细胞的损伤或变形。

[表1]

结果，如图4和5所示，在阴性对照组中，厚度减小，而含有视神经细胞核的外核层(ONL)的细胞核减小，并且当投予黄漆木提取物时，显示外核层的厚度以浓度依赖性方式增加，且其效果优于叶黄素。但是，投予200mg/kg的黄漆木提取物的实验组与投予100mg/kg的黄漆木提取物的实验组相比，增加外核层的厚度的效果稍有降低，这被认为是随着黄漆木提取物的浓度增加，提取物中含有的各种植物化合物竞争性地抑制有效物质的吸收的现象。在投予新绿原酸的组(其为另一阳性对照组)中外核层的厚度也增加，但结果在统计学上不显著。

由上可知，黄漆木提取物具有通过增加视网膜的外核层(ONL)的厚度改善感光细胞损伤或变形的效果。

[实验例6]

确认黄漆木提取物改善黄斑变性动物模型中视细胞活性降低的效果

视网膜电流图(ERG)是视网膜视神经的电势的程度，表示由视神经对光的响应产生的电信号，并且被用作确认视网膜损伤或疾病的存在/不存在的指标。视网膜电图由波A和波B组成，其中波A由光感受器产生，而波B由光刺激视网膜内核层中的双极细胞的去极化产生。为了确认在因照射过剩的光源而引起视神经细胞损伤、诱发与干性黄斑变性同样的视神经细胞损失的动物模型中，黄漆木提取物是否具有改善视细胞活性降低的效果，测定视网膜电流图。

具体而言，在尸检前一天使实验例5中使用的动物模型适应黑暗16小时或更长时间后，用异氟烷(Poran，JW Pharmaceutical)对其进行吸入麻醉，并用0.5％托吡卡胺扩大其瞳孔。在全身麻醉下维持体温的同时，将适量的1％甲基纤维素加入眼球中，并将记录电极的金线环接地至角膜，将参比电极置于面颊区域，将接地的ELEC焊极接地至尾部，然后使用Retipot(德国Roland Conference)测量视网膜电图。用白色LED光照射后，从暗视闪光反应得到波a和波b，通过投予上表1所述的试验药物测定波a和波b，从而测定视细胞的活性程度。

结果，如图6所示，确认了通过投予上述黄漆木提取物，改善了波a和波b的神经传导，改善了视细胞活性的降低，且其效果优于叶黄素。但是，投予200mg/kg的黄漆木提取物的实验组与投予100mg/kg的黄漆木提取物的实验组相比，改善神经传导的效果稍有降低，但差异不大。投予新绿原酸的组是另一阳性对照组，也改善视网膜神经传导，但它在统计学上不显著。

由上可知，黄漆木提取物具有改善视细胞活性降低的效果。

[实验例7]

黄漆木提取物对黄斑变性动物模型中感光细胞损伤或变形的改善效果

为了确认所述黄漆木提取物对改善感光细胞损伤或变形的效果，投予对光感细胞有毒的N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)，并在动物模型中测量视网膜的外核层(ONL)厚度的变化，在动物模型中诱导类似于干性黄斑变性的视神经细胞的丧失。

具体而言，使6周龄雄性BALB/c小鼠(Orient Bio公司)适应一周，在0.05％乙酸溶液中制备1％浓度的N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)(美国Sigma)，并以1％的浓度，每个体60mg/kg腹膜内投予小鼠，其中在阴性对照中仅腹膜内投予相同量的0.05％乙酸。在投予N-甲基-N-亚硝基脲后同一天起，每日一次口服投予试验药物，持续7天。给药的药物浓度如下表2所示。已知通过活化老化的视网膜神经细胞有助于预防黄斑变性的新绿原酸、和广为人知作为眼营养物的组分叶黄素被设定为阳性对照，并且根据上述制造例的黄漆木提取物以各种浓度投予。给药结束后，进行尸检，提取眼球，眼球在10％中和福尔马林中固定一天，然后包埋在石蜡中以制作载玻片切片。用苏木精和曙红(H&E)染色载玻片切片，并在光学显微镜下观察，通过测量视网膜组织外核层厚度的变化来评价感光细胞的损伤或变形。

[表2]

结果，如图7和8所示，在阴性对照组中，厚度减小，而含有视神经细胞核的外核层(ONL)的细胞核减小，并且当投予黄漆木提取物时，显示外核层的厚度以浓度依赖性方式增加，且其效果优于叶黄素。在投予新绿原酸的组(其为另一阳性对照组)中外核层的厚度也增加，但结果在统计学上不显著。由上可知，黄漆木提取物具有通过增加视网膜的外核层(ONL)的厚度改善感光细胞损伤或变形的效果。

[实验例8]

黄漆木提取物对黄斑变性动物模型中视网膜色素上皮细胞损伤的改善效果

为了确认黄漆木提取物是否具有改善视网膜色素上皮细胞损伤的效果，在动物模型中计数和评价发生视网膜组织折叠变形的位置，其中将对视网膜色素上皮细胞有毒的碘酸钠(NaIO

具体地说，使6周龄雄性SD大鼠(Orient Bio公司)适应一周，在无菌生理盐水中制备3.5％浓度的碘酸钠(NaIO

[表3]

结果，如图9和10所示，在阴性对照组中，由于视网膜色素上皮细胞的损伤，视网膜组织变形，并且观察到许多折叠位置(红色箭头)，而当投予黄漆木提取物时，由于以浓度依赖性方式发生的组织变形，显示折叠位置被抑制，且其效果优于叶黄素。由上可知，黄漆木提取物具有抑制视网膜组织变形的效果，从而改善视网膜色素上皮细胞的损伤或变形。

[实验例9]

确认黄漆木提取物改善黄斑变性的效果的作用机制

[9-1]确认黄漆木提取物改善光照射引起的视神经细胞损伤的作用机制

为了确认实验例5中确认的改善由光照射引起的视神经细胞损伤的效果的作用机制，确认了由光源的过度照射引起的视神经细胞的损伤和损失是否是由于细胞凋亡，以及在黄斑变性动物模型中黄漆木提取物改善感光细胞的损伤或变形的效果是否是由于抗细胞凋亡效果。

具体而言，在实验例5的动物模型中，使用为分析视神经细胞的损伤和损失而制备的视网膜组织载玻片来分析视神经细胞的凋亡程度。试验药物给药结束后，进行尸检，提取眼球，眼球在10％中和福尔马林中固定一天，然后包埋在石蜡中以制备载玻片切片。组织切片通过脱蜡进行水合，用PBS洗涤，用浓度为20μg/ml的蛋白酶K溶液在37℃处理15分钟，然后再用PBS洗涤。在TUNEL反应混合物溶液(原位细胞凋亡检测试剂盒AP，德国罗氏)中于37℃反应1小时后，在显微镜下观察产物。

结果，如图11和12所示，在通过光照射诱导黄斑变性的视网膜中，在三层(即神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)和外核层(ONL))的所有细胞中都诱导了细胞凋亡，而且特别是，在外核层的视神经细胞核中确认了强烈的TUNEL阳性反应，确认了细胞凋亡主要发生在外核层中。然而，确认了用黄漆木提取物处理时，视神经细胞核层中TUNEL阳性反应的降低以浓度依赖性方式抑制了细胞凋亡，且其效果优于叶黄素。

由上可知，黄漆木提取物通过抑制由光照射诱导的视网膜细胞凋亡，改善了视神经细胞的损伤。

[9-2]确认黄漆木提取物抑制细胞凋亡的作用机制

为了确认实验例9-1中确认的结果，确认了视网膜组织中与凋亡相关的蛋白质的表达。

具体而言，将实验例9-1中使用的视网膜组织在液氮中快速冷冻，然后储存在-70℃。将用匀化缓冲液(pH7.6)匀化的样品进行蛋白质定量后，将每种30μg的样品在SDS-PAGE中进行电泳。然后，使用转移缓冲液(0.25M tris，1.92M甘氨酸，pH 8.3–8.4)将蛋白质转移到PVDF膜(美国加州Bio-Rad Laboratories)上。将5％脱脂乳溶解于TBST(200mM tris，1.37M NaCl，0.05％ Tween20)溶液中并封闭30分钟后，将一抗在4℃下孵育，用TBST洗涤三次，每次10分钟，然后与HRP结合的二抗反应，再用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后，将所得产物与增强的化学发光(ECL)溶液反应，用LAS-3000(日本富士胶片)确认作为凋亡相关信号传导物质的Bax、Bcl-2和半光天冬酶3的表达水平。

结果，如图13所示，用黄漆木提取物处理时，作为诱导细胞凋亡的促细胞凋亡因子的Bax的表达显著降低，而用黄漆木提取物处理时，作为抗细胞凋亡因子的Bcl-2的表达增加。此外，确认了当诱导黄斑变性时，凋亡过程中表达的截短形式的半光天冬酶3的表达显著增加，但通过用黄漆木提取物处理，该表达降低。

由上可知，黄漆木提取物抑制细胞凋亡因子，同时激活抗细胞凋亡因子，从而改善视神经细胞的损伤。

[9-3]确认黄漆木提取物改善视网膜色素上皮细胞损伤的作用机制

当黄斑变性发生时，出现了关于视网膜色素上皮细胞(RPE)的损伤和渗透性的问题。为了验证视网膜色素上皮细胞的这种损伤和通透性的变化的抑制，确认了细胞－细胞紧密连接蛋白ZO-1的变化。

具体而言，为了在尸检过程中除去眼球后分离含有视网膜色素上皮层的视网膜色素上皮细胞(RPE)－脉络膜－巩膜复合物，在解剖显微镜下观察时从眼球上除去晶状体、前段(前房)和视网膜，并将眼球的后眼杯浸入4％多聚甲醛(PFA)中并在4℃固定一天。一天后，用PBS洗涤后眼杯数次以除去固定剂，切下眼杯四个角并在载玻片上展开平整。用封闭液(10％正常山羊血清)处理产物10分钟，用抗ZO-1抗体(1∶200，Cat#61-7300，加州卡尔斯巴德的Invitrogen)处理1小时，然后洗涤几次。然后，用Alexa Fluor 488山羊抗兔(1∶500；Cat#A-11008，Invitrogen)作为第二抗体处理产物1小时，在荧光显微镜(日本东京奥林巴斯)下检查平坦的视网膜色素上皮细胞－脉络膜－巩膜复合物。

结果，如图14所示，确认了在正常组的情况下，在视网膜色素上皮细胞膜中没有观察到变化，而在投予碘酸钠(NaIO

由上可知，黄漆木提取物通过维持构成视网膜色素上皮细胞紧密连接蛋白质，改善了视网膜色素上皮细胞的损伤。

总之，可以看出，黄漆木提取物不仅通过抑制黄斑变性的致病因子玻璃疣的光氧化来抑制视神经细胞的损伤，并且通过抑制凋亡信号传导物质的表达来抑制视神经细胞的凋亡，而且维持在视网膜色素上皮细胞中的紧密连接蛋白，从而表现出改善黄斑变性的效果(图15)。