一种油茶籽粕抗菌肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽领域，具体涉及一种油茶籽粕抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术

最近，由于抗生素的滥用导致细菌耐药性的逐渐增强，严重威胁人类的生命健康以及公共医疗事业的发展。因其自身具有良好的抗菌活性且不易产生耐药性，抗菌肽逐渐引起人们的广泛关注。一般来说，抗菌肽广泛存在于从昆虫、鸟类、鱼类、哺乳动物以及植物等多种生物体的组织和细胞中，可通过酶解、发酵以及分离纯化等方法提取得到抗菌肽。天然的抗菌肽具有分子量小、结构简单、热稳定性强、抗菌范围广的特点，在食品、医药以及农业领域均有广泛的应用前景，因此有望成为传统抗生素和化学防腐剂的新型替代品。

油茶籽粕作为油茶籽榨油之后的主要副产物，除少量被用作肥料、动物饲料或燃料外，极大部分仍未得到充分利用，在造成资源浪费的同时也增加了环境负担。研究表明，经脱脂处理后油茶籽粕仍含有大量有益成分，包括皂苷、糖苷以及蛋白质等。其中粗蛋白质量分数约为15％～20％，而油茶籽粕蛋白质经酶解可制备功能性多肽进行深度利用，例如采用胃蛋白酶水解油茶籽粕蛋白得到的多肽水解物对细菌、酵母和霉菌均有一定的抑制效果，因此油茶籽粕有望成为一种植物天然抗菌肽的来源之一。

根据上述的研究背景，本发明以油茶籽粕中的分离蛋白为原料，通过超声辅助蛋白酶水解制备新型油茶籽粕抗菌肽，对于提高油茶籽粕的附加值以及综合利用率具有促进作用，同时为新型抗生素代替物的发明提供研究基础。本发明的技术方案可实现废弃资源的综合利用，因此制备新型油茶籽粕抗菌肽具有重要的研究意义和重大的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种油茶籽粕抗菌肽及其制备方法与应用，该抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制效果，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：

NO.1K-R-G-L-M-T-H-G-S-K-S-H-R。

具体地，一种油茶籽粕抗菌肽的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)采用碱溶酸沉的方法提取油茶籽粕分离蛋白并通过冷冻干燥后收集放置于-80℃冰箱保存；

(2)酶解：取适量步骤(1)中油茶籽粕分离蛋白(即)加入超纯水配成蛋白水溶液，利用超声辅助蛋白酶水解油茶籽粕蛋白，反应结束后将酶解液高温灭酶处理并迅速冷却至室温，将酶解液离心后取上清液进行冷冻干燥处理，收集得到油茶籽粕蛋白水解物；

(3)超滤法分离：采用分子量为10kDa的超滤膜对步骤(2)中得到的油茶籽蛋白水解物进行超滤分离，分别收集<10kDa和>10kDa两个抗菌肽组分，冻干后收集不同超滤分离组分并对测定其抗菌活性的；

(4)半制备液相色谱法分离：将步骤(3)中抗菌活性较优的抗菌肽组分进一步分离纯化，利用洗脱液梯度洗脱上述抗菌肽组分，收集各个纯化组分，透析脱盐后冻干收集，对纯化后的抗菌肽组分进行抗菌活性的测定；

(5)质谱分析与序列鉴定：选取抗菌活性最佳的抗菌肽组分进行LC-MS/MS质谱分析并通过匹配UniProt蛋白数据库鉴定抗菌肽氨基酸序列。

优选的，步骤(2)中，蛋白溶液的质量浓度为1～5％，进一步优选为3％，油茶籽粕蛋白浓度为3％。蛋白酶添加量为油茶籽粕蛋白质量的2～6％，进一步优选为4％。

优选的，步骤(2)中的超声辅助条件为功率100-200W，时间为20-40min，温度20-25℃，时间为20、30和40min，其中功率200W,时间30min为最佳超声条件。

优选的，步骤(2)中的蛋白酶为：碱性蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一种；其中碱性蛋白酶为最优酶。

优选的，步骤(2)中所述不同蛋白酶的酶解条件不同。其中，碱性蛋白酶酶解条件为55℃，pH 9.0；胃蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 2.0。

优选的，步骤(2)中所述高温灭酶温度为95-100℃，时间为10-30min；所述离心的条件为：2～6℃、7000～9000rpm下离心10～25min，进一步优选为4℃、8000rpm下离心15min。

优选的，步骤(3)中超滤分离采用的是分子量为10kDa的PES超滤膜。

优选的，步骤(4)中半制备液相色谱分离梯度洗脱程序如下：0-5min，5％流动相B，5-17min，40％流动相B，17-25min，95％流动相B，流动相A为纯水，B为乙腈；流速为4-6mg/mL，上样体积为1-2mL，样品浓度为10-20mg/mL。

优选的，步骤(2)或(3)中采用平板计数法测定不同抗菌肽组分的抗菌效果，并通过二倍稀释法测定纯化后抗菌肽组分对不同细菌的最小抑菌浓度。

优选的，步骤(5)中的菌种为大肠杆菌(ATCC 35150)、大肠杆菌(ATCC 8739)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)以及单增李斯特菌(ATCC 19115)中的一种或多种。

油茶籽粕抗菌肽在抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的应用。体外抑菌实验表明油茶籽粕抗菌肽复合物对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及单增李斯特菌等多种细菌均具有明显的抑制效果。总体而言，本发明的提出有助于提高油茶籽加工副产物的利用率，同时本发明提供的抗菌肽制备方法操作简单，提取效率高，可广泛应用于工业化生产。

本发明公开了以下技术效果：

首先，油茶籽粕资源丰富且易于获得，通过从油茶籽粕中提取抗菌肽，有利于提高油茶籽粕资源的综合利用率，同时有助于减少资源浪费与环境污染问题；

其次，上述方案通过超声辅助蛋白酶水解油茶籽粕蛋白，可优化油茶籽粕抗菌肽的水解条件，同时分离纯化工艺操作简单，符合工业生产需求，可筛选出对多种细菌具有较优抗菌活性的抗菌肽组分；

最后，通过LC-MS/MS质谱分析并匹配UniProt数据库成功完成对抗菌肽氨基酸序列的鉴定，本发明对制备植物源抗菌肽可提供一定的理论依据和实验基础。

附图说明

图1为不同油茶籽蛋白水解物对大肠杆菌活性的影响；

图2为不同油茶籽蛋白水解物对金黄色葡萄球菌活性的影响；

图3为<10kDa抗菌肽的半制备液相色谱分离图；

图4为不同油茶籽粕抗菌肽的二级质谱图；

图5为不同抗菌肽组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性的影响

图6为不同浓度的油茶籽粕抗菌肽的溶血活性图。

具体实施方式

为了更加清楚表达本发明的目的与技术方案，下面将结合具体的实施案例及附图对本发明进行详细说明。除非另有定义，本发明所使用的技术和科学术语与本发明所属领域内的意思相同。此外，下述的具体实施案例仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

本发明所使用的试剂、材料均可通过商业途径获得。

实施例1

本发明用于说明油茶籽粕蛋白水解物的制备工艺。具体方案如下：将5g油茶籽粕蛋白溶于超纯水，配成浓度为3％的蛋白溶液，在20℃下采用功率为100-200W的超声波处理20-40min后，加入相对于油茶籽粕蛋白质量的4％的碱性蛋白酶(0.2g)或胃蛋白酶并在其最适条件进行酶解，其中碱性蛋白酶酶解条件为55℃，pH 9.0；胃蛋白酶的酶解条件为37℃，pH 2.0。在600rpm摇床振荡4h，酶解反应结束后将酶解液高温灭酶处理20min，快速冷却至室温25℃，然后在4℃下8000rpm离心15min，收集上清液并冻干，制得油茶籽粕蛋白水解物。

采用平板计数法测定不同酶解条件制备的油茶籽蛋白水解物的抗菌活性，具体步骤如下：

将不同蛋白酶条件制备的抗菌肽复合物用NB液体培养基配置成40mg/mL溶液，以新鲜NB液体培养基作为空白对照，同时用新鲜NB液体培养基将培养至对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液稀释至约1×10

碱性蛋白酶处理组为：

C1-Ult-A---200W,40min；C1-Ult-B---200W,30min；

C1-Ult-C---200W,20min；C1-Ult-D---100W,40min；

C1-Ult-E---100W,30min；C1-Ult-F---100W,20min；

胃蛋白酶处理组为：

C2-Ult-A---200W,40min；C2-Ult-B---200W,30min；

C2-Ult-C---200W,20min；C2-Ult-D---100W,40min；

C2-Ult-E---100W,30min；C2-Ult-F---100W,20min；

通过比较不同处理条件制备的油茶籽蛋白水解物对不同细菌的抗菌活性结果可知(图1、2)，在超声辅助处理条件为200W、30min时，碱性蛋白酶水解油茶籽粕蛋白制备的水解物对大肠杆菌(ATCC 8749)以及金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)均具有最优的抗菌活性，培养24h后，大肠杆菌数量约下降5.85Log CFU/mL，金黄色葡萄球菌数量约下降5.61LogCFU/mL，因此本实施例获得抗菌肽最佳的酶解条件为超声功率：200W，超声时间：30min，水解蛋白酶为碱性蛋白酶。

实施例2

本实施例用于说明油茶籽蛋白水解物的分离纯化方法。具体步骤如下：

1)超滤分离：采用截留分子量为10kDa超滤膜对实施例1中抗菌活性较高的蛋白水解物进行超滤分离，获得<10kDa和>10kDa两个抗菌肽组分，浓缩后冻干收集。

2)半制备液相色谱分离：将步骤(1)中抗菌活性优异的粗抗菌肽组分进行半制备液相色谱分离。用超纯水将超滤分离组分溶解配置成20mg/mL的制备溶液，过0.22μm的滤膜后上样，使用Zorbax SB-300C18半制备柱，上样1mL，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流速6mL/min，检测波长215nm,利用洗脱液梯度洗脱后收集各个组分，洗脱程序如下：0-5min，5％流动相B，5-17min，40％流动相B，17-25min，95％流动相B。收集到响应值较高的4个峰，分别命名F1、F2、F3和F4(图3)。多次收集后透析脱盐后冻干，置于-80℃下保存备用。

3)质谱鉴定：选取上述半制备液相色谱分离得到的抗菌活性最佳的纯化组分进行LC-MS/MS质谱分析，并通过匹配UniProt蛋白数据库鉴定抗菌肽氨基酸序列，质谱鉴定出的1条抗菌肽二级质谱图如图4所示。

实施例3

本实施例用于测定分离纯化后油茶籽粕抗菌肽组分的广谱抗菌活性以及最小抑菌浓度(MIC)。采用平板计数法测定超滤分离各抗菌肽组分的抗菌活性，具体操作如下：

选择大肠杆菌ATCC 8739、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、金黄色葡萄球菌ATCC25923和枯草芽孢杆菌ATCC 6633等4种菌株作为测试菌。

将上述菌种分别接种于NB肉汤液体培养基中进行活化培养，在37℃、转速180rpm的恒温摇床中振荡培养至对数生长期，然后用新鲜的NB液体培养基将上述菌液稀释至约1×10

将超滤分离抗菌肽组分用NB液体培养基配置成10mg/mL溶液，以不加抗菌肽的新鲜NB液体培养基作为空白对照。分别取100μL肽溶液和100μL菌液混合置于96孔板中，在37℃恒温培养箱中静置培养24h后，取各孔内菌液进行适当稀释，分别取100μL涂布到PCA琼脂平板上，翻转平板置于37℃恒温培养箱内培养24h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得样品所含菌落总数，根据与对照菌落总数比较可评价其抗菌效果。

利用微量稀释法测定不同抗菌肽组分的最小抑菌浓度：在无菌96孔板中加入100μL上述处理好的待测菌悬液，其次逐一向96孔板中加入100μL不同浓度的抗菌肽稀释液，最后将96孔板置于培养箱中37℃静置培养24小时，用酶标仪检测在波长600nm时各孔的吸光度值(OD

本发明通过超滤分离得到<10kDa和>10kDa两个分子量范围抗菌肽组分，其抗菌活性由图5结果可知，与未分离前的蛋白水解物与>10kDa组分相比，<10kDa抗菌肽组分抗菌活性显著提高，经其处理后大肠杆菌数量下降约为2.76Log CFU/mL，金黄色葡萄球菌数量下降约为3.13Log CFU/mL，此结果表明<10kDa抗菌肽组分可能含有更多的抗菌肽成分。因此，本发明选取<10kDa的抗菌肽组分进行半制备液相色谱分离。

经过半制备液相色谱分离后得到F1-F4四个抗菌肽组分，其对多种细菌的最小抑菌浓度由表1所知，F1-F4组分对大肠杆菌(ATCC 8739)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)以及枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)均具有一定的抗菌效果。其中，F2组分相对于其他抗菌肽分离组分具有较优的抗菌活性，其对大肠杆菌的MIC为2.5mg/mL，对鼠伤寒沙门氏菌的MIC为3mg/mL，对于金黄色葡萄球菌的MIC为2mg/mL，对枯草芽孢杆菌的MIC为2mg/mL，这表明F2组分具有优异的的抗菌应用潜力。

表1抗菌肽纯化组分对不同菌种的MIC测定结果

实施例4

本实施例用于抗菌肽合成以及测定抗菌肽对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。对LC-MS/MS质谱鉴定得到的抗菌肽序进行合成，HPLC分析合成肽的纯度(＞95％)。其中抗菌肽序列为：

SEQ ID NO.1，K-R-G-L-M-T-H-G-S-K-S-H-R，简称CSp-1。

本实施例的抗菌活性评价通过测定油茶籽粕抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。

利用微量稀释法测定油茶籽粕抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)：首先将上述四种菌种分别接种于NB肉汤液体培养基中，并在37℃、180rpm的条件下使用恒温摇床振荡培养至对数生长期，然后用新鲜的NB液体培养基将上述菌液稀释至约1×10

由表2结果可知，本发明得到的新型油茶籽粕抗菌肽对多种细菌均具有良好的抑制效果。其对两种大肠杆菌(ATCC 35150,ATCC 8739)的MIC值均为0.8mg/mL，对鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)的MIC值为1.2mg/mL，对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的MIC值为0.4mg/mL，对枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的MIC值为0.5mg/mL，对单增李斯特菌(ATCC 19115)的MIC值为0.5mg/mL。上述抑菌实验结果表明本发明成功鉴定出具有广谱抗菌活性的新型油茶籽粕抗菌肽。

表2油茶籽粕抗菌肽对不同菌种的MIC测定结果

实施例5

本实施例用于测定不同浓度油茶籽粕抗菌肽的溶血活性。具体方案如下：

将小鼠血浆加入PBS中后，用轻柔的吹打方法使它们充分混匀。然后，在4℃、5000g的条件下，离心样品5min以去除上清液，收集沉淀的小鼠红细胞。将红细胞用PBS稀释，使其成为5％的红细胞溶液。随后，取0.5mL之前制备的5％红细胞溶液，分别与0.5mL不同浓度(0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL,4mg/mL,8mg/mL)的抗菌肽溶液混合。同时，使用1％ Triton X-100和PBS分别作为阳性对照和阴性对照。在37℃恒温条件下培养混合物1h后，将红细胞混合物以4℃、5000g条件离心10min。然后，使用酶标仪在波长570nm处测量上清液中释放的血红蛋白的吸光度值。最终，使用以下公式计算抗菌肽的溶血率：

溶血实验结果表明(图6)：在测试浓度范围内，随着抗菌肽浓度的增加，小鼠红细胞的溶血率逐渐升高，但抗菌肽对小鼠红细胞的溶血率仍低于20％，说明本发明分离纯化的油茶籽粕抗菌肽CSp1对红细胞的渗透性较小，具有较低的溶血活性，生物安全性可靠。

上述实施例表明本发明成功分离纯化出一种来源于油茶籽粕的抗菌肽复合物，特别是F2组分具有良好的抗菌性能，通过质谱鉴定(LC-MS/MS)，得到1种新型的具有潜在抗菌活性的油茶籽粕抗菌肽，可广泛应用于制备食品与医药领域的抗菌剂或抗菌药物，本发明为油茶籽加工中副产物的再次利用提供坚实的基础，为油茶籽加工企业提供了很高的经济效益和环境效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。