一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物药物载体制备领域，涉及一种靶向中枢神经系统的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)为一种高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，90％以上亚型为弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。原发性中枢神经系统淋巴瘤约占颅内原发肿瘤的1％-5％、所有淋巴瘤的1％。由于血脑屏障的存在，诸多可应用于DLBCL的药物难以抵达颅内病灶，原发性中枢神经系统淋巴瘤的五年生存率仅为20％-30％，且大约25％的PCNSL出现原发耐药，近50％最终会复发。目前治疗均需超大剂量化疗药物以保证进入中枢的化疗药物达到有效血药浓度，因而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，往往对正常组织和器官造成不可逆的损害，降低人体免疫能力，达不到预期治疗效果。

应用纳米载体携载化疗药物穿越血脑屏障是中枢性疾病治疗的有效方法。然而，目前利用高分子材料构建的纳米载药体系存在着一些不易解决的问题，如生物相容性较差、对疏水性药物的释放存在一定影响、稳定性差等。故具有良好生物利用度且可将细胞毒性药物有效运输至中枢神经系统淋巴瘤的外泌体(Exo)具备成为新型生物载体的优异潜质。

外泌体来源广泛，在血液中稳定性高，体内循环时间长，免疫原性低，有更高的药物传输效率及更强的增强渗透滞留效应，这些特性使其有可能成为一种天然的内源性药物载体。其次，外泌体表面存在多种黏附蛋白和特定的载体配体，可避免调理素、凝血因子或补体的激活，使载体避免被网状内皮系统捕获；且外泌体为磷脂双分子层膜结构，易于与受体细胞融合，有助于其运送并释放内容物至靶细胞。此外，外泌体为直径大小约为40～150nm的小囊泡，外泌体可有效利用增强渗透滞留效应，通过细胞间间隙透出血管，选择性地渗入肿瘤组织部位并滞留，从而进一步实现对肿瘤的被动靶向作用。尤其值得关注的是，纳米级的外泌体可穿越血脑屏障及血脑脊液屏障。

由于90％以上的B细胞淋巴瘤细胞上有CD22抗原表达，且CD22抗原的表达率为80％-100％，远高于正常成熟B淋巴细胞，并且结合CD22的抗体可以被迅速内化，因此anti-CD22作为化学免疫偶联物也引起瞩目，被应用于将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤细胞。然而，完整的CD22mAb具有的Fc段易被单核吞噬细胞吞噬、清除，从而导致药物靶向的效率低，精准性查。因此，亟需研发针对中枢神经系统淋巴瘤、可有效穿越血脑屏障的且靶向效率高的新型靶向治疗策略。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以连接CD22-F(ab’)

第一方面，本发明提供了一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体，所述外泌体表面经过CD22-F(ab’)

第二方面，本发明还提供了第一方面所述的靶向淋巴瘤细胞的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤:

步骤S1：外泌体纯化及表面修饰，得到表面修饰的外泌体；

步骤S2：富含巯基的CD22-F(ab’)

步骤S3：将所述表面修饰的外泌体与所述CD22-F(ab’)

进一步地，所述步骤S1具体操作为，

步骤S11：提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基，培养24-48h后，收集细胞悬液；

步骤S12：将所述步骤S11得到的细胞悬液离心，取上清后进行第二次离心，再取上清；第三次离心后，将上清移至100kD超滤管中离心浓缩，将浓缩液超高速离心后吸弃上清，重悬洗涤后，再次超高速离心，吸弃上清，1×PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；

步骤S13：将所述步骤S12得到的外泌体悬液与3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，通过超高速离心法离心纯化得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体。

进一步地，所述外泌体来源细胞为人肾上皮细胞系的293T细胞。

进一步地，所述步骤S12中，细胞悬液离心以300g，10min，4℃条件进行，第二次离心以2000g，10min，4℃条件进行，第三次离心以12000g，30min，4℃进行。

进一步地，所述步骤S13中，外泌体悬液与MBS试剂体积比为50：1。

进一步地，所述步骤S2具体操作为，

步骤S21：使用无花果蛋白酶水解anti-CD22单抗得到F(ab’)

步骤S22：将所述CD22-F(ab’)

进一步地，所述步骤S21中的水解条件为：pH6.0下，10mM柠檬酸盐缓冲液中加入4mM半胱氨酸和5mM EDTA，与无花果蛋白酶及anti-CD22单抗在37℃下共同孵育24小时。

进一步地，所述步骤S22中CD22-F(ab’)

第三方面，本发明提供了采用本发明第二方面所述的方法制备得到的外泌体。

第四方面，本发明还提供了第三方面所述的外泌体在制备靶向淋巴瘤细胞载药体系中的应用。

进一步地，所述应用具体为，将所述连接CD22-F(ab’)

进一步地，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的任一种，抗肿瘤药物的浓度为1～2mg/mL。

进一步地，所述抗肿瘤药物为阿霉素或环磷酰胺。

进一步地，所述抗肿瘤药物与连接CD22-F(ab’)

本发明相对于现有技术具有的有益效果：

1)本发明发现，将CD22mAb通过酶切、还原后生成的CD22-F(ab’)

2)本发明使用连接CD22-F(ab’)

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明制备的携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

图2为本发明制备的携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

图3为单独外泌体和连接CD22-F(ab’)

图4为携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

图5为携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

图6为携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

图7为携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

一种携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

第一步：选用人肾上皮细胞系的293T细胞为外泌体来源细胞，提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基。培养24-48h后，收集细胞悬液；

第二步：细胞悬液离心(300g，10min，4℃)，弃去细胞及碎片，取上清后再次离心(2000g，10min，4℃)，取上清再次离心(12000g，30min，4℃)，将第三次离心后上清移至100kD超滤管中配平，离心浓缩(4000g，15min，4℃)。将浓缩液超高速离心(100000g，90min，4℃)，吸弃上清，重悬洗涤后，再次以相同条件超高速离心，吸弃上清，1×PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；

第三步：将洗涤外泌体200μl的重悬液与10μl MBS试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1小时，超高速离心(100000g，90min，4℃)，

得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体；

第四步：pH6.0下，10mM柠檬酸盐缓冲液中加入4mM半胱氨酸和5mM EDTA，与无花果蛋白酶及anti-CD22单抗在37℃下共同孵育24小时，水解anti-CD22单抗得到F(ab’)

第五步：将表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体与富含巯基的CD22-F(ab’)

第六步：将2mg/mL的阿霉素与制得的连结CD22-F(ab’)

采用上述方法制备出的携载阿霉素的外泌体靶向载药体系，通过蛋白电泳考马斯亮蓝染色、荧光显微镜和透射电镜进行表征，结果表明CD22-F(ab’)

通过高效液相色谱法定量计算其载药率达(34.57±7.61)％，表明外泌体靶向载药体系对烷化剂类抗肿瘤药物具有较高的载药率。通过透射电镜，发现载药后的外泌体形态与单纯的外泌体形态相似，无明显改变，如图2所示，说明药物和膜表面修饰不会对外泌体造成明显影响。由于阿红霉素具有自发荧光性，通过荧光显微镜观察靶向外泌体载药体系对淋巴瘤细胞作用，可见该载药体系有效靶向淋巴瘤细胞。

本发明制备的携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

游离阿霉素极难穿透脑内皮细胞致密结构，而本发明制备的携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

CCK-8实验结果显示：单纯的外泌体对淋巴瘤细胞及外周血单个核细胞无明显影响，提示外泌体可作为安全、高效的药物载体。与游离药物相比，携载阿霉素的外泌体载药体系和携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

通过体外血脑屏障模型，经流式细胞术发现，与游离药物相比，携载阿霉素的外泌体载药体系及携载阿霉素连接CD22-F(ab’)

实施例2

一种携载环磷酰胺连接CD22-F(ab’)

第一步：选用人肾上皮细胞系的293T细胞为外泌体来源细胞，提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基。培养24-48h后，收集细胞悬液；

第二步：细胞悬液离心(300g，10min，4℃)，弃去细胞及碎片，取上清后再次离心(2000g，10min，4℃)，取上清再次离心(12000g，30min，4℃)，将第三次离心后上清移至100kD超滤管中配平，离心浓缩(4000g，15min，4℃)。将浓缩液超高速离心(100000g，90min，4℃)，吸弃上清，重悬洗涤后，再次以相同条件超高速离心，吸弃上清，1×PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；

第三步：将洗涤外泌体200μl的重悬液与10μl MBS试剂在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1小时，超高速离心(100000g，90min，4℃)，得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体；

第四步：pH6.0下，10mM柠檬酸盐缓冲液中加入4mM半胱氨酸和5mM EDTA，与无花果蛋白酶及anti-CD22单抗在37℃下共同孵育24小时，水解anti-CD22单抗得到F(ab’)

第五步：将表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体与富含巯基的CD22-F(ab’)

第六步：将2mg/mL的环磷酰胺与制得的连结CD22-F(ab’)

通过高效液相色谱法定量计算其载药率达38.29±5.43％，表明外泌体靶向载药体系对烷化剂类抗肿瘤药物具有稳定的载药率。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。