基于气相质谱特征碎片非定向筛查食品中香精香料及其衍生物的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，更具体地，涉及一种基于气相质谱特征碎片非定向筛查食品中香精香料及其衍生物的方法。

背景技术

非定向筛查技术用来确定样本中可能存在的风险物质，常被应用在食品领域的农兽药残留检测、食品安全检测等方面。其中质谱仪，因为其扫描范围相对较宽，可实现对多种化学物质的筛选、定性与定量分析，是非定向筛查方法中数据采集最常使用的仪器。通常非定向方法是需要购买标准品后建立定向筛查数据库，再将采集的样品数据与数据库中的化合物信息匹配来进行筛查。然而标准品价格昂贵且数量众多，不可能穷尽所有，且有些不法商家针对现有的靶向检测方法，在化合物上衍生基团，改变了产生的碎片质量，使之与数据库中的信息不同，从而匹配失败，逃过检测。

SIM(选择性离子检测)或MRM(多反应检测扫描)模式是质谱筛查定量检测中常用的模式。SIM的检测原理是仅扫描目标化合物的特征离子，其它离子则不记录。MRM模式的原理是一个目标化合物选择一个母离子和一个其碰撞后产生的子离子，可同时检测多个化合物。这两种模式能降低基质干扰，提高灵敏度，但因为检测的不是全谱，一般不能准确对物质进行定性。

至于定量方法，通常用的定量方式有外标定量法，内标定量法和峰面积归一法。但不同化合物的化学结构不同，碎裂后得到的碎片离子质荷比、在质谱中的响应值也是不同的。仅用一种标准品的少数几个碎片离子，通过质谱的响应值比例来定量未知化合物，结果是不够准确的。未知化合物定量的难点一在于未知化合物的结构未知，难点二在于用于定量的碎片离子的数量确定，有些离子是干扰，太多则容易增加误差，太少则不够具有特征性，结果不够准确。

发明内容

本发明旨在提供一种基于气相质谱特征碎片非定向筛查食品中香精香料及其衍生物的方法：基于TF-IDF算法计算一类化合物的特征碎片离子，将其作为这类化合物的定性筛查离子用于后续分析；定量分析则在计算匹配出结构最相似化合物基础上，选择特定的碎片离子作为定量离子用于制作标准曲线，实现未知样本的半定量，本方法筛查范围更广，效率高，可同时实现食品中香精香料及其衍生物的定性、定量检测，且结果科学准确。

本发明的首要目的是提供一种基于气相质谱特征碎片非定向筛查食品中香精香料及其衍生物的方法。

本发明的另一目的是提供上述方法在筛查食品中香精香料及其衍生物方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种基于特征碎片非定向筛查食品中香精香料及其衍生物的方法，包括如下步骤：

S1.数据库的建立：获取香精香料化合物碎片离子质荷比和相对丰度以建立数据库；

S2.特征碎片计算：计算步骤S1数据库中各类香精香料化合物的TF-IDF得分，提取分值排名前20～40的碎片作为该类化合物特征碎片，TF-IDF得分计算方法如下：

S3.待测食品样品的检测：使用GC-MS对待测样品进行检测，得到待测样品的全扫描谱图和数据；

S4.定性检测：用提取色谱图(EIC)模式打开待测样品全扫描谱图和数据，分别输入各类香精香料化合物的特征离子碎片质荷比，分别提取每个特征碎片的色谱图，在相同出峰时间内同时存在该类香精香料化合物的特征碎片离子色谱峰个数超过6个，即可认为该待测样品为风险样品，否则为安全样品；

S5.半定量检测：根据定性检测结果判断待测样品中未知香精香料化合物所属类别，通过与步骤S1数据库中所有该类香精香料化合物进行匹配计算，判断与该未知香精香料化合物结构最相似的库中化合物，再将未知香精香料化合物与结构最相似化合物匹配上的碎片离子作为定量离子，用于标准曲线的制作和未知香精香料化合物的定量。

优选地，所述香精香料包括香兰素类、丁香酚类、肉桂醛类、香豆素类、苯酚类、丁位癸内酯、丁位十二内酯、2，3-丁二酮(双乙酰)。

优选地，所述待测食品样品为液态奶或奶粉。

进一步优选地，当待测食品样品为液态奶或奶粉时，步骤S3使用GC-MS对待测样品进行检测前，要对样品进行前处理：液态奶样品直接称取3.0～6.0g，奶粉则用水冲调后，称取3.0～6.0g于15～20mL顶空瓶中，加入2.0～3.0g氯化钠。

优选地，所述GC-MS为GC-Q-TOF。

进一步优选地，所述GC-Q-TOF检测的条件为：

固相微萃取条件：振荡器预热温度：70℃；转速：500r/min；预热时间：20min；萃取时间：25min；解吸时间：5min；

色谱条件：气相色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温过程：80℃保持2min，以10℃/min升温至150℃后，保持5min，以20℃/min升温至280℃，保持3.5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.5mL/min；进样口温度：260℃；进样方式：不分流进样；

质谱条件：EI源电压，70eV；离子源温度：280℃；接口温度：280℃；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，一级质量扫描范围m/z 80～200，采集速率5spectrum/s；溶剂延迟：5min。

作为一种优选地可实施方式，步骤S1所述建立数据库为通过NIST谱库和标准品检测，获取香精香料化合物的碎片离子和丰度以建立数据库。

作为一种优选地可实施方式，步骤S5所述最相似的库中化合物的确定方法包括如下步骤：

S1.计算数据库中该类香精香料化合物中每种化合物各碎片离子的相对丰度，计算公式如下：

将碎片离子分为三类：Ⅰ类为相对丰度≥0.1的碎片离子；Ⅱ类为≥0.01的碎片离子；Ⅲ类为<0.01的碎片离子；对三类碎片分别赋予不同的权重，Ⅰ类为50％，Ⅱ类为30％，Ⅲ类为20％；

S2.将待测样品中的未知香精香料化合物的碎片离子质荷比，与数据库中该类香精香料化合物一一比对，将相同的碎片离子，及其对应的峰面积分别提取出来，即可获得与各化合物匹配上的三类碎片离子的个数；将三类碎片离子的个数乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子匹配个数得分m；

S3.计算未知香精香料化合物和数据库中该类香精香料化合物提取出来的碎片离子的相对丰度比例K，计算两者相同碎片的相对丰度比例K的偏差值。

计算公式如下：

碎片相对丰度比例

其中，K

三类碎片得到丰度比例相对偏差之和，乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子相对丰度比例偏差k；

S4.计算未知香精香料化合物和数据库中该类香精香料化合物相同碎片的碎片离子排名误差，计算公式如下：

其中，R

三类碎片的排名的偏差之和，乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子排名偏差r；

S5.综合计算得分，根据得到的该类香精香料化合物的m、k、r值，计算m、k、r三个指标的单项得分，计算公式如下：

其中，得分为每种香精香料化合物的m、k、r值；该项最高得分为数据库中该类香精香料化合物中最高的m、k、r值；

将数据库中该类香精香料化合物的m、k、r三个指标的单项得分加和，得到化合物的匹配得分，得分最高的化合物即认为是与未知香精香料化合物结构最为相似的化合物，用于配制标准曲线半定量未知香精香料化合物。

优选地，步骤S5所述的用于配制半定量标准曲线的相似化合物，匹配得分应≥200。

优选地，步骤S5所述定量离子为将未知香精香料化合物与结构最相似化合物匹配上的，且相对丰度≥0.1的碎片离子作为定量离子。

本发明还请求保护上述方法在筛查食品中香精香料及其衍生物方面的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明基于气相质谱特征碎片离子非定向筛查香精香料及其衍生物的方法，基于TF-IDF算法计算一类化合物的特征碎片离子，将其作为这类化合物的定性筛查离子用于后续分析；定量分析则在计算匹配出结构最相似化合物基础上，选择特定的碎片离子作为定量离子用于制作标准曲线，实现未知样本的半定量，本发明的筛查范围更广，不仅能筛查数据库中化合物，还可筛查一类化合物的同系物和其衍生物；针对同系物、未知衍生物的定量问题，提出用一种标准品来半定量的方法，检测成本低，结果科学准确。

附图说明

图1为本发明基于气相质谱特征碎片非定向筛查香精香料及其衍生物的方法的流程图；

图2为化合物碎片离子质荷比和相对丰度表格整理格式；

图3为香兰素特征离子碎片和tf-idf得分结果输出；

图4为EIC模式提取香兰素类化合物特征离子碎片谱图结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

图1为本发明基于特征碎片非定向筛查香精香料及其衍生物的方法的流程图。

实施例1液态乳中香兰素的定性筛查

1、待测样品的检测

液态奶：准确称取5.0g液态奶样品于15mL顶空瓶中，添加100μL的5mg/L的香兰素类化合物混合标准品，振荡混合均匀。加入3g氯化钠，供GC-Q-TOF测定得到待测样品的全扫描谱图和数据。

仪器参数设定：

固相微萃取条件：振荡器预热温度：70℃；转速：500r/min；预热时间：20min；萃取时间：25min；解吸时间：5min。

色谱条件：气相色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温过程：80℃保持2min，以10℃/min升温至150℃后，保持5min，以20℃/min升温至280℃，保持3.5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.5mL/min；进样口温度：260℃；进样方式：不分流进样。

质谱条件：EI源电压，70eV；离子源温度：280℃；接口温度：280℃；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，一级质量扫描范围m/z 80～200，采集速率5spectrum/s；溶剂延迟：5min。

2、数据库建立

确定《GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中允许添加的香精香料名单中，找到与香兰素结构相似的化合物27种，根据命名分为香兰素。通过NIST谱库和标准品检测，得到各种化合物的碎片离子和丰度。

整理输入到EXCEL表格中。以香兰素类化合物为例，按图2的格式，香兰素类碎片命名为“香兰素.csv”，后续上传到Jupyter Notebook编写好的程序中计算结果输出时会读取对应的文件名，分别显示输出。若同类化合物有数据补充添加，可直接在原来表格上添加，再重新上传原文件；也可重新建表格文件，命名为“物质名(1).csv”，里面的数字可替换，上传文件分析时，会自动归入同类名字化合物计算。

3、基于TF-IDF算法计算特征离子碎片

在Jupyter Notebook目录页上新建一个文件夹，命名为“Fragments”，整理的需要计算分析的表格文件都需上传到这个文件夹中。

参数设置主要包括：1)读取上传表格中，碎片离子的质荷比的数值精确度(Acc)，输入的数值表示读取到小数点后第几位用于分析计算，设定为0，即只读取整数部分。

2)输出结果特征离子的个数(k)，设定为20。

点击运行，计算结果在最后按照化合物分类输出，如图3所示，包括特征离子碎片质荷比m/z和对应的tf-idf得分，按照得分从高到低排列。

香兰素得到的结果整理后如表1所示。

表1香兰素类化合物tf-idf得分前20的特征碎片

4、提取特征碎片离子定性判断

本例中筛查样本中是否含香兰素类似物，通过EIC模式输入得到的20个香兰素类特征碎片的质荷比，因为仪器参数时设置了一级质量扫描范围m/z 80～200，所以质荷比低于80的碎片是没有信号的无法提取得到。将有信号的12个香兰素类特征碎片提取的谱图结果如图4所示：其中9.8min左右(峰1)同时出现质荷比为81，95，109，123，137，151，152，153，182的9个色谱峰，10.9(峰2)左右出现质荷比为81，95，109，137，138，165，166，182的8个色谱峰，11.3min(峰3)左右出现质荷比为81，95，109，123，137，151，165，166，182的9个色谱峰，可认为9.8、10.9、11.3min左右有三种不同的香兰素类化合物流出，即判断该样本中含有香兰素类物质的风险样本。

实施例2香兰素类化合物的半定量检测

1、待半定量样本的检测

待半定量奶粉样本制备：称取5.0g奶粉，加入45mL水冲调后，称取5.0g于15mL顶空瓶中，添加100μL的5mg/L的香兰素类化合物混合标准品，振荡混合均匀。加入3g氯化钠，供GC-Q-TOF测定得到待测样品的全扫描谱图和数据。

仪器参数设定：

固相微萃取条件：振荡器预热温度：70℃；转速：500r/min；预热时间：20min；萃取时间：25min；解吸时间：5min。

色谱条件：气相色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温过程：80℃保持2min，以10℃/min升温至150℃后，保持5min，以20℃/min升温至280℃，保持3.5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.5mL/min；进样口温度：260℃；进样方式：不分流进样。

质谱条件：EI源电压，70eV；离子源温度：280℃；接口温度：280℃；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，一级质量扫描范围m/z 80～200，采集速率5spectrum/s；溶剂延迟：5min。

2、半定量化合物匹配计算

S1.计算数据库中香兰素类化合物中每种化合物各碎片离子的相对丰度，计算公式如下：

将碎片离子分为三类：Ⅰ类为相对丰度≥0.1的碎片离子；Ⅱ类为≥0.01的碎片离子；Ⅲ类为<0.01的碎片离子；对三类碎片分别赋予不同的权重，Ⅰ类为50％，Ⅱ类为30％，Ⅲ类为20％；

S2.将检测得到的待半定量化合物的碎片与数据库中的各香兰素类化合物一一进行匹配，将相同的碎片离子，及其对应的峰面积分别提取出来，即可获得与各化合物匹配上的三类碎片离子的个数；将三类碎片离子的个数乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子匹配个数得分m；本例中待半定量化合物与香兰素类化合物的碎片离子匹配个数得分结果见表2。

表2待半定量化合物与香兰素类化合物匹配上的碎片个数得分表

S3.计算待半定量化合物和数据库中香兰素类化合物提取出来的碎片离子的相对丰度比例K，计算两者相同碎片的相对丰度比例K的偏差值。计算公式如下：

其中，K

三类碎片得到丰度比例相对偏差之和，乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子相对丰度比例偏差k；本例中待半定量化合物与香兰素类化合物的碎片离子相对丰度比例的偏差结果见表3。

表3待半定量化合物与香兰素类化合物匹配上的碎片离子相对丰度比例偏差表

S4.计算待半定量化合物和数据库中香兰素类化合物相同碎片的碎片离子排名误差，计算公式如下：

其中，R

三类碎片的排名的偏差之和，乘以各自权重，再加和，得到的数值即为碎片离子排名偏差r；本例中待半定量化合物与香兰素类化合物的碎片离子排名的偏差见表4。

表4待半定量化合物与香兰素类化合物匹配上的碎片离子排名偏差表

S5.综合计算得分，根据得到的香兰素类各个化合物的m、k、r值，计算m、k、r三个指标的单项得分，计算公式如下：

其中，得分为每种香兰素类化合物的m、k、r值；该项最高得分为数据库中香兰素类化合物中最高的m、k、r值；

将数据库中香兰素类化合物的m、k、r三个指标的单项得分加和，得到化合物的匹配得分，得分最高的化合物即认为是与待半定量化合物结构最为相似的化合物。本例匹配总得分表如表5所示，从结果可以得知，总分最高的是香兰素，即与待半定量化合物结构最相似的是香兰素。

表5待半定量化合物与香兰素类化合物匹配的总得分表

3、标准曲线的配制

称取香兰素0.025g，用水定容于25mL容量瓶，得1000mg/L溶液；分别准确量取1000mg/L的单标溶液100μL，用水定容到20mL，得5mg/L的标准中间溶液；分别移取5mg/L标准中间溶液1μL、2μL、4μL、20μL、100μL，用空白奶粉基质溶液定容至1mL配成5mg/L、10mg/L、20mg/L、100mg/L、500mg/L的标准工作溶液，现配现用。按仪器工作条件测定后，用匹配上的I类碎片作为定量离子，以质量浓度对相应的定量离子峰面积之和绘制基质标准曲线，得到香兰素的标准线性方程y＝796.63x+14315，R

4、未知样本的半定量计算

该未知样本中实际添加了100μg/L的香兰素，检测得待半定量化合物的定量离子峰面积之和为87055.16，代入香兰素标准曲线计算，得到的计算值为91.31μg/L，误差为8.69％，误差小于10％，结果较为准确，因此可用于未知样本的半定量。

实施例3：香兰素半定量同系物

1、待半定量样本的检测

待半定量奶粉样本制备：称取5.0g奶粉，加入45mL水冲调后，称取5.0g于15mL顶空瓶中，添加100μL的5mg/L的甲基香兰素、乙基香兰素化合物混合标准品，振荡混合均匀。加入3g氯化钠，供GC-Q-TOF测定得到待测样品的全扫描谱图和数据。

仪器参数设定：

固相微萃取条件：振荡器预热温度：70℃；转速：500r/min；预热时间：20min；萃取时间：25min；解吸时间：5min。

色谱条件：气相色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温过程：80℃保持2min，以10℃/min升温至150℃后，保持5min，以20℃/min升温至280℃，保持3.5min；载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.5mL/min；进样口温度：260℃；进样方式：不分流进样。

质谱条件：EI源电压，70eV；离子源温度：280℃；接口温度：280℃；数据扫描方式：TOF-Scan全扫描，一级质量扫描范围m/z 80～200，采集速率5spectrum/s；溶剂延迟：5min。

2、标准曲线的配制

称取香兰素0.025g，用水定容于25mL容量瓶，得1000mg/L溶液；分别准确量取1000mg/L的单标溶液100μL，用水定容到20mL，得5mg/L的标准中间溶液；分别移取5mg/L标准中间溶液1μL、2μL、4μL、20μL、100μL，用空白奶粉基质溶液定容至1mL配成5mg/L、10mg/L、20mg/L、100mg/L、500mg/L的标准工作溶液，现配现用。按仪器工作条件测定后，用待半定量样品与数据库中的香兰素匹配上的I类碎片作为定量离子，以质量浓度对相应的定量离子峰面积之和绘制基质标准曲线，得到：香兰素半定量甲基香兰素的标准线性方程为y＝796.63x+14315，R

3、未知样本与香兰素的匹配计算

同具体实施例2的匹配计算步骤，将检测得到的待半定量化合物的碎片与数据库中的香兰素化合物一一进行匹配，得到相同的碎片离子，并将它们按照相对丰度分成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类碎片。分别计算待半定量化合物与香兰素化合物的碎片离子匹配个数得分、碎片离子相对丰度比例的偏差、碎片离子排名的偏差。汇总各项数据，综合计算的得分。从结果可以得知，甲基香兰素与香兰素的匹配得分为220.92，乙基香兰素与香兰素的匹配得分为145.90。

4、未知样本的半定量计算

将该未知样本中实际分别添加了100μg/L的甲基香兰素和乙基香兰素，检测得待半定量甲基香兰素化合物的定量离子峰面积之和为93269.45，代入香兰素标准曲线计算，得到的计算值为99.15μg/L，误差为0.85％，误差小于2％，结果准确。检测得待半定量乙基香兰素化合物的定量离子峰面积之和为92937.48，代入香兰素标准曲线计算，得到的计算值为182.17μg/L，误差为82.17％，误差较大，则半定量结果不够准确。因此，选择结构相似化合物做半定量标准曲线时，应选择匹配得分≥200，半定量结果会较为准确。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。