基于胶原蛋白纳米纤维填充的生物材料、预制品及其制备和应用

技术领域

本申请涉及介入生物材料改性技术领域，具体涉及一种基于胶原蛋白纳米纤维填充的交联改性生物材料、改性方法和应用。

背景技术

近年来，介入生物材料例如介入瓣膜置换手术由于其操作方便、大大降低了对病人的二次损伤，从而取得了越来越广泛的临床应用。现阶段介入瓣膜都是保存在戊二醛溶液中；在手术现场使用时，需要经过反复清洗和装载，增加了手术的时间和附加风险；其次，生物瓣膜残留的戊二醛易增加生物瓣膜的钙化和毒性。

生物瓣膜通过脱水和预装载的方式能够完美地解决上述问题。但该方式要求生物瓣膜具有更好的弹性和韧性，使压缩生物瓣膜吸水后更好地复原。对于解决弹性和韧性的问题，现阶段的主要解决方案为向生物瓣膜中填充合成高分子材料和亲水性天然高分子材料增加弹性。大量新材料的引入无疑增加免疫原性的风险，可能形成新的钙化点，增加瓣膜的破坏风险；另一方面，亲水天然高分子材料的往往对膜片弹性增强效果有限。

发明内容

本申请提供一种基于胶原蛋白纳米纤维填充的生物材料及交联改性方法，通过填充单分子胶原蛋白，并实现其在生物材料内自组装成纳米纤维结构，进一步通过戊二醛交联固定，解决脱水生物材料压缩后的恢复问题同时避免了大量新材料的引入。

一种生物材料，包括生物基体材料以及填充于生物基体材料且经交联处理的胶原蛋白。

可选的，所述胶原蛋白采用在填充过程中先采用单分子方式进行自组装，再进行所述交联处理。

可选的，所述单分子为分子量为100～400Kda的胶原蛋白。

可选的，其中所述胶原蛋白与所述生物基体材料采用相同或不同的生物来源。

可选的，所述生物材料的最大断裂力n为25～35N。

可选的，所述最大断裂力的检测方法为：所述生物材料的干膜水合后，切割成1*5cm膜条，通过万能拉伸机测得。所述的干膜水合可以理解为生物材料的干膜重新吸水例如浸泡于生理盐水水溶液中。

可选的，所述生物材料的干膜以3*3cm膜片折叠压缩至1ml注射器圆筒，40℃烘箱里放置3天后释放到生理盐水溶液中，无明显折痕。所述的无明显折痕可以理解为折叠压缩后的干膜释放于生理盐水溶液中，重新吸水后折叠的地方无痕迹，整个膜展开与干膜折叠前水合后的状态一致。

一种基于胶原蛋白纳米纤维填充的生物材料的制备方法，包括：

将生物基体材料暴露于含胶原蛋白溶液中进行预处理，得预制品；所述预制品暴露于交联剂中，经交联处理得所述生物材料。

可选的，所述生物基体材料中，胶原含量为60～90％。

可选的，所述生物基体材料的生物来源包括猪、牛、马或羊。

可选的，所述生物基体材料的来源部位包括心包膜、心脏瓣膜、血管、韧带、肌肉、肠或皮肤。

进一步可选的，所述生物基体材料为猪心包膜或牛心包膜。

可选的，所述生物基体材料在暴露于含胶原蛋白溶液中前需进行常规预处理；所述常规预处理包括酸碱浸泡和脱细胞，酸碱浸泡包括酸浸泡和/或碱浸泡；可以选用三种处理方式的一种，也可以选用三种处理方式的任意两种组合或选择三种处理方式组合；酸碱浸泡的顺序可替换，但不可同时进行。

酸碱浸泡可改善生物基体材料的微观结构，使得生物基体材料中的胶原纤维更松散。可选的，酸浸泡处理中，将新鲜生物基体材料浸泡于酸的水溶液中；酸包括但不限于盐酸、醋酸、草酸、柠檬酸；酸溶液的浓度为2～10mM；浸泡时间为5～120min。

可选的，碱浸泡处理中将新鲜生物基体材料浸泡于碱的水溶液中；碱包括但不限于氢氧化钠或碳酸钠；碱溶液的浓度为2～10mM；浸泡时间为5～120min。

脱细胞处理可清洗掉生物基体材料中的免疫原。可选的，脱细胞处理中，将新鲜生物基体材料浸泡于脱细胞液中；脱细胞液为十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100组合的水溶液，脱细胞液质量百分比浓度为0.1％～5％，脱细胞时间为2～72h。

可选的，所述含胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量百分比浓度为0.01％～10％。该质量百分比浓度是指起始反应时的浓度；溶液中溶剂为纯化水。

进一步可选的，所述含胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量百分比浓度为1％～5％。

可选的，含胶原蛋白溶液中胶原蛋白分子量范围100KDa～400KDa。

可选的，所述胶原蛋白来自于与所述生物基体材料相同或不同的生物来源。

所述相同生物来源可以理解为来源于相同生物的不同组织部位或者相同生物的相同组织部位，例如用于制备生物材料的生物材料为猪心包膜，所述胶原蛋白也提取自猪心包膜。

所述的预处理过程中，单分子的胶原蛋白分子先分散于生物材料中，再经自组装形成纳米胶原纤维。生物基体材料暴露于含胶原蛋白溶液中，通过控制不同的反应条件，使胶原蛋白先在生物基体材料中分散，再经自组装成纳米胶原纤维。

一种可选的预处理方式中，所述预处理依次包括：

第一阶段，含胶原蛋白溶液的pH值为弱酸性；

第二阶段，含胶原蛋白溶液的pH值为弱碱性。

采用该预处理方式时：

可选的，第一阶段中，所述含胶原蛋白溶液的pH值为3～5。

可选的，第一阶段处理时间为0.5h～36h。

可选的，第二阶段中，所述含胶原蛋白溶液的pH值为7～8。

进一步可选的，第二阶段中，所述含胶原蛋白溶液的pH值为7～7.5。

可选的，第二阶段处理时间为0.5h～36h。

另一种可选的预处理方式中，所述预处理依次包括：

第一阶段，含胶原蛋白溶液的pH值为弱酸性；

第二阶段，相对于第一阶段改变反应溶液中的溶剂组分。

采用该预处理方式时：

可选的，第一阶段中，所述含胶原蛋白溶液的pH值为3～5。

可选的，第一阶段处理时间为0.5h～36h。

可选的，第二阶段中，使反应溶液中的有机溶剂体积占反应溶液总体积40～60％。以机溶剂体积占反应溶液总体积50％为例，有机溶剂的加入体积与弱酸性的含胶原蛋白溶液的体积比为1:1。

可选的，第二阶段中，采用加入有机溶剂的方式改变反应溶液中的溶剂组分，加入的有机溶剂为异丙醇或乙醇。

可选的，第二阶段处理时间为0.5h～36h。

在弱酸性条件下，单分子的胶原蛋白填充进入生物基体材料中，调节含胶原蛋白溶液至弱碱性并继续在弱碱性胶原蛋白溶液中暴露0.5～36h或向弱酸性的含胶原蛋白溶液中加入有机溶剂至有机溶剂体积占反应溶液总体积40～60％并继续在胶原蛋白有机溶剂混合溶液中暴露0.5～36h，进入生物基体材料的单分子胶原蛋白进行组装，形成纳米胶原纤维。

可选的，预处理过程中，所述生物基体材料在胶原蛋白溶液中的暴露方式为静态接触或动态接触。

静态接触可以理解为胶原蛋白溶液的处理过程中，生物基体材料与胶原蛋白溶液之间保持相对静止，例如浸泡。动态接触可以理解为胶原蛋白溶液的处理过程中，生物基体材料与胶原蛋白溶液之间相对运动，例如向所述生物基体材料循环喷淋胶原蛋白溶液，或在生物基体材料浸泡于胶原蛋白溶液时搅拌或摇动反应体系。以下提到的静态接触或动态接触中，如无特殊说明，也可通此理解。

可选的，所述交联剂为戊二醛；所述预制品暴露于戊二醛溶液中，戊二醛溶液中戊二醛的质量百分比浓度0.05％～25％，溶剂为常规溶剂，例如可以从水、生理盐水或缓冲液中选择；交联时间为6h～3周；交联温度为0～37℃。

可选的，交联处理步骤中，所述预制品与交联剂溶液之间静态接触或动态接触。

可选的，所述制备方法还包括后处理，具体包括：交联处理后的生物材料再次暴露于含明胶蛋白溶液中。该处理步骤一方面可封闭生物材料表面的残余醛基，另一方面明胶蛋白分子量较小，溶解性更好，可增强生物材料的弹性。

可选的，后处理中，含明胶蛋白溶液中明胶蛋白的质量百分比浓度为0.01％～5％，，溶剂为常规溶剂，例如可以从水、生理盐水或缓冲液中选择；在含明胶蛋白溶液中的暴露时间为0.5h～一周。

可选的，后处理步骤中，所述生物材料与含明胶蛋白溶液之间静态接触或动态接触。

可选的，所述制备方法还包括柔顺处理：包括将完成后处理的生物材料暴露于柔顺剂中。

可选的，所述柔顺剂包括第一组分、第二组分和溶剂；

所述第一组分为甘油，第一组分含量为5wt％～50wt％；

所述第二组分为组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、透明质酸钠、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸甘油酯、聚甘油中的一种或任意几种组合，第二组分含量为1wt％～30wt％；

溶剂为水、乙醇、异丙醇的一种或混合溶剂；

在柔顺剂中的暴露时间为0.5h～3周。

可选的，柔顺处理步骤中，所述生物材料与柔顺剂之间静态接触或动态接触。

可选的，所述制备方法还包括对柔顺处理后的生物材料进行干燥处理；所述干燥处理的过程包括：先室温干燥2～72h，然后鼓风干燥或真空干燥1～5天，鼓风干燥或真空干燥温度为15～100℃。

可选的，所述明胶蛋白来自于与所述生物基体材料相同或不同的生物来源。

可选的，所述胶原蛋白和明胶蛋白均从与所述生物基体材料相同或不同生物来源的生物基体材料中自提取；所述胶原蛋白的提取过程依次包括脱细胞、有机溶剂浸泡、酸浸泡、匀浆、酶解和提纯步骤；所述明胶蛋白的提取过程依次包括脱细胞、有机溶剂浸泡、酸浸泡、匀浆、酶解、降解和提纯步骤；所述降解处理过程中，控制降解时间1-60min、降解温度40-80℃。

胶原蛋白和明胶蛋白的自提取工艺均包括生物材料前处理、匀浆、酶解、后处理等过程；前处理过程相同，依次包括依次进行的脱细胞、有机溶剂浸泡和酸浸泡；胶原蛋白的后处理包括提纯；明胶蛋白提取的后处理包括依次进行的降解和提纯；提纯后的胶原蛋白或明胶蛋白即可用于生物材料改性填充，也可对对提纯后的胶原蛋白进行干燥处理。

可选的，所述脱细胞的处理过程中，将新鲜生物基体材料浸泡于脱细胞液中；所述脱细胞液为十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100组合的水溶液，脱细胞液的质量百分比浓度为0.1％～5％，脱细胞时间为2～72h。

可选的，所述有机溶剂浸泡的处理过程中，将生物基体材料浸泡于有机溶剂中，所述有机溶剂包括但不限于乙醇或异丙醇，浸泡时间为1-24h。

可选的，所述酸浸泡的处理过程中，将生物基体材料浸泡于酸的水溶液中，所述酸包括但不限于盐酸、醋酸、草酸或柠檬酸；酸溶液浓度为0.001～0.5M；浸泡时间为5～120min。

可选的，所述匀浆的处理过程中，先把酸浸泡后的心包膜切成约3×3cm的小块，调节不同的转速和时间匀浆，直至材料被完全打碎。

可选的，所述酶解的处理过程中，加入胃蛋白酶进行酶解，酶浓度(即酶的加入量在反应体系中所占质量百分比浓度)0.1％-10％，时间4-24h，温度4-37℃。

可选的，所述后处理的降解过程中，控制加热时间为1-60min，加热温度为40-80℃。

可选的，所述后处理的提纯过程中，通过离心，NaCl盐析洗涤，乙醇沉降洗涤，透析中的一种或几种组合方式。

可选的，所述后处理的干燥过程中，干燥主要包括烘干和冻干；干燥条件为蛋白干燥的常规条件。

在交联前的胶原蛋白溶液浸泡处理过程中，先调节胶原蛋白溶液至弱酸性，单分子胶原蛋白进入生物基体材料内，均匀分散于生物基体材料中；然后通过调节胶原蛋白溶液至弱碱性或向弱酸性胶原蛋白溶液中缓慢加入有机溶剂如异丙醇，分散在生物基体材料中的单分子胶原蛋白发生自组装，在生物基体材料中按照一定规则排列。单分子胶原蛋白分散于生物基体材料以及在生物基体材料中的自组装过程均为物理结合。在下一步的交联过程中，填充的胶原蛋白纳米纤维之间、填充的胶原蛋白纳米纤维与生物材料的胶原蛋白之间、生物材料的胶原蛋白之间通过交联剂相互交联固定。

本申请中用于填充生物基体材料的胶原蛋白与用于交联的生物基体材料采用相同或不同的生物来源。自相同生物来源的生物基体材料中提取同源胶原蛋白，并实现其在生物基体材料内自组装成纳米纤维结构，通过进一步戊二醛交联固定，解决脱水生物材料压缩后的恢复问题，同时避免了大量新材料的引入，减低了生物瓣膜的免疫原性。

一种如所述制备方法制备得到的生物材料。

本申请制备的生物材料可以用于介入生物瓣膜，例如通过微创介入，也可用于外科生物瓣膜，例如通过外科手术植入。

一种基于胶原蛋白纳米纤维填充的生物材料预制品的制备方法，包括：

将生物基体材料暴露于含胶原蛋白溶液中进行预处理，得预制品；所述胶原蛋白来自于与所述生物基体材料相同或不同的生物来源。该预处理过程同如前所述生物材料制备方法中的预处理步骤。

一种如述制备方法制备得到的生物材料预制品。

一种生物瓣膜，包括支架和设置在支架上的瓣膜，所述瓣膜为本申请所述的生物材料。该生物瓣膜可以是通过微创介入的介入瓣膜，也可以是通过外科植入的植入瓣膜。

可选的，所述生物瓣膜为心脏瓣膜；包括网筒状的支架和设置在支架内的瓣膜。

一种介入系统，包括心脏瓣膜和输送导管，所述心脏瓣膜折叠后由输送导管输送，所述心脏瓣膜为如前所述的心脏瓣膜。

与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：

(1)通过填充单分子胶原蛋白，并实现其在生物材料内自组装成纳米纤维结构，进一步通过戊二醛交联固定，解决脱水生物材料压缩后的恢复问题；

(2)相同生物来源的生物材料提取同源胶原蛋白，并实现其在生物材料内自组装成纳米纤维结构，通过进一步戊二醛交联固定，解决脱水生物材料压缩后的恢复问题，同时避免了大量新材料的引入，减低了生物瓣膜的免疫原性。

(3)明胶蛋白提取过程中通过控制不同降解时间和不同降解温度可得到不同分子量蛋白，用于生物材料的后处理，可进一步提高生物材料的弹性。

(4)生物材料的干膜水合后，切割成1*5cm膜条，通过万能拉伸机测得最大断裂力n可达25～35。

(5)生物材料的干膜以3*3cm膜片折叠压缩到1ml注射器圆筒里，在40℃的烘箱里放置3天；而后释放到生理盐水溶液中，观察膜片的展平情况，释放浸水后，无明显可见折痕。

附图说明

图1为本申请胶原蛋白填充生物材料交联改性的一种实施工艺流程图。

图2为本申请胶原蛋白自提取的一种实施工艺流程图。

图3为本申请明胶蛋白自提取的一种实施工艺流程图。

图4为本申请实施例1生物材料的最大断裂力与常规戊二醛交联膜的对比结果图.

图5为本申请实施例1生物材料的干膜吸水展平结果图。

图6为本申请实施例3生物材料的最大断裂力与常规戊二醛交联膜的对比结果图.

图7为本申请实施例3生物材料的干膜吸水展平结果图。

图8为本申请实施例4生物材料的最大断裂力与常规戊二醛交联膜的对比结果图.

图9为本申请实施例4生物材料的干膜吸水展平结果图。

图10为本申请实施例5生物材料的最大断裂力与常规戊二醛交联膜的对比结果图.

图11为本申请实施例5生物材料的干膜吸水展平结果图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

如图1所示，针对生物材料预制品以及交联改性的生物材料的制备，可实施流程图的中相应步骤，两者的制备在同一流程图中说明仅仅为了便于对照，并不作为额外限定。总体而言。流程依次包括生物基体材料的常规前处理、预处理、交联、明胶蛋白溶液浸泡、柔顺剂浸泡和干燥。常规的前处理过程包括选自酸碱浸泡和脱细胞，但并非本申请重点，仅仅作为保证反应效果的常规预处理手段。

常规预处理：常规预处理采用酸碱浸泡或脱细胞或二者组合；酸碱浸泡包括酸浸泡和/或碱浸泡，如需同时采用时，酸浸泡和碱浸泡顺序可替换，但不可同时进行。

酸浸泡的处理中，将新鲜生物基体材料浸泡于酸的水溶液中；酸包括但不限于盐酸、醋酸、草酸、柠檬酸；酸溶液的浓度为2～10mM；浸泡时间为5～120min。

碱浸泡的处理中，将新鲜基体生物材料浸泡于碱的水溶液中；碱包括但不限于氢氧化钠、碳酸钠；碱溶液的浓度为2～10mM；浸泡时间为5～120min。

脱细胞的处理中，将新鲜生物基体材料浸泡于脱细胞液中；脱细胞液液为十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100的组合的水溶液，脱细胞液质量百分比浓度为0.1％～5％，脱细胞时间为2～72h。

常规预处理过程中，每一步处理结束采用PBS、生理盐水、乙醇中一种或至少两种的混合清洗液清洗2～4次，每次10～20min。

生物基体材料可选自猪心包膜或牛心包膜。

预处理(胶原纳米纤维填充)：胶原蛋白溶解在弱酸性溶液或溶解水中并调节溶液的pH值至弱酸性，其中pH值的范围3.0-5.0，预处理后的生物基体材料例如猪心包膜或牛心包膜浸泡于该含胶原蛋白溶液中0.5h～36h(引发自组装前的浸泡时间)，在该弱酸性条件下，含胶原蛋白溶液中的单分子胶原蛋白的分子量范围100KDa～400KDa；含胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量百分比浓度范围为0.01％～10％。

弱酸性胶原蛋白溶液中浸泡0.5h～36h后，缓慢调节含胶原蛋白溶液的pH值至弱碱性例如7.4左右，并继续浸泡0.5h～36h，单分子胶原蛋白在生物材料中进行自组装；或者向含胶原蛋白溶液中缓慢加入有机溶剂如异丙醇至异丙醇的添加量占含胶原蛋白和有机溶剂混合溶液体积的50％左右为止，并继续浸泡0.5h～36h，单分子胶原蛋白在生物材料中进行自组装。

该胶原纳米纤维填充的步骤完成后，单分子胶原蛋白在生物基体材料中分散和自组装，得到生物材料的预制品。

交联：在交联步骤中，填充的胶原蛋白纳米纤维之间、填充的胶原蛋白纳米纤维与生物材料的胶原蛋白之间、生物基体材料的胶原蛋白之间通过交联剂相互交联固定。

交联过程的一种实施方式为戊二醛交联，戊二醛浓度为0.05％～25％，交联时间为6h～3周，交联温度为0～37℃。

交联处理后可选择地进行后处理，后处理可从明胶蛋白溶液浸泡、柔顺剂浸泡和干燥中选择其一或任一几种的组合。

明胶蛋白溶液浸泡：在交联处理后可选择地进行明胶蛋白溶液浸泡处理；蛋白浓度范围为0.01％～5％，浸泡时间为0.5h～1周。

柔顺剂浸泡：在交联处理后可选择地进行柔顺剂浸泡处理。

柔顺剂包括第一组分、第二组分和溶剂。第一组分为甘油；第二组分为组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、透明质酸钠、甘露醇、山梨醇、硬脂酸、硬脂酸甘油酯和聚甘油中的1种或几种组合；溶剂为水、乙醇和异丙醇的1种或混合溶剂。第一组分的质量百分含量为5％～50％；第二组分的质量百分含量为0.1％～30％；浸泡时间为0.5h～3周。

干燥：可选择的进行干燥处理，制成干膜，便于用于介入系统中的预装载。

干燥过程为室温干燥2～72h，然后鼓风干燥或真空干燥1～5天，鼓风干燥或真空干燥温度为15～100℃。

胶原纳米纤维填充中采用的胶原蛋白的分子量范围为100KDa～400KDa；可从与改性生物材料相同生物来源的生物基体材料中自提取，也可从与改性生物材料不同生物来源的生物材料中自提取，也可采用满足该分子量要求的其他胶原蛋白，一种实施方式中，胶原蛋白的自提取工艺流程如图2所示，明胶蛋白的自提取工艺流程如图3所示(胶原蛋白的提取工艺相对明胶蛋白的提取工艺减少降解步骤，其他步骤一致)，胶原蛋白和明胶蛋白的自提取工艺包括均生物基体材料前处理、匀浆、酶解、后处理等过程；胶原蛋白和明胶蛋白的前处理过程相同，前处理过程包括依次进行的脱细胞、有机溶剂浸泡和酸浸泡；后处理过程中胶原蛋白与明胶蛋白的处理有所不同，胶原蛋白的后处理包括提纯；明胶蛋白的后处理包括依次进行的降解和提纯；提纯后的胶原蛋白或明胶蛋白即可用于生物基体材料改性填充，也可对对提纯后的胶原蛋白进行干燥处理。

脱细胞：脱细胞的处理过程中，将新鲜生物基体材料猪心包膜或牛心包膜浸泡于脱细胞液中；脱细胞液为十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100组合的水溶液，脱细胞液的质量百分比浓度为0.1％～5％，脱细胞时间为2～72h。

有机溶剂浸泡：有机溶剂浸泡的处理过程中，将生物基体材料浸泡于有机溶剂中，有机溶剂包括但不限于乙醇或异丙醇，浸泡时间为1-24h。

酸浸泡：酸浸泡的处理过程中，将生物基体材料浸泡于酸的水溶液中，酸包括但不限于盐酸、醋酸、草酸或柠檬酸；酸溶液浓度为0.001～0.5M；浸泡时间为5～120min。

匀浆：匀浆的处理过程中，先把酸浸泡后的心包膜切成约3×3cm的小块，调节不同的转速和时间匀浆，直至材料被完全打碎。

酶解：酶解的处理过程中，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解体系中酶浓度0.1％-10wt％，时间4-24h，温度4-37℃。

降解：后处理的降解过程中，通过加热不同时间(1-60min)和不同温度(40-80℃)

提纯：胶原蛋白的提取中，酶解后直接提纯，明胶蛋白的提取中，酶解后经过降解再提纯，提纯过程中，通过离心，NaCl盐析洗涤，乙醇沉降洗涤，透析中的一种或几种组合方式。

干燥：后处理的干燥过程中，干燥主要包括烘干和冻干；干燥条件为蛋白干燥的常规条件，干燥为可选步骤，提纯后的胶原蛋白可直接用于生物材料填充步骤。

以下以具体的实施例进行说明：

以下实施例中以百分比表示的浓度如无特殊说明均为质量百分比浓度。

实施例1

以1％曲拉通和1％SDS溶液在37℃条件下浸泡猪心包膜12h；随后，在异丙醇溶液中浸泡12h，除去油脂；在0.5M的乙酸溶液中浸泡2h；切成小块并加入2倍体积0.5M的乙酸溶液匀浆，其中匀浆速率为15000rpm，时间为2min，间歇式匀浆3次；加入2％的胃蛋白酶，放在4℃条件下，酶解12小时；离心除去不溶物，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到胶原蛋白冻干粉，用于自组装。

上述酶解后的样品在60℃条件下，加热20min，进行降解；离心除去不溶物，用0.2MNaCl溶液盐析并洗涤3次，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到明胶蛋白冻干粉。

用0.5％十二烷基硫酸钠和0.5％曲拉通X-100浸泡新鲜猪心包膜8h，洗涤3次；而后在pH为4.5的2％胶原蛋白溶液(如前所述的胶原蛋白冻干粉溶解于水中并调节水溶液的pH值为4.5)浸泡2h；然后将反应溶液pH值逐渐调节到7.4并继续静置12h；而后，在0.05％戊二醛水溶液中交联6h，用生理盐水清洗干净。25％甘油浸泡0.5h。然后在室温条件下干燥2h，15℃鼓风干燥1天。

实施例2

以1％曲拉通和1％SDS溶液在37℃条件下浸泡猪心包膜12h；随后，在异丙醇溶液中浸泡12h，除去油脂；在0.02M的盐酸溶液中浸泡2h；切成小块并加入2倍体积0.02M的盐酸溶液匀浆，其中匀浆速率为15000rpm，时间为2min，间歇式匀浆3次；加入2％的胃蛋白酶，放在37℃条件下，酶解12小时；离心除去不溶物，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到胶原蛋白冻干粉。

上述酶解后的样品在80℃条件下，加热5min，对胶原蛋白进行降解；离心除去不溶物，用0.2M NaCl溶液盐析并洗涤3次，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到明胶蛋白冻干粉。

新鲜猪心包膜在pH为4.5的2％胶原蛋白溶液(如前所述的胶原蛋白冻干粉溶解于水中并调节水溶液的pH值为4.5)浸泡0.5h。缓慢加入异丙醇直至50％(即异丙醇与蛋白溶液体积比1：1)并静置2h。在0.05％戊二醛溶液中交联6h，用生理盐水清洗干净。25％甘油浸泡0.5h。然后在4℃条件下干燥2h，15℃鼓风干燥1天。

实施例3

以1％曲拉通和1％SDS溶液在37℃条件下浸泡猪心包膜12h；随后，在异丙醇溶液中浸泡12h，除去油脂。在0.02M的盐酸溶液中浸泡2h；切成小块并加入2倍体积0.02M的盐酸溶液匀浆，其中匀浆速率为15000rpm，时间为2min，间歇式匀浆3次；加入2％的胃蛋白酶，放在37℃条件下，酶解12小时；离心除去不溶物，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到胶原蛋白冻干粉。

上述酶解后的样品在80℃条件下，加热5min，降解胶原蛋白；离心除去不溶物，用0.2M NaCl溶液盐析并洗涤3次，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到明胶蛋白冻干粉。

10mM醋酸浸泡新鲜猪心包膜120min，用纯化水清洗干净，然后用5％十二烷基硫酸钠和5％曲拉通X-100浸泡72h；膜片在pH 4.5浓度5％胶原蛋白溶液(如前所述的胶原蛋白冻干粉溶解于水中并调节水溶液的pH值为4.5)浸泡12h，pH调节到7.4并静置12h；在25％戊二醛溶液中交联3周，用生理盐水清洗干净；15％甘油和5％硬脂酸甘油酯混合液浸泡0.5h。然后冷冻干燥。

实施例4

以1％曲拉通和1％SDS溶液在37℃条件下浸泡猪心包膜12h；随后，在异丙醇溶液中浸泡12h，除去油脂。在0.02M的盐酸溶液中浸泡2h；切成小块并加入2倍体积0.02M的盐酸溶液匀浆，其中匀浆速率为15000rpm，时间为2min，间歇式匀浆3次；加入2％的胃蛋白酶，放在37℃条件下，酶解12小时；离心除去不溶物，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到胶原蛋白冻干粉。

上述酶解后的样品在80℃条件下，加热5min，降解胶原蛋白；离心除去不溶物，用0.2M NaCl溶液盐析并洗涤3次，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到明胶蛋白冻干粉。

10mM醋酸浸泡新鲜猪心包膜120min，用纯化水清洗干净，然后用5％十二烷基硫酸钠和5％曲拉通X-100浸泡72h；膜片在pH 4.5浓度5％胶原蛋白溶液(如前所述的胶原蛋白冻干粉溶解于水中并调节水溶液的pH值为4.5)浸泡12h，pH调节到7.4并静置12h；在25％戊二醛溶液中交联3周，用生理盐水清洗干净；膜片浸泡于5％的明胶蛋白溶液(如前所述的明胶蛋白冻干粉溶解于水中)中，并静置2h，而后用生理盐水清洗干净；在15％甘油和5％硬脂酸甘油酯混合液浸泡0.5h。然后鼓风干燥。

实施例5

以1％曲拉通和1％SDS溶液在37℃条件下浸泡新鲜牛心包膜12h；随后，在异丙醇溶液中浸泡12h，除去油脂。在0.02M的盐酸溶液中浸泡2h；切成小块并加入2倍体积0.02M的盐酸溶液匀浆，其中匀浆速率为15000rpm，时间为2min，间歇式匀浆3次；加入2％的胃蛋白酶，放在37℃条件下，酶解12小时；离心除去不溶物，用0.2M NaCl溶液盐析并洗涤3次，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到牛胶原蛋白冻干粉。

上述酶解后的样品在80℃条件下，加热5min，降解胶原蛋白；离心除去不溶物，放在10KDa的透析袋中透析两天；冷冻干燥得到牛明胶蛋白冻干粉。

10mM醋酸浸泡新鲜猪心包膜120min，用纯化水清洗干净，然后用5％十二烷基硫酸钠和5％曲拉通X-100浸泡72h；膜片在pH 4.5浓度5％牛胶原蛋白溶液(如前所述的牛胶原蛋白冻干粉溶解于水中并调节水溶液的pH值为4.5)浸泡12h，pH调节到7.4并静置12h；在25％戊二醛溶液中交联3周，用生理盐水清洗干净；膜片浸泡于5％的牛明胶蛋白溶液(如前所述的牛明胶蛋白冻干粉溶解于水中)中，并静置2h，而后用生理盐水清洗干净；在15％甘油和5％硬脂酸甘油酯混合液浸泡0.5h。然后鼓风干燥。

分别以实施例1、实施例3、实施例4和实施例5制备得到的膜进行断裂力实验和吸水展平实验。

断裂力实验：干膜水合后，切割成1*5cm膜条，通过万能拉伸机测得最大断裂力；以常规戊二醛交联膜作为对照。

实施例1的结果如图4所示，实施例1制备得到的膜的断裂力为25～30N之间，明显优于常规戊二醛交联膜。

实施例3的结构如图6所示，实施例3制备得到的膜的断裂力为25～30N之间，明显优于常规戊二醛交联膜。

实施例4的结构如图8所示，实施例4制备得到的膜的断裂力为25～35N之间，明显优于常规戊二醛交联膜。

实施例5的结构如图10所示，实施例5制备得到的膜的断裂力为25～35N之间，明显优于常规戊二醛交联膜。

吸水展平实验：3*3cm干态膜片折叠压缩至1ml注射器圆筒里如(如对应图中A所示)，在40℃的烘箱里放置3天；而后释放到生理盐水溶液中，观察膜片的展平情况。

实施例1的结果如图5中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为胶原纳米填充HE干膜(实施例1制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。

实施例3的结果如图7中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为胶原纳米填充HE干膜(实施例3制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。

实施例4的结果如图9中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为胶原纳米填充HE干膜(实施例4制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。

实施例5的结果如图11中B和C所示，其中B为常规戊二醛交联干膜，膜片有大量折痕；C为胶原纳米填充HE干膜(实施例5制备)，释放浸水后，无明显可见折痕。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。