牛磺胆酸及其水溶性盐对新冠病毒的核糖核酸内切酶活性抑制作用的应用

技术领域

本发明属于病毒免疫治疗技术领域，特别是牛磺胆酸及其水溶性盐对新冠病毒的核糖核酸内切酶活性抑制作用的应用。

背景技术

据《2019新型冠状病毒的研究进展》(谢茜等，病毒学报，2020.05，2020(36)3,493-500) 介绍，新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组约为29.8kb，含有14个开放阅读框(ORF)，共编码27～28个蛋白质。位于基因组5′端的ORF1ab和ORF1a基因分别编码复制酶多聚蛋白pp1ab和pp1a，由蛋白酶剪切为15或16个非结构蛋白(Non-structure protein，Nsp)，包括Nsp1～Nsp10和Nsp12～Nsp16。基因组的3′端编码4种在冠状病毒中相对保守的结构蛋白，分别为表面刺突糖蛋白(Spike，S)、小包膜蛋白(Envelope，E)、外膜蛋白 (Membrane，M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)。

新型冠状病毒SARS-CoV-2的尿苷酸特异性核糖核酸内切酶(以下简称“Nsp15”)是新型冠状病毒SARS-CoV-2(以下简称“新冠病毒”)中的非结构蛋白，其酶学特征为特异性切割尿苷酸位点的核糖核酸内切酶，在新冠病毒SARS-CoV-2的复制过程中发挥重要的作用。探索新冠病毒NSP15的活性抑制方法和因素，能够针对新冠病毒复制过程开发病毒抑制剂，进而为感染新冠病毒的患者治疗提供更多的治疗方案。

发明内容

针对以上现有技术的不足，申请人使用大肠杆菌表达系统体外表达新冠病毒Nsp15蛋白，并对其进行活性抑制物体外筛选时发现，来源于肠道中的某种成分对Nsp15的活性具有明显的抑制效果。通过进一步分析，确认发挥抑制作用的肠道来源物质成分为牛磺胆酸。本发明提供了利用牛磺胆酸对新冠病毒Nsp15的活性的抑制效果，将牛磺胆酸应用在新型冠状病毒治疗中的思路和方法，具体通过以下技术实现。

牛磺胆酸及其水溶性盐对新型冠状病毒SARS-CoV-2的核糖核酸内切酶Nsp15活性抑制作用的应用。

牛磺胆酸(Taurocholic acid)作为一种初级胆汁酸，是肠道中常见的物质。肠道中可能存在的物质还有次级胆汁酸，例如牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholic acid)；碳水化合物，例如果糖(Fructose)、纤维二糖(Cellobiose)、麦芽糖(Maltose)，以及氨基酸，例如天冬酰胺(Asparagine)等。

牛磺胆酸水溶性不高，目前一般使用其水溶性盐为原料进行相关实验，最常用的是牛磺胆酸钠盐。申请人通过利用牛磺胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐、苯紫红素4B(Benzopurpurine 4B，阳性对照，1mM)、果糖、纤维二糖、麦芽糖、天冬酰胺(Asparagine) 分别进行新冠病毒的Nsp15的活性抑制实验，设置牛磺胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐的浓度梯度为10nM、100nM、1000nM(1μM)，果糖的浓度(w/v)梯度分别为0.005％、0.05％、 0.5％，纤维二糖的浓度(w/v)梯度分别为0.001％、0.01％、0.1％，麦芽糖的浓度(w/v) 梯度分别为0.002％、0.02％、0.2％，天冬酰胺的浓度梯度为4μM、40μM、400μM，设置超纯水作为空白对照。最终发现采用上述三个浓度的牛磺胆酸钠盐，均对Nsp15的活性具有明显的抑制作用，而牛磺脱氧胆酸钠盐、果糖、纤维二糖、麦芽糖无论采用哪个浓度，都对新冠病毒的Nsp15不具有明显的抑制效果。

因此，采用牛磺胆酸及其水溶性盐能够明显地抑制新冠病毒的Nsp15的活性，抑制活性的机制还有待深入研究。利用这种新发现的牛磺胆酸的功能，可将牛磺胆酸及其水溶性盐作为试剂或原料，应用于生产制备治疗新冠病毒的药物中。目前国内外其他研究机构未报道牛磺胆酸及其水溶性盐对新冠病毒的Nsp15的活性的这种抑制作用，是申请人新发现的牛磺胆酸的全新功能。

优选地，所述牛磺胆酸及其水溶性盐用于制备因新型冠状病毒SARS-CoV-2感染造成的人体疾病的治疗药物。

优选地，所述人体疾病为呼吸系统炎症。新冠病毒感染造成的人体疾病除了呼吸系统疾病以外，还会引起发热(发烧)、全身乏力、干咳、多种组织器官炎症、肺组织纤维化等病症。

更优选地，所述呼吸系统炎症为肺炎、呼吸道炎症。

更优选地，所述治疗药物为含有牛磺胆酸或其水溶性盐的口服剂、外用剂或注射剂。

进一步优选地，所述口服剂为含有牛磺胆酸或其水溶性盐的粉剂、胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂。

进一步优选地，所述外用剂为含有牛磺胆酸或其水溶性盐的雾化剂、液态凝胶制剂。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明利用牛磺胆酸及其水溶性盐在新冠病毒Nsp15的特异性抑制作用，提供了牛磺胆酸及其水溶性盐在治疗因新冠病毒引起的人体疾病的应用方法，属于牛磺胆酸及其水溶性盐的全新功能和全新应用，对新冠病毒的防治具有非常重要的意义。

附图说明

图1为不同浓度的牛磺胆酸钠盐、苯紫红素4B阳性对照，与阴性对照ddH

图2为不同浓度的牛磺脱氧胆酸钠盐、苯紫红素4B阳性对照，与阴性对照ddH

图3为不同浓度的果糖、纤维二糖、麦芽糖、苯紫红素4B阳性对照，与阴性对照ddH

图4为不同浓度的天冬酰胺、苯紫红素4B阳性对照，与阴性对照ddH

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1、新型冠状病毒SARS-CoV-2的Nsp15蛋白的表达

含有重组质粒pET-32a(+)-Nsp15(SARS-CoV-2核酸酶Nsp15)的大肠杆菌BL21(DE3) 菌株由上海交通大学陶生策教授赠送。

(1)将2.5ml含重组质粒pET-32a(+)-Nsp15的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的过夜培养物接种到250ml含100μg/ml氨苄西林的新鲜LB培养基中，细胞生长至适当的光学密度 OD

(2)加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在18℃下继续培养菌株16h，诱导Nsp15表达，之后于4℃及8000×g离心2min以收取细胞，重悬细胞于10ml预冷的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH值8.0)中；

(3)加入1mg/ml溶菌酶在冰上消化菌体30min后进行超声处理，在4℃下10,000×g离心30分钟，转移上清液至干净离心管中并加入甘油至终浓度50％，于-80℃保存，得到含新冠病毒核糖核酸内切酶Nsp15的溶液。

上述重组Nsp15蛋白的具体表达方法参照以下现有文献进行：

(1)Bhardwaj K,Guarino L,Kao CC:The severe acute respiratory syndromecoronavirus Nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as acofactor.Journal of virology 2004，78(22)：12218-12224.

(2)Fan K，Wei P，Feng Q，Chen S，Huang C，Ma L，Lai B，Pei J，Liu Y，Chen J etal：Biosynthesis，pureification，and substrate specificity of severe acuterespiratory syndrome coronavirus 3C-like proteinase.The Journal of biologicalchemistry 2004，279(3)：1637-1642.

2、新冠病毒核糖核酸内切酶Nsp15活性测定

(1)具有荧光共振能量转移(FRET)特性的荧光RNA底物5'-FAM-A/rU/AA-3'-BHQ1由生工生物工程(上海)合成。所有底物均采用质谱法纯化为单峰。

于30℃进行RNA底物切割试验，在含有1μM荧光RNA底物和0.27mg的Nsp15粗酶液的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH值7.5，另含有100mM KCl，5mM MnCl

(2)使用微孔板检测仪(Cytation5，Bio-Tek，US)在荧光模式下，用492nm激发光并在518nm发射光处检测因切割荧光底物RNA而产生的增强荧光。

具体方法参照以下现有文献进行：Bhardwaj K,Guarino L,Kao CC:The severeacute respiratory syndrome coronavirus Nsp15 protein is an endoribonucleasethat prefers manganese as a cofactor.Journal of virology 2004,78(22)：12218-12224

采用上述活性测定方法，新冠病毒核糖核酸内切酶Nsp15一分钟内催化荧光RNA底物，与只加底物不加酶的反应体系相比，产生1倍的荧光强度定义为一个活性单位(U)。

作为阳性对照，反应体系中含有1mM苯紫红素4B。苯紫红素4B是目前已知的，对SARS病毒核糖核酸内切酶及核糖核酸酶RNase A酶活性具有抑制作用的物质(Ortiz-Alcantara J,Bhardwaj K,Palaninathan S,Frieman M,Baric R,Kao C.Small moleculeinhibitors of the SARS-CoV Nsp15 endoribonuclease.Virus Adaptation andTreatment. 2010；2:125-133)。

3、牛磺胆酸钠盐对新冠病毒核糖核酸内切酶Nsp15活性抑制效果的测定

本实施例采用牛磺胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐进行Nsp15活性抑制测定。

(1)取牛磺胆酸钠盐(CAS：145-42-6)、牛磺脱氧胆酸钠盐(CAS：1180-95-6)、果糖、纤维二糖、麦芽糖和天冬酰胺，用于对比这几种肠道中常见的代谢物对Nsp15活性抑制效果；取苯紫红素4B(CAS：992-59-6)作为阳性对照，超纯水ddH

将牛磺胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐溶解于超纯水中，且浓度分别为10nM、100nM、1000nM(1μM)，果糖的浓度(w/v)梯度分别为0.005％、0.05％、0.5％，纤维二糖的浓度(w/v)梯度分别为0.001％、0.01％、0.1％，麦芽糖的浓度(w/v)梯度分别为0.002％、 0.02％、0.2％，天冬酰胺的浓度梯度为4μM、40μM、400μM，苯紫红素4B的浓度为1mM。

利用上述不同浓度的牛磺胆酸钠盐、牛磺脱氧胆酸钠盐、果糖、纤维二糖、麦芽糖和天冬酰胺，以及苯紫红素4B和超纯水分别进行Nsp15活性抑制试验，试验方法如下：

针对上述待测物质配制200μl的检测体系，每种物质、每个测试浓度设置3个技术重复，加样于荧光模式用微孔板(Corning，货号3915)，利用微孔板检测仪(Cytation5，Bio-Tek，US)在荧光模式下，用492nm激发光并在518nm发射光处检测因切割荧光底物 RNA而产生的增强荧光。具体结果如附图1-4所示。

从附图1中可以看到，与超纯水处理的Nsp15活性相对比，采用3个浓度的牛磺胆酸钠，对新型冠状病毒的Nsp15均具有显著的活性抑制作用(20～30％的活性抑制率)，阳性对照中，高于牛磺胆酸测试剂量一千至十万倍的苯紫红素4B对新型冠状病毒的Nsp15 的活性抑制率约为50％。可见与对SARS病毒核糖核酸内切酶的作用类似，苯紫红素4B 具有新型冠状病毒Nsp15的活性抑制作用，而极低剂量的牛磺胆酸即可达到与苯紫红素4B 相当的Nsp15活性抑制作用。

从附图2中可以看到，采用3个浓度的牛磺脱氧胆酸钠，100nM及1μM处理中Nsp15活性的略微下降，但对新型冠状病毒的Nsp15均不具有显著的活性抑制作用，经分析其原因大概是牛磺胆酸属于初级胆汁酸，而牛磺脱氧胆酸属于次级胆汁酸，由牛磺胆酸转化而来，两者化学与结构特性均不相同。

从附图3、4中可以看到，采用3个浓度的果糖(Fructose)、纤维二糖(Cellobiose)、麦芽糖(Maltose)、天冬酰胺(Asparagine)，对新型冠状病毒的Nsp15均不具有显著的活性抑制作用。

综上所述，牛磺胆酸及其水溶性盐对于新型冠状病毒SARS-CoV-2的尿苷酸特异性核糖核酸内切酶Nsp15具有明显的抑制效果。利用申请人新发现的上述抑制效果，本领域技术人员可以基于目前本领域有关抗病毒药物的公知技术手段，将牛磺胆酸及其水溶性盐应用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的治疗药物的研制中，生产胶囊剂、片剂等治疗药物，用于控制和治疗人体感染的新冠病毒SARS-CoV-2。