一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法

技术领域

本发明涉及生物油脂发酵技术领域，尤其涉及一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法。

背景技术

随着科技进步和人民生活水平提高,食品安全问题越来越受到重视。早在20世纪70年代,氯丙醇类物质已在世界范围内被认为是在食品加工过程中形成的一种有害物质。研究发现氯丙醇具有抑制雄性激素生成、致使生殖能力下降、致癌等作用。该有害物质并非人为添加,且对人体健康危害较大,因此研究其形成机制和控制技术的意义重大。

氯丙醇的生成途径有多种，主要包括：氯离子直接取代羧基生成氯丙醇；氯离子取代甘二酯和甘一酯的羟基形成氯丙醇酯，再进一步水解生成氯丙醇；或者甘油二酯首先形成缩水甘油酯,然后在氯离子存在的环境中开环生成氯丙醇酯,氯丙醇酯进一步水解形成氯丙醇等。

油脂中氯丙醇的来源主要有:原料中自然存在、原料储存过程中产生、使用含氯的水清洗、加工过程中形成、从食品包装材料中迁移、食品储存过程中形成、食品和油脂烹饪后产生。因此降低油脂中氯丙醇及其脂肪酸酯的含量主要有3种途径:减少原料中关键反应物的含量、改善油脂精炼加工工艺、从精炼产品中脱除已形成的三氯丙醇(3-MCPD)及其相关物质。此前，申请人分别从控制内源生成和外源减少的方向对油脂中氯丙醇的含量进行控制，例如：专利申请CN201710874273.2、CN201710874016.9、CN202110730304.3，分别通过添加脂肪酶抑制剂抑制微生物细胞内脂肪酶的活性、大孔树脂吸附、更改脱臭工艺的方式，均成功降低了最终油脂产物中的氯丙醇含量。但是，部分应用需求及法规要求限制脂肪酶抑制剂的添加，采用吸附的方式减少氯丙醇含量增加了工艺设备的投入和成本，低温脱臭工艺对于油脂成分要求较高。因此，仍需开发新的降低油脂中氯丙醇含量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法。

花生四烯酸(ARA)油脂是常采用微生物发酵法生产的生物甘油三酯，其常用的发酵微生物为高山被孢霉。早期的微生物发酵生产花生四烯酸油脂的工艺通常在整个发酵周期内均不进行碳源补充(如专利申请CN101560529A)，因此在发酵末期会出现发酵液中碳源含量为0g/L或接近0g/L的情况，但该情况通常被认为并不影响花生四烯酸油脂的产量。近年来，为使得花生四烯酸油脂的发酵效率进一步提升，目前使用的花生四烯酸油脂发酵生产工艺中，在发酵中后期开始补加碳源，但因发现补料至一定程度后花生四烯酸油脂的产量不会继续显著提高，且考虑到发酵末期由于微生物老化使自身生长繁殖的速率降低，以及出于生产成本等考虑，在发酵末期通常会停止补料，使得发酵末期(尤其是发酵终点附近)的发酵液中的碳源一般维持在消耗完毕或是接近0g/L的浓度水平(如专利申请CN102925502A；郑志达等，基于pH值调控的高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的补料工艺，食品科学，2016，37(17)，145-149；聂志奎等，高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的补料工艺，生物加工过程，2015，13(4))。而且，通常认为发酵后期由于菌体对碳源的消耗能力降低，在合适的时机使得碳源耗尽有利于维持油脂和ARA产量的平衡，从而可以获得相对较高的ARA产量。

现有技术中部分关于ARA发酵的基础研究中会将发酵残糖控制在较高的范围，包括CN103571896A中所述的控制残糖在5-20g/L，但实际上这仅仅是一种研究高山被孢霉发酵曲线的手段，在保证碳源充足的情况下，分析高山被孢霉的生产上限和糖耗上限。然而，研究菌株性能的手段实际上与实际生产工艺明显不同，且无需考虑实际工业生产过程中出现的问题。当获得菌株的上述关键指标后，还会进行工艺优化以提高效率、节省成本。在本申请之前，申请人所知晓并了解到的本领域高山被孢霉的发酵生产工艺，均是需要使残糖耗尽并维持一段时间，从而维持油脂和ARA产量的平衡。

综上所述，已有的花生四烯酸油脂发酵生产工艺中，发酵末期的碳源通常控制在耗尽或接近耗尽的非常低的水平。

申请人在偶然的一次发酵工艺调控方式调整过程中，意外地发现在发酵末期将碳源控制在相对较高的水平，而不是将碳源耗尽或接近耗尽，获得的精炼油中3-MCPD的含量明显低于常规工艺水平；进一步对比研究发现，在发酵末期甚至是发酵的整个周期内，若出现发酵液中的碳源不足以维持菌体生长平衡，例如碳源含量极低或者耗尽的情况，将会增加精炼油中3-MCPD的含量。推测出现上述现象的原因可能是常规的控糖工艺虽然不影响ARA的积累，但是由于无法在发酵末期提供足够的葡萄糖维持微生物的代谢活动，导致微生物更多地利用脂肪酸维持必要的生命活动，前期所合成的甘油三酯形式的脂肪酸被部分分解为甘油二酯等形式的脂肪酸，而ARA油脂的精炼过程不可避免地会在升温、保温步骤形成高温条件，尤其是脱臭步骤所需的温度更高，因此在精炼过程中甘油二酯作为3-MCPD形成的关键前体物质极容易生成3-MCPD，但是产生3-MCPD的途径和涉及的前体物质多种多样，也不排除发酵过程的碳源控制影响了3-MCPD的其它相关代谢途径或前体物质。基于上述发现，申请人尝试从发酵控制的角度研发减少内源性3-MCPD生成的方法。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，所述方法包括：在微生物发酵生产花生四烯酸油脂的整个发酵周期内，控制发酵液中碳源含量大于0g/L，且在发酵末期控制发酵液中碳源含量为1.4-2.5g/L；

本发明中所述的碳源为外源碳源，也即本领域技术人员常规理解的发酵指标“残糖”。

所述发酵末期为发酵总时长的后1/4-1/7阶段。

本发明中，发酵末期包含发酵终点。

本发明发现，发酵末期的碳源含量控制不仅影响精炼油中氯丙醇的含量，而且还会对花生四烯酸油脂的产量、ARA含量和甘油三酯的含量产生影响。为保证ARA的生产效率，需要同时兼顾低氯丙醇含量和高油脂和ARA产量。在发酵末期(包含发酵终点)将发酵液中碳源的含量控制在1.4-2.5g/L(优选以葡萄糖含量计)，同时保证在整个发酵周期内碳源不出现耗尽的情况，能够在降低油脂中氯丙醇前体物质(例如甘油二酯)含量和精炼油中氯丙醇含量的同时，保证油脂的产量、ARA和甘油三酯的含量非但不会受到不利影响，还有一定程度的提升。而碳源含量控制在高于上述含量范围，精炼油中氯丙醇的含量明显升高，花生四烯酸油脂中ARA和甘油三酯的含量明显下降，低于上述含量范围，精炼油中氯丙醇的含量明显升高。

优选地，在微生物发酵生产花生四烯酸油脂的整个发酵周期内，控制发酵液中碳源含量≥1g/L。进一步优选地，在微生物发酵生产花生四烯酸油脂的整个发酵周期内，控制发酵液中碳源含量≥1.4g/L。

本发明中，氯丙醇优选为3-氯丙醇。

本发明中，用于发酵生产花生四烯酸油脂的微生物优选为高山被孢霉(Mortierella alpine)。

在本发明的一些实施方式中，用于发酵生产花生四烯酸油脂的微生物为高山被孢霉(Mortierella alpine)Y16菌株。

高山被孢霉(Mortierella alpine)Y16已于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015421，该菌株已在专利CN105586275B中公开。

值得注意的是，本发明提供的降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法对于用于发酵生产花生四烯酸油脂的高山被孢霉菌株没有特殊限制，其他菌株，例如专利CN103571896B中公开的高山被孢霉CCTCC NO:M2013419，也可适用于本发明的降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法并达到预期的效果。

除发酵末期的碳源含量控制外，本发明进一步发现，将发酵中期的碳源控制在一定范围内能够进一步降低油脂中氯丙醇及其前体物质的含量且更有利于保证花生四烯酸油脂的产量及其中ARA、甘油三酯的含量。

优选地，所述方法还包括：在微生物发酵生产花生四烯酸油脂的发酵中期控制发酵液中碳源含量为4-15g/L。

所述发酵中期为从发酵起点后占发酵总时长的1/15-1/8的时间开始至发酵末期开始前。

进一步地，所述方法还包括：在微生物发酵生产花生四烯酸油脂的发酵初期控制发酵液中碳源含量为20-40g/L；

其中，所述发酵初期为发酵总时长的前1/15-1/8，且不包含发酵中期开始的时间点。

在发酵初期，发酵液中碳源的含量受发酵培养基中初始碳源含量的影响和开始补料时机的影响。在发酵初期将碳源含量控制在上述范围内，也能够进一步一定程度地促进油脂中氯丙醇及其前体物质的含量的降低和花生四烯酸油脂产量和ARA、甘油三酯含量的提升。

本发明中，整个发酵阶段由发酵初期、发酵中期和发酵末期组成，发酵初期、发酵中期和发酵末期彼此接续且无交叉或重叠。

本发明中，碳源含量的计算为按照发酵液中葡萄糖的含量计。

本发明中，所述碳源为选自葡萄糖、蔗糖、淀粉中的一种或多种。当使用除葡萄糖以外的碳源或混合碳源时，本领域技术人员可根据该碳源的分子组成和计量关系将其换算为葡萄糖的含量。

当发酵液中的碳源含量低于需要控制的碳源含量范围时，需要通过补料的方式将碳源含量控制在需要的范围内。

对于补料方式，可采用常用的间歇补料或流加补料方式，或者采用两种方式配合使用，其中，间歇补料方式包括但不限于脉冲补料等；流加补料方式包括但不限于恒速流加、指数速率流加、变速流加等。

优选地，发酵末期和发酵中期的碳源含量控制通过间歇补料和/或流加补料实现。

进一步优选地，发酵末期的碳源含量控制通过流加补料实现，发酵中期的碳源含量控制通过流加补料或者间歇补料配合流加补料的方式实现。

在发酵末期采用流加补料的方式控制碳源含量，可使得碳源浓度更稳定，更有利于减少发酵体系中物质组成改变对菌体代谢的影响，进而有利于进一步降低油脂的氯丙醇含量。

在发酵初期不进行碳源补加，碳源含量控制优选通过控制发酵培养基中初始碳源含量实现。

优选地，发酵培养基中初始碳源含量为按照葡萄糖含量计20-40g/L。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：采用以下方法进行微生物发酵生产花生四烯酸油脂的碳源补充和碳源含量控制：

发酵初期：初始碳源含量20-40g/L，发酵起点至达到发酵总时长1/15-1/8的时间前，不进行碳源补加；

发酵中期：发酵总时长1/15-1/8的时间时开始补料，采用流加补料的方式补加碳源，或者先采用间歇补料的方式补加碳源、再采用流加补料的方式补加碳源，控制发酵液中的碳源含量按照葡萄糖含量计为4-15g/L，直至发酵末期开始前；

发酵末期：发酵总时长的后1/4-1/7阶段开始，采用流加补料的方式补加碳源，控制发酵液中的碳源含量为1.4-2.5g/L，直至发酵终点。

优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖20-40g/L，酵母浸膏10-30g/L。

所述发酵生产的温度为20-30℃(优选为23-28℃)。

发酵生产过程中控制通气量0.5-2.5vvm，搅拌转速50-250转/分钟，罐压0.02-0.1Mpa。

上述发酵培养中，接种量为4-8％。

在发酵培养前，还包括对发酵菌株进行活化培养和/或种子培养的步骤。

在本发明的一些实施方式中，先将发酵菌株接种于PDA活化固体培养基中进行一级种子培养，再将一级种子接种于含葡萄糖70-90g/L，酵母浸膏5-20g/L的种子培养基中进行二级种子培养，得到种子液，将种子液按照4-8％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

上述各级种子培养的温度优选为23-28℃。一级种子的培养时间优选为5-8天；二级种子的培养时间优选为36-60小时。

本发明还提供一种微生物发酵生产花生四烯酸油脂的方法，该方法与上述降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法相同。

本发明的有益效果在于：本发明提供的发酵生产方法能够有效降低花生四烯酸油脂中氯丙醇的含量，同时能够促进微生物的花生四烯酸油脂产量和油脂中ARA和甘油三酯含量的提升，不会导致发酵生产成本的明显增加。而且，精炼油中氯丙醇含量的降低简化了油脂的后处理工艺，降低了后处理成本和难度，能够更好地满足婴幼儿配方食品等特殊领域对于油脂原料的要求。与现有降低油脂中氯丙醇含量的方法相比，本发明的方法的成本更低，对特殊设备的依赖性较小，更适于工业化放大生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明对比例1中葡萄糖消耗曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中使用的PDA培养基斜面配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，KH

以下实施例中，葡萄糖的检测和补充是通过在线检测自动控制补料系统实现的，发酵规模为5m

实施例1

本实施例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法如下：

1、一级种子培养：将-80℃冰箱保存的高山被孢霉菌株Y16接种在活化培养基斜面(PDA培养基斜面)上，培养温度为28℃，培养至长满菌丝，培养时间为7天。

2、二级种子培养：使用接种铲挑取块状一级种子PDA斜面，接种于含80g/L葡萄糖和10g/L酵母浸膏的摇瓶培养基中，于25℃、100rpm条件下培养48h至出现白色球状菌丝体。

3、发酵罐培养：将二级种子液按5％接种量(2.5L)继续进行多级种子培养后，最后按5％的接种量接种于装有2.5m

发酵罐参数设置：发酵温度为25℃，不控制pH自然发酵，搅拌速度220转/分钟，通气量2vvm(L/L.min)，即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为2L，罐压0.1Mpa，发酵时间为9天。

发酵过程中的补糖和控糖工艺具体如下：

发酵初期：发酵起始至发酵至16h前这一阶段不补糖；

发酵中期：发酵至16h开始进行补糖，采用50％的葡萄糖溶液进行流加补糖，补糖的速度控制在0.2-0.6m

发酵末期：发酵至170h开始，采用0.1m

实施例2

本实施例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于补糖的方式略有不同，在发酵中期采取间歇脉冲补糖和流加补糖相结合的方式：

发酵中期：发酵至16h开始进行补糖，将50％的葡萄糖溶液一次性补入发酵液中，使得补入的葡萄糖在发酵液中的浓度为15g/L，72h后开始以50％的葡萄糖溶液进行流加补料，补糖的速度控制在0.3-0.5m

实施例3

本实施例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于发酵过程中的补糖和控糖工艺，具体如下：

发酵初期：发酵起始至发酵至24h前这一阶段不补糖；

发酵中期：发酵至24h开始进行补糖，采用50％的葡萄糖溶液进行流加补糖，补糖的速度控制在0.2-0.6m

发酵末期：发酵至165h时，将50％的葡萄糖溶液采用0.1m

实施例4

本实施例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于：发酵总时长为192h，初始发酵培养基不同以及发酵过程中的补糖和控糖工艺不同，具体如下：

初始发酵培养基含35g/L葡萄糖和25g/L酵母浸膏；

发酵过程中的补糖和控糖工艺具体如下：

发酵初期：发酵起始至发酵至14h前这一阶段不补糖；

发酵中期：发酵至14h开始进行补糖，采用50％的葡萄糖溶液进行流加补糖，补糖的速度控制在0.2-0.7m

发酵末期：发酵至165h时，将50％的葡萄糖溶液采用0.1m

实施例5

本实施例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于：发酵过程中的补糖和控糖工艺不同，具体如下：

发酵初期：发酵起始至发酵时间小于16h的这一阶段不补糖；

发酵中期：发酵至16h开始进行补糖，采用50％的葡萄糖溶液进行流加补糖，补糖的速度控制在0.2-0.6m

发酵末期：发酵至150h时，将50％的葡萄糖溶液采用0.1m

对比例1

本对比例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于：

发酵末期的补糖和控糖工艺不同，具体如下：

发酵末期：发酵至170h开始，不再进行任何补糖操作，直至216h发酵结束，经检测，在186h时发酵液中葡萄糖的浓度已降至0.2g/L(图1)。

对比例2

本对比例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于：发酵末期的补糖和控糖工艺不同，具体如下：

发酵末期：发酵至170h开始，依然按照实施例1的发酵中期的补糖和控糖工艺进行，将发酵末期的葡萄糖浓度保持在3±0.1g/L，直至216h发酵结束。

对比例3

本对比例以高山被孢霉Y16菌株作为发酵菌种，用于发酵生产花生四烯酸油脂，并基于此提供一种降低花生四烯酸油脂中氯丙醇含量的方法，具体方法与实施例1的方法的区别仅在于：发酵末期的补糖和控糖工艺不同，具体如下：

发酵末期：发酵至170h开始，按照0.05m

实验例花生四烯酸油脂的后处理和氯丙醇含量检测

对上述各实施例和对比例生产的花生四烯酸油脂进行后处理，具体方法如下：

ARA毛油：在发酵结束后，通过板框过滤分离发酵液，得到高山被孢霉菌体(滤饼，即湿菌体)，然后将菌体通过粉碎机粉碎；使用沸腾干燥塔对湿菌体进行干燥，得到干菌体，采用正己烷对干菌体进行萃取，得到花生四烯酸(ARA)毛油。

精炼工艺：采用专利申请CN114574282A对比例1中记载的精炼工艺对ARA毛油进行精炼，经脱溶、脱胶、碱炼、脱色、脱臭工艺得到ARA精炼油脂，该工艺为本领域中最为常规的精炼工艺。

采用国标GB26400-2001方法检测花生四烯酸油脂中ARA的含量和甘油三酯(TGA)的含量。

采用AOCS标准方法检测精炼油脂中氯丙醇和甘油三酯的含量，随着检测领域方法和仪器的进步，目前采用GC-MS-MS对3-氯丙醇的检出限明显低于之前使用的GC-MS方法(检出限为0.1-1ppm)，本发明采用GC-MS-MS对3-氯丙醇进行检测。

各实施例和对比例生产的花生四烯酸油脂及其精炼油脂的检测结果分别如表1和表2所示。

表1精炼前花生四烯酸油脂的指标检测

表2精炼花生四烯酸油脂的指标检测

以上结果表明，采用实施例1-4的方法进行发酵，ARA的产量、ARA的含量以及甘油三酯的含量均能达到较高水平，而且，精炼油中3-MCPD的含量可控制在0.1ppm以下。而发酵末期停止补糖，使得发酵液中糖含量降至0(对比例1)，或者发酵末期的糖含量控制过低(对比例3)，会导致精炼油中3-MCPD的含量明显增加，而发酵末期采用高糖含量控制(对比例2)，则同样会导致精炼油中3-MCPD的含量明显增加，而且，高糖控制并未使得油脂产量和ARA含量进一步提升，还会带来发酵生产成本的增加；发酵过程中提前降低糖含量控制，则会导致ARA的产量明显下降(实施例5)。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。