产蛋白酶酵母在西兰花发酵饲料中的应用

技术领域

本发明涉及西兰花提取物技术领域，具体涉及一种产蛋白酶酵母在西兰花发酵饲料中的应用。

背景技术

随着目前畜牧业集约化、规模化的发展，我国猪群普遍存在着免疫抗病能力差、发病率高和死亡率高等问题。究其原因一是饲料管理不科学、环境恶劣、长途运输、转舍等造成的应激使动物抗病免疫力下降，二是传染病多发，特别是免疫抑制性疾病，三是，滥用化学药品防治疾病，不仅造成药物残留，引发食品安全问题，还能造成机体慢性中毒，免疫组织器官受到损害，四是滥用抗生素和抗病毒药，造成细菌耐药，五是霉菌毒素中毒，引起组织器官肝肾特别是免疫器官的损害，导致动物抗病能力下降，引发疾病多发。

西兰花(Brassica oleracea L.var.botrytis L)又名青花菜，为十字花科芸薹属一二年生植物，被誉为“蔬菜皇冠”，内含丰富的生物活性物质，其中包括萝卜硫素、多糖等抗肿瘤活性物质和多酚、黄酮等多种抗氧化活性物质，且蛋白和氨基酸含量也较高，具有非常高的食用和药用保健价值。

国外已有研究证明从西兰花中提取的许多物质具有提高免疫力的功能。许多多肽因为具有强化人体免疫的功能而成为疗效显著的临床药物，如胰岛素、生长激素、释放抑制素Somatostatin、脑活素多肽疫苗等，起到了过去的药品对付现代病毒所取不到的功能。

增强免疫力已成为当今养殖业日益重视的一个问题，但有关将西兰花多肽分离增强畜牧动物的免疫力方面的研究还很少有文献报道。而对于猪马牛羊等常见的畜牧动物来说，能够稳定的提高养殖水平和更优质的饲料成为目前的重中之重。

然而在西兰花发酵过程中，需要保持其发酵环境的稳定，普通的碱性蛋白酶在发酵过程中会使其发酵环境中的pH值下降，直至其无法在脱离管控的情况下长时间发酵，因此在发酵过程中需要稳定其内环境的pH值，而每次发酵的发酵进度难以严格把控，需要工作人员多次进行检测调节，这使该饲料的质量难以统一化标准化，不利于行业的发展。

发明内容

基于此，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及二者的应用，用于治疗或预防猪的急性或慢性胃溃疡，有效减少了溃疡的发生概率和恶化程度。

本发明提供了一种产蛋白酶酵母在西兰花发酵饲料中的应用，采用产蛋白酶酵母用于西兰花发酵饲料中对西兰花蛋白进行发酵分解，使所述西兰花蛋白在碱性-酸性环境种分解为西兰花多肽；

其中，所述产蛋白酶酵母包括扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1，所述扣囊复膜酵母菌Ytj-2的分类命名为扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)Ytj-2，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221570，保藏日期为2022年10月14日；

所述酿酒酵母99-1的分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)99-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20231104，保藏日期为2023年6月27日；

所述西兰花多肽包括4种长度的多肽片段。

进一步的，所述碱性-酸性环境包括在发酵分解过程中pH值由8.1降低至3.1的环境。

进一步的，还包括：

通过对西兰花新鲜茎叶进行预处理，得到西兰花茎叶汁；

以所述西兰花茎叶汁为原料，按料液质量比1：15～30加入蒸馏水，在温度25～35℃、初始pH值在7.5～8.25条件下，加入所述产蛋白酶酵母，以1％的接菌量，在振荡或搅拌的条件下，酶解10-22h后，灭酶；

冷却，并经离心，旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，得到西兰花多肽提取物。

进一步的，所述预处理包括：西兰花茎、叶，用青饲料粉碎机粉碎成1-2cm长的碎屑，用打浆机打浆，经螺旋压榨机压榨，过滤，收集榨取的汁液即为西兰花茎叶汁。

进一步的，还包括在所述西兰花茎叶汁中加入氮源，用于所述产蛋白酶酵母的生长。

进一步的，所述氮源包括蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素和氯化铵中的一种或多种，所述氮源的添加量为10～15g/L。

从上述技术方案可以看出，本发明提供的枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌发酵物及二者的应用具有以下有益效果：

本发明通过提供一种通过采用两种产蛋白酶酵母在西兰花中发酵的方式，能够稳定的获得充分含有西兰花多肽的西兰花发酵饲料，使该饲料能够有效用于畜牧动物，增强其免疫力，并且使其能够在环境变化的时候持续进行发酵，且能够稳定的得到多种西兰花多肽，进一步能够能够稳定该饲料的质量，进一步促进了行业的发展。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。

随着目前畜牧业集约化、规模化的发展，我国猪群普遍存在着免疫抗病能力差、发病率高和死亡率高等问题。究其原因是饲料管理不科学、环境恶劣、长途运输、转舍等造成的应激使动物抗病免疫力下降，以及传染病多发、滥用化学药品防治疾病以及霉菌毒素中毒等原因，引起组织器官肝肾特别是免疫器官的损害，导致动物抗病能力下降，引发疾病。

尤其是幼年期的动物，消化系统神经系统和免疫系统发育不完全，不能很好的消化营养物质，导致疾病多发，尤其是腹泻等消化道疾病多发。因此需要一种方法来从饲料饮食等方面提高动物的免疫抗病能力，提高畜牧动物的饲养水平。

目前许多研究证明了大豆中提取的多肽对小鼠免疫功能的影响，其结果表明该多肽能显著增加小鼠免疫器官的重量，增强机体非特异性免疫功能，还有些证据表明大豆多肽可以防治肿瘤，对肿瘤的生长有一定的抑制作用。

而对于西兰花多肽来说，目前也有研究表明西兰花中提取的许多物质具有提高免疫力的功能。许多多肽因为具有强化人体免疫的功能而成为疗效显著的临床药物，如胰岛素、生长激素、释放抑制素Somatostatin、脑活素多肽疫苗等，起到了过去的药品对付现代病毒所取不到的功能。

然而在西兰花发酵过程中，需要保持其发酵环境的稳定，普通的碱性蛋白酶在发酵过程中会使其发酵环境中的pH值下降，直至其无法在脱离管控的情况下长时间发酵，因此在发酵过程中需要稳定其内环境的pH值，而每次发酵的发酵进度难以严格把控，需要工作人员多次进行检测调节，这使该饲料的质量难以统一化标准化，不利于行业的发展。

因此，需要提供一种能够增强动物免疫力的饲料以及稳定的生产饲料方法，从而稳定的提高畜牧动物的免疫力和抗病性。

基于此，根据上述情况，本发明提供了一种产蛋白酶酵母在西兰花发酵饲料中的应用，采用产蛋白酶酵母用于西兰花发酵饲料中对西兰花蛋白进行发酵分解，使西兰花蛋白在碱性-酸性环境种分解为西兰花多肽；

其中，产蛋白酶酵母包括扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1，扣囊复膜酵母菌Ytj-2的分类命名为扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)Ytj-2，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 20221570；

酿酒酵母99-1的分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)99-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20231104；

西兰花多肽包括4种长度的多肽片段。

本发明通过提供一种通过采用两种产蛋白酶酵母在西兰花中发酵的方式，能够稳定的获得充分含有西兰花多肽的西兰花发酵饲料，使该饲料能够有效用于畜牧动物，增强其免疫力，并且使其能够在环境变化的时候持续进行发酵，且能够稳定的得到多种西兰花多肽，进一步能够能够稳定该饲料的质量，进一步促进了行业的发展。

进一步的，碱性-酸性环境包括在发酵分解过程中pH值由8.1降低至3.1的环境。

根据本发明的实施例，产蛋白酶酵母发酵分解西兰花蛋白的过程中，产蛋白酶酵母通过分泌出碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶酶解西兰花蛋白，得到西兰花多肽。

通过扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1产生的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，使西兰花蛋白能够在环境中稳定的分解，在不同的发酵阶段能够对西兰花蛋白的不同位点进行切割，进一步获得多种肽链的西兰花多肽。

进一步的，还包括：

通过对西兰花新鲜茎叶进行预处理，得到西兰花茎叶汁；

以西兰花茎叶汁为原料，按料液质量比1：15～30加入蒸馏水，在温度25～35℃、初始pH值在7.5～8.25条件下，加入产蛋白酶酵母，以1％的接菌量，在振荡或搅拌的条件下，酶解10-22h后，灭酶；

冷却，并经离心，旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，得到西兰花多肽提取物。

根据本发明的实施例，料液质量比可以为1：15、1：20、1：25、1：30等。

根据本发明的实施例，发酵温度可以为25℃、28℃、30℃、32℃或35℃等。

根据本发明的实施例，初始pH值可以为7.5、7.7、8、8.1或8.25等。

根据本发明的实施例，酶解时间可以为10h、12h、15h、18h、20h、22h等。

根据本发明的实施例，预处理包括：西兰花茎、叶，用青饲料粉碎机粉碎成1-2cm长的碎屑，用打浆机打浆，经螺旋压榨机压榨，过滤，收集榨取的汁液即为西兰花茎叶汁。

西兰花茎叶汁中包含多种用于产蛋白酶酵母生长的元素，例如糖类和无机盐，其中含有丰富的葡萄糖和可溶性淀粉，以及丰富的钙，镁，锌，铜等无机盐，能够有效促进产蛋白酶酵母的生长繁殖。

根据本发明的实施例，还包括在西兰花茎叶汁中加入氮源，用于产蛋白酶酵母的生长。

根据本发明的实施例，氮源包括蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素和氯化铵中的一种或多种，氮源的添加量为10～15g/L。

根据本发明的实施例，在发酵初期，产蛋白酶酵母在生长过程中，需要氮源的补充，而在发酵的初期，产蛋白酶酵母对西兰花蛋白的分解效率降低，而在发酵初期人工补充氮源则能使产蛋白酶酵母迅速生长繁殖，从而进一步的提高发酵物内的产蛋白酶酵母水平，从而提高其发酵速率。

以下通过较佳实施例来对本发明的技术方案作详细说明，需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。

实施例1：产蛋白酶酵母的表征。

(1)两种菌株的蛋白酶活力和蛋白积累效率

将扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1利用现代高通量微生物培养技术(微孔板培养)，利用18S rDNA技术对该菌株进行测序，并通过NCBI进行对比鉴定，获得两株菌蛋白酶活力和蛋白积累效率。其结果见表1。

表1.两种菌株的蛋白酶活力和蛋白积累效率

通过上述表中结果可知，扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1能够产生的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，使其能够应用于pH值变化的环境中，且具有很好的蛋白酶活力和蛋白积累效率，将其用于西兰花蛋白的发酵过程中能够获得多种肽链的西兰花多肽。

(2)不同pH值对两种菌株的生长的影响

将培养基初始pH调制3.1、4.1、5.1、6.1、7.1、8.1和9.1，研究不同初始pH对扣囊复膜酵母菌Ytj-2和酿酒酵母99-1生长的影响。结果见表2所示。

表2.不同pH对两种菌株的生长的影响

由表2可知，结果发现培养基初pH为在3-8.1之间时对菌株MQ-5和Ytj-2生长无明显影响，OD

(3)采用西兰花茎叶汁对两种菌株的发酵的影响

利用西兰花茎叶汁进行了10mL三角瓶小试验和5L发酵罐中进行试验，接种两种菌株，验证采用西兰花茎叶汁发酵的可行性，其结果见表3。

表3.验证试验结果

验证实验结果表明，在上述获得的最佳工艺条件下，酵母菌生长OD

实施例2：探究产蛋白酶酵母发酵对西兰花多肽种类的影响。

以西兰花茎叶汁为原料，按料液质量比1：15加入蒸馏水，在温度30℃、初始pH值在8条件下，加入产蛋白酶酵母，在10mL三角瓶中进行发酵，以1％的接菌量，在振荡或搅拌的条件下，酶解22h后，灭酶；冷却，并经离心，旋转蒸发，浓缩后冷冻干燥，得到西兰花多肽提取物，将其作为实验组样品。

将市售的碱性蛋白酶(购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)0.1g、中性蛋白酶(购自山东龙元生物工程有限公司)0.1g或酸性蛋白酶0.1g(购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司)按照上述方法进行发酵，并将其pH值分别调整为8、7和4，发酵22h后，测定其西兰花多肽含量，将其分别作为对照组1-3组样品。

将以上三种蛋白酶进行复配，按照上述方法进行发酵，并将初始pH值在8条件下，测定其西兰花多肽含量，将其分别作为对照组4组样品,测定其是否能够产生本发明中的四种西兰花多肽，结果如表4所示。

表4.两种菌株的蛋白酶活力和蛋白积累效率

通过表4可知，通过本发明提供的方法能够有效的获得4中西兰花蛋白，且通过表4中蛋白含量可知，通过采用产蛋白酶酵母发酵得到的三种能够适应不同pH值的蛋白酶具有复配作用，使其具有更好的蛋白分解效率,而对照组4中，将三种蛋白酶进行人工复配难以得到西兰花多肽B，并且由于蛋白酶之间识别切割位点的不同，且在一定程度上相互影响，在复配后，反而无法得到西兰花多肽C。

实施例3：探究产蛋白酶酵母发酵得到的发酵产物对小鼠淋巴细胞的增殖能力的影响

采用实施例2中得到的4种发酵产物对动物连续灌胃一个月，末次灌胃1h后，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1mL RPMI1640完全培养液中，用培养液调整细胞浓度为3×106个/mL，将细胞悬液分别加入24孔板的2孔中，每孔1mL，实验孔加75μLConA液(终浓度7.5μL/mL)，另一孔作为对照，置37℃，5％CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h,每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入酸性异丙醇(96ml异丙醇+4ml 1M HCl)，吹打混匀，570nm波长下用酶标仪测定光吸收度。用加Con A孔的OD值减去不加Con A孔的OD值表示淋巴细胞的增殖能力，其结果如表5所示。

表5.小鼠淋巴细胞的增殖能力

通过表5中结果所示，本发明通过提供的通过采用两种产蛋白酶酵母在西兰花中发酵的方式，能够稳定的获得充分含有西兰花多肽的西兰花发酵饲料，使该饲料能够有效用于畜牧动物，增强其免疫力。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。