一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法。

背景技术

液相色谱质谱已经成为食品蛋白质定量分析的最先进的工具，是一种新型的蛋白组学检测技术，基于基因组学与靶向蛋白组学的研究思路，实现目标蛋白质组中多种蛋白的准确定量。蛋白组学质谱技术简单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。它的基本原理是蛋白质经过特定的蛋白酶酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(即质荷比，M/Z)的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的质核比。

目前，食品中蛋白质定量肽段的筛选主要通过高分辨质谱结合蛋白组学软件，对人员、硬件以及软件都提出了较高的要求，一些中、小型食品企业不具备高分辨质谱以及蛋白组学软件，此外，一些蛋白组学软件并不是包含所有的蛋白肽段信息，将无法实现所有肽段的筛选，具有一定的局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种操作简便、成本较低且易推广的蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法。

本发明提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：

S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；

S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；

将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；

S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。

优选的，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；

利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性选择与待测蛋白质样品理论酶解肽段100％匹配的1～5个物种特性的肽段，得到候选肽段。

优选的，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟胰蛋白酶酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；所述待测蛋白质样品理论酶解肽段包括7～20个氨基酸。

优选的，所述步S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的分子量在200～2000所有的b、y离子碎片。

优选的，所述步骤S2)中待测蛋白质样品采用胰蛋白酶进行酶解；酶解的时间为1～6h。

优选的，所述步骤S2)中酶解液先经液相色谱分离，然后利用低分辨质谱进行分析；

所述液相色谱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；所述液相色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为0.05～0.2wt％酸性水溶液；所述流动相B为0.05～0.2wt％酸性有机溶液；以体积百分数计，所述液相色谱的洗脱程序为：0～1min，95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B。

优选的，所述步骤S2)中利用低分辨质谱进行分析具体为：

将酶解液通过低分辨质谱母离子扫描模式、子离子扫描模式与二级质谱全扫描模式进行分析，得到二级指纹谱图。

优选的，所述母离子扫描模式筛选的母离子带2～4个电荷；所述母离子的质荷比为500～2000。

优选的，所述低分辨质谱的离子源模式为ESI，正离子模式；毛细管电压为3～4kV；离子源温度为140℃～180℃；脱溶剂温度为500℃～700℃；脱溶剂气流量为800～1200L/Hr；碰撞室气流量为0.1～0.25mL/min。

优选的，还包括S4)：将待测蛋白质样品与加标物混合后得到加标样，分别测量加标样酶解生成的候选特征肽段的回收率和精密度，对特征肽段性能进行确证和/或定量检测。

本发明还提供了一种上述筛选方法筛选得到的特征肽段在蛋白质定性检测和/或定量检测中的应用。

本发明提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)利用理论预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。与现有技术相比，本发明仅通过低分辨质谱即可满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段，可为复杂食品基质中蛋白质定量提供特征肽段，满足液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性好的蛋白质定量检测，且操作简单、成本低、易推广。

附图说明

图1为本发明实施例1中使用ExPASy peptide cutter工具模拟蛋白质的胰蛋白酶解过程预测酶解肽段的具体检索结果图；

图2为本发明实施例1中得到的“GDSVAYGLK”二级碎片信息图；

图3为本发明实施例中骨桥蛋白特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图；

图4为本发明实施例1中骨桥蛋白同位素内标特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)利用理论预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

在本发明中，首选模拟预测待测蛋白质样品理论酶解肽段，优选使用ExPASypeptide cutter工具(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)模拟酶切待测蛋白质样品，更优选使用ExPASy peptide cutter工具(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)模拟胰蛋白酶酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；胰蛋白酶(Trypsin)的酶切位点为精氨酸(K)与赖氨酸(R)的羧基端，酶切效率接近100％，而连接脯氨酸的羧基除外；所述待测蛋白质样品理论酶解肽段优选避免出现甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、色氨酸(W)等不稳定、易氧化肽段；所述待测蛋白质样品优选包含乳球蛋白、骨桥蛋白、酪蛋白、白蛋白与球蛋白中的一种或多种；所述乳球蛋白进一步优选为β-乳球蛋白；所述酪蛋白进一步优选为αs1-酪蛋白和/或β-酪蛋白；所述白蛋白进一步优选为卵白蛋白；所述待测蛋白质样品理论酶解肽段优选含有7～20个氨基酸，更优选含有9～13个氨基酸。

利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；在全蛋白质组学数据库中搜索，与目标肽段100％匹配的干扰肽段数据越多，则说明肽段的特异性越弱，在本发明中，优选选择与待测蛋白质样品理论酶解肽段100％匹配的1～5个物种特性的肽段，更优选选择与待测蛋白质样品理论酶解肽段100％匹配的1～3个物种特性的肽段，得到候选肽段。

利用理论预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；肽键(C-N)断裂后生成b，y离子，含有C-端为b离子，含有-N端为y离子。蛋白质肽键断裂得到肽段的性质较稳定，适合定量分析；优选的，预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的分子量在200～2000所有的b、y离子碎片。在此步骤中特征肽段的b、y离子碎片即为低分辨质谱的二级离子碎片，所有的二级离子形成的谱图即为二级指纹谱图。

将待测蛋白质样品酶解；在本发明中优选采用胰蛋白酶Trypsin进行酶解；进一步优选的，本发明采用的胰蛋白酶为基因工程技术制备的测序级碱性胰蛋白酶，特异性极强，只作用于精氨酸和赖氨酸的C段，错切率为零；所述酶解的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤进行：将待测蛋白质样品与超纯水混合后，加入碳酸氢钠与二硫苏糖醇混合后加热反应；加热反应后冷却至室温加入碘代乙酰胺避光静置后，加入碱性胰蛋白酶进行酶解。所述加热反应的温度优选为60℃～70℃；所述加热反应的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，再优选为30min；所述避光静置的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，再优选为30min；通过加入碘代乙酰胺可以保证蛋白质样品完全变性并保持还原状态；所述待测蛋白质样品与碱性胰蛋白酶的质量比优选为(50～150)：1；所述酶解的温度优选为37℃；所述酶解的时间优选为1～6h；目标肽段在6小时内需要酶解完全，不能酶解的肽段说明酶解效率过低不适合作做定量特征肽段；进一步优选的，所述酶解的时间为2～4h；时间过短蛋白质酶解不完全，时间过长会导致胰蛋白酶Trypsin自身内切，酶解活性下降。酶解完成后，优选冷却至室温，加入甲酸使蛋白酶失活终止酶解反应，加入超纯水定容至适合质谱的浓度，过膜，得到酶解液。

在本发明中优选所述酶解液先经液相色谱分离；所述液相色谱优选以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，在本发明提供的实施例中具体以BEH 300 C18色谱柱为固定相；所述固定相的温度优选为25℃～35℃，更优选为30℃；所述液相色谱的流动相优选包括流动相A与流动相B；所述流动相A优选为0.05～0.2wt％酸性水溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性水溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性水溶液；所述酸性水溶液中的酸优选为甲酸；所述流动相B优选为0.05～0.2wt％酸性有机溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性有机溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性有机溶液；所述酸性有机溶液中的酸优选为甲酸；所述酸性有机溶液中的有机溶剂优选为乙腈；以体积百分数计，所述液相色谱的洗脱程序为：0～1min，保持95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B即流动相B的体积百分数由5％升至40％；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B；所述流动相的流速优选为0.1～0.5mL/min，更优选为0.2～0.4mL/min，再优选为0.3mL/min；进样体积优选为1～10μL，更优选为2～8μL，再优选为2～5μL。

然后利用低分辨质谱进行分析；优选对酶解液中的候选肽段进行分析；所述低分辨质谱优选为低分辨电喷雾三重四极杆质谱；所述低分辨质谱的离子源模式优选为ESI，正离子模式；毛细管电压优选为3～4kV，更优选为3.2～3.8kV，再优选为3.4～3.6kV，最优选为3.5kV；离子源温度优选为140℃～180℃，更优选为140℃～170℃，再优选为140℃～160℃，最优选为150℃；脱溶剂温度优选为500℃～700℃，更优选为550℃～650℃，再优选为600℃；脱溶剂气流量优选为800～1200L/Hr，更优选为900～1100L/Hr，再优选为1000L/Hr；碰撞室气流量优选为0.1～0.25mL/min，更优选为0.14～0.22mL/min，再优选为0.16～0.2mL/min，最优选为0.18mL/min。在本发明中，优选通过低分辨质谱母离子扫描模式、子离子扫描模式与二级质谱全扫描模式进行分析，得到二级指纹谱图；在本发明中，采用母离子扫描模式优选筛选候选肽段的母离子；所述母离子优选带2～4个电荷；母离子的质荷比优选为500～2000，更优选为800～1800；在本发明中，优选筛选每种候选肽段1～3个母离子；然后对筛选得到的母离子采用子离子扫描模式进行扫描，在本发明中，可通过优化质谱裂解能量，得到响应较强的碎片信息，然后采用二级质谱全扫描方式进行，得到全部的二级碎片信息，即二级指纹谱图；在本发明中，若在一个裂解能量下无法得到全部的碎片信息，可设置多个能量，分别得到全部的二级碎片信息。

将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段；在本发明中，优选选择酶解效率高、质谱响应高，且符合b、y离子碎片个数在5个以上的候选肽段为特征肽段。

本发明仅通过低分辨质谱即可满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段，可为复杂食品基质中蛋白质定量提供特征肽段，满足液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性好的蛋白质定量检测，且操作简单、成本低、易推广。

在本发明中，还包括S4A)：将酶解液利用高分辨质谱进行分析，得到高分辨质谱二级指纹图谱；将所述高分辨质谱二级指纹图谱与b、y离子碎片进行比对，对特征肽段进行确证。

在本发明中优选所述酶解液先经液相色谱分离然后再利用高分辨质谱进行分析；所述液相色谱优选以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，在本发明提供的实施例中具体以BEH 300 C18色谱柱为固定相；所述液相色谱的流动相优选包括流动相A与流动相B；所述流动相A优选为0.05～0.2wt％酸性水溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性水溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性水溶液；所述酸性水溶液中的酸优选为甲酸；所述流动相B优选为0.05～0.2wt％酸性有机溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性有机溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性有机溶液；所述酸性有机溶液中的酸优选为甲酸；所述酸性有机溶液中的有机溶剂优选为乙腈；所述液相色谱的洗脱程序为0～1min，保持95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B即流动相B的体积百分数由5％升至40％；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B7～9min，100％流动相B～5％流动相B。所述流动相的流速优选为0.1～0.5mL/min，更优选为0.2～0.4mL/min，再优选为0.3mL/min；进样体积优选为1～10μL，更优选为3～8μL，再优选为5μL；所述高分辨质谱优选为四极杆飞行时间高分辨质谱，更优选为uplc/Q-TOF四级杆飞行时间高分辨质谱；所述高分辨质谱的离子源模式优选为ESI，正离子模式；毛细管电压优选为3～4kV，更优选为3.2～3.8kV，再优选为3.4～3.6kV，最优选为3.5kV；离子源温度优选为140℃～180℃，更优选为140℃～170℃，再优选为140℃～160℃，最优选为150℃；脱溶剂温度优选为500℃～700℃，更优选为550℃～650℃，再优选为600℃；脱溶剂气流量优选为800～1200L/Hr，更优选为900～1100L/Hr，再优选为1000L/Hr；碰撞室气流量优选为0.1～0.25mL/min，更优选为0.14～0.22mL/min，再优选为0.18～0.2mL/min，最优选为0.2mL/min；所述高分辨质谱的数据采集模式优选为全扫描，更优选为高分辨全扫描数据依赖的二级离子扫描模式；所述高分辨质谱的扫描范围优选为200～2000m/z。

按照本发明，还包括S4)：将待测蛋白质样品与加标物混合后得到加标样，分别测量加标样酶解生成的候选特征肽段的回收率和精密度，对特征肽段性能进行确证和/或定量检测。

在本发明中，所述加标物优选为蛋白质标准品；优选的，所述加标物采用≥3个浓度水平。实际操作中，可根据食品中待测蛋白质含量水平的不同，确认不同的加标水平。加标实验重复3次，每次设置6个平行。

本发明采用三天三水平六平行的加标实验，检测候选特征肽段的回收率与精密度，用于评价肽段的准确性和稳定性，保证筛选的定量特征肽段具有可准确定量的性质。

具体地，已加标样中测得候选特征肽段的响应值与对应同位素内标肽段的比值作为加样检测值，以不含加标物的待测蛋白质样品中测得候选特征肽段的响应值与对应同位素内标肽段的比值作为本地值，再根据公式回收率＝(检测值-本底值)/加标量×100％，计算加标回收率。

所述精密度用相对标准偏差(RSD)来表示。

选择回收率和精密度符合ISO/IEC 17025:25标准的候选特征肽段作为待测蛋白质的定量特征肽段。

在本发明中，优选利用高效液相色谱串联质谱进行肽段含量的测定。具体包括：蛋白标准曲线的制作，不同浓度蛋白测试液的制作，高效液相色谱串联质谱数据采集。

所述高效液相色谱优选以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，在本发明提供的实施例中具体以BEH 300C18色谱柱为固定相；所述固定相的温度优选为25℃～35℃，更优选为30℃；所述高效液相色谱的流动相优选包括流动相A与流动相B；所述流动相A优选为0.05～0.2wt％酸性水溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性水溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性水溶液；所述酸性水溶液中的酸优选为甲酸；所述流动相B优选为0.05～0.2wt％酸性有机溶液，更优选为0.08～0.15wt％酸性有机溶液，再优选为0.1～0.12wt％的酸性有机溶液；所述酸性有机溶液中的酸优选为甲酸；所述酸性有机溶液中的有机溶剂优选为乙腈；所述高效液相色谱的洗脱程序为：0～1min，保持95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B即流动相B的体积百分数由5％升至40％；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B。所述流动相的流速优选为0.1～0.5mL/min，更优选为0.2～0.4mL/min，再优选为0.3mL/min；进样体积优选为1～10μL，更优选为2～8μL，再优选为2～5μL。所述高效液相色谱串联质谱中的质谱优选为三重四极杆质谱；所述质谱的离子源模式优选为ESI，正离子模式；毛细管电压优选为3～4kV，更优选为3.2～3.8kV，再优选为3.4～3.6kV，最优选为3.5kV；离子源温度优选为140℃～180℃，更优选为140℃～170℃，再优选为140℃～160℃，最优选为150℃；脱溶剂温度优选为400℃～600℃，更优选为450℃～550℃，再优选为500℃；脱溶剂气流量优选为800～1200L/Hr，更优选为800～1100L/Hr，再优选为800～1000L/Hr，最优选为800～900L/Hr；碰撞室气流量优选为0.1～0.25mL/min，更优选为0.14～0.22mL/min，再优选为0.18～0.2mL/min，最优选为0.18mL/min；所述质谱的扫描模式优选多反应监测模式(MRM)。

通过本发明方法筛选到的特征肽段经方法学验证之后，证明可用于食品中蛋白质的定量检测及其检测试剂盒的研发。

本发明还提供了一种上述筛选方法筛选得到的特征肽段在蛋白质定性检测和/或定量检测中的应用。

本发明还提供了一种蛋白质检测试剂盒，包括上述筛选方法筛选得到的特征肽段。

本发明提供的方法可以满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，通过综合评价筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段；可为复杂食品基质中蛋白质定量提供特征肽段，可满足液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性好的蛋白质定量检测。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1：牛乳基婴幼儿奶粉中骨桥蛋白的定量特征肽段的筛选方法。

1.1使用ExPASy peptide cutter工具(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)模拟蛋白质的胰蛋白酶解过程预测酶解肽段，选择特征肽段含有7～20个氨基酸为候选肽段，具体检索结果如图1所示。

根据ExPASy peptide cutter工具模拟蛋白质的胰蛋白酶解以及特征肽段的筛选基本原则最终选择8条特征肽段，分别为：YPDAVATWLKPDPSQK、QNTLPSK、GDSVAYGLK、QTFLAPQNSVSSEETDDNK、TSQLTDHSK、ETNSSELSK、HSNLIESQENSK、LSQEFHSLEDK；

优选的特征肽段为6个：QNTLPSK、GDSVAYGLK、TSQLTDHSK、ETNSSELSK、HSNLIESQENSK、LSQEFHSLEDK；

1.2采用蛋白组学中的BLAST检验(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析确定每条蛋白质理论酶解肽段的专属性和特异性。在全蛋白质组学数据库中搜索，与目标肽段100％匹配的干扰肽段数目越多，则说明肽段的特异性越弱，优选与目标肽段100％匹配的1～3个物种特性的肽段为候选肽段。

仅存在牛属骨桥蛋白的酶解肽段分别为：HSNLIESQENSK；

仅存在牛属和羊属骨桥蛋白的酶解肽段分别为：QNTLPSK、LSQEFHSLEDK、GDSVAYGLK、TSQLTDHSK；

仅存在牛属和人类骨桥蛋白的酶解肽段分别为：ETNSSELSK；

优选的候选理论肽段6个，分别为：QNTLPSK、GDSVAYGLK、TSQLTDHSK、ETNSSELSK、HSNLIESQENSK、LSQEFHSLEDK。

1.3通过低分辨电喷雾三重四级杆质谱“母离子扫描模式”、“子离子扫描模式”、“二级指纹技术”三种扫描模式筛选肽键断裂符合b,y裂解规则候选肽段；

首先，量取试样约0.2g于15mL塑料离心管中，加入超纯水定容到10mL，置于涡旋混合器上充分涡旋混匀。准确移取上述样液500μL置于2mL塑料离心管中。加入0.42mL碳酸氢钠溶液(100mmol/L)涡旋混匀后，再加入40μL二硫苏糖醇溶液(品牌：Adamas；纯度：99％；等级：RG；规格：5g/瓶；)(90mmol/L)，混匀后于70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入40μL碘代乙酰胺溶液(品牌：Sigma-Aldrich；纯度：99％；等级：RG；规格：5g/瓶，(200mmol/L)，避光静置30min；取50μL溶液转移到另外1个1.5mL塑料离心管中，加入150μL碳酸氢钠溶液和100μL碱性胰蛋白酶(厂家：上海雅心，测序级，1mg/瓶)(100μg/mL)，混匀，于37℃恒温酶解4h以上，取出冷却至室温，加入10μL纯甲酸，室温反应30min后，加入200μL超纯水定容到0.5mL，过膜，得到候选特征肽段混合液，待测定。

首先，对测试混合液单独进入质谱，选择正离子模式进行全扫描，分别对步骤(2)得到的QNTLPSK、GDSVAYGLK、TSQLTDHSK、ETNSSELSK、HSNLIESQENSK、LSQEFHSLEDK 6个候选肽段计算带不同电荷的母离子，优选带2～4个电荷，质荷比在500～2000之间，筛选不同候选肽段的1～3个母离子，然后对筛选的全部母离子进行子离扫描，优化质谱裂解能量，得到响应较强的碎片信息，然后采用二级质谱全扫描模式，得到全部的碎片离子，若在一个裂解能量下无法得到全部的碎片信息，可以设置多个能量，分别得到全部的二级碎片信息。比对每个候选肽段二级指纹谱图，筛选肽键断裂符合b,y裂解(肽键断裂)规则肽段(蛋白质肽键断裂得到肽段的性质较稳定，适合定量分析)。最后，筛选酶解效率高、质谱响应高，符合b,y裂解碎片个数在5个以上肽段为候选肽段，对每个候选肽段响应较强的两个碎片离子作为子离子，建立低分辨三重四级杆质谱的质谱方法，其中只有“GDSVAYGLK”二级碎片信息符合b,y裂解规则，且碎片个数在5个以上，该肽段为候选肽段，见图2。对以上的测试液经过色谱柱等液相系统进入质谱，优化色谱条件，测试每个候选肽段的色谱行为，对于不保留或者强保留无法得到较好的色谱峰或者响应低的肽段舍去。优化的质谱方法：①液相色谱条件：色谱柱：BEH 300C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱程序：：0～1min，95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B；进样体积：2μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。②三重四极杆质谱条件：离子源模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；源温：150℃；脱溶剂温度：600℃；脱溶剂气流量：1000L/Hr；碰撞室气流量：0.18mL/min；

1.4高分辨电喷雾三重四级杆质谱得到特征肽段裂解碎片信息，至少验证丰度较高的3个以上碎片信息，该碎片的信息需要与理论的特征肽段裂解碎片分子式完全一致，同时满足mDa<1.0和PPM<5.0；

采用uplc/Q-TOF四级杆飞行时间高分辨质谱仪对UPLC-MS/MS液相色谱质谱联用仪筛选的特征肽段进行二次采集确证：①液相色谱条件：色谱柱：BEH 300 C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱程序：：0～1min，95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B；进样体积：5μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。②三重四极杆质谱条件：离子源模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；源温：150℃；脱溶剂温度：600℃；脱溶剂气流量：1000L/Hr；碰撞室气流量：0.2mL/min；数据采集模式：高分辨全扫描数据依赖的二级离子扫描模式(质谱扫描范围为200～2000m/z)。

高分辨质谱对候选肽段进行全扫描得到二级指纹谱图信息，对“GDSVAYGLK”肽段进行验证，选择丰度较高的317、418、551三个碎片信息通过高分辨质谱仪器的基础数据库进行解析，仪器得到的碎片信息与预测的肽键断链的b，y裂解碎片的信息完全匹配。

1.5肽段定量的准确性与稳定性评价：针对上述优选的候选肽段，建立同位素稀释的高效液相色谱串联质谱法实现肽段的准确定量，并采用三天三水平六平行加标实验，检测肽段在基质中的回收率与精密度，评价肽段的准确性与稳定性。

首先进行高效液相色谱串联质谱法的建立。方法包括蛋白标准曲线的制作，不同浓度蛋白质测试液的制作、高效液相色谱串联质谱数据采集。

样品检测液的制备：(1)量取试样约0.2g于15mL塑料离心管中，加入超纯水定容到10mL，置于涡旋混合器上充分涡旋混匀，取4个2mL离心管分别加入100μL稀释后的液体，用于制作本底样、低水平加标样、中水平加标样和高水平加标样。(2)低水平加标：在低水平加标样中加入5μL蛋白质标准溶液(10mg/mL)，混匀后备用；(3)中水平加标：在中水平加标样中加入10μL蛋白质标准溶液(10mg/mL)，混匀后备用；(4)高水平加标：在高水平加标样中加入50μL蛋白质标准溶液(10mg/mL)，混匀后备用。

蛋白质的酶解：在本底样、低水平加标样、中水平加标样和高水平加标样分别加入0.42mL碳酸氢钠溶液(100mmol/L)涡旋混匀后，再加入40μLDTT溶液(90mmol/L)，混匀后于70℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入40μL IAA溶液(200mmol/L)，避光静置30min；取50μL溶液转移到另外1个1.5mL塑料离心管中，加入150μL碳酸氢钠溶液和100μL碱性胰蛋白酶(10μg/mL)，混匀，于37℃恒温酶解2h以上，取出冷却至室温，加入10μL纯甲酸，室温反应30min后，加入一定体积的同位素肽段内标物，再用超纯水定容到0.5mL，过膜，待测定。

液相色谱参考条件：色谱柱：BEH 300 C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱程序：：0～1min，95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B；进样体积：2μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。低分辨三重四极杆质谱条件：离子源模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；源温：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/Hr；碰撞室气流量：0.18mL/min；扫描模式：MRM，肽段质谱条件，见表1；得到骨桥蛋白特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图如图3所示；得到骨桥蛋白同位素内标特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图如图4所示。

表1骨桥蛋白特异肽及其同位素内标的质谱参数

注：V*和L*是C

进而采用上述方法进行三天三水平三平行的加标实验，评价各候选肽段的回收率和精密度。根据奶粉中含有骨桥蛋白的含量，设置加标水平为25mg/100g，50mg/100g，500mg/100g。

用蛋白质标准品与样品检测液一样的前处理，经上机测定，制作标准曲线，定量本底值和三水平加标的候选肽段的检测值，再根据公式计算回收率。

如表2加标结果显示：GDSVAYGLK回收率和RSD符合ISO/IEC17025-2017标准。

表3回收率和相对标准偏差

实施例2：牛乳基婴幼儿奶粉特骨桥蛋白定量特征肽段的验证

对实施例1中筛选的GDSVAYGLK一条肽段在牛乳基婴幼儿奶粉中骨桥蛋白定的定量实验中进行方法学验证。

方法学验证包括线性与范围、检出限与定量限、回收率和精密度四个部分。

根据方法学验证结果可知，该定量特征肽段的线性良好(R

实施例3：牛乳基婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白的定量特征肽段的筛选

特征肽段筛选方法参照实施例1，定量特征肽段为：LIVTQTMK；

实施例4：牛乳粉中αs1-酪蛋白特征肽的定量特征肽段的筛选

特征肽段优选方法参照实施例1，定量特征肽段为：YLGYLEQLLR。

实施例5：牛乳粉中β-酪蛋白特征肽的定量特征肽段的优选方法。

特征肽段优选方法参照实施例1，定量特征肽段为：VLPVPQK。

实施例6：鸡蛋中卵白蛋白定量特征肽段的筛选

特征肽段优选方法参照实施例1，定量特征肽段为：GGLEPINFQTAADQAR。

实施例7：大豆中球蛋白定量特征肽段的筛选

特征肽段优选方法参照实施例1，定量特征肽段为：VLIVPQNFVVAAR。