组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中医中药和食品技术领域，具体涉及组合物及其制备方法和应用。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤，是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌细胞在宿主体内增殖、迁移、侵袭，而宿主却缺乏阻止它生长的有效机制，这使得肺癌成为高度危险而往往不能治愈的疾病，最终导致宿主死亡。

在体内，癌细胞增殖失控形成肿瘤。因此，抑制癌细胞的增殖、迁移是阻碍肺癌发生发展的方法。肺癌由于其生物学特性复杂，临床确诊时仅15％的病人在诊断时为局部病，25％病变已播散至局部淋巴结。现代医学根据每个患者具体情况可选择手术、放化疗、分子靶向治疗等不同治疗方案。但由于手术、放疗、化疗等治疗手段的局部性，并且对机体正常细胞有一定损伤，对复发、转移问题依然缺乏良策。中医具有多途径，多靶点的协同作用，有助于对肿瘤的辅助治疗/治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了组合物及其制备方法和应用。

本发明提供了组合物及其制备方法和应用。本发明提供的组合物，经实验验证对人肺癌细胞A549具有明显的细胞杀伤作用以及明显的抑制迁移作用，可以用于制备辅助治疗/治疗肺癌的药物制剂或食疗营养品、保健品等。可对早期或发展期肺癌患者进行较为长期的干预治疗，以减缓患者病程发展，改善患者症状。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了组合物，所述组合物包括如下重量份的组分：

桑葚9～30份、余甘子3～9份、肉豆蔻3～10份、芡实9～30份、玫瑰花3～9份、淡竹叶6～10份、菊花5～10份、菱角3～15份、肉桂1～5份、香橼3～10份、丁香1～6份和木瓜6～9份。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物包括如下重量份的组分：

桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻6份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶9份、菊花9份、菱角15份、肉桂3份、香橼6份、丁香6份和木瓜6份；或

桑葚9份、余甘子3份、肉豆蔻3份、芡实9份、玫瑰花3份、淡竹叶6份、菊花5份、菱角3份、肉桂1份、香橼3份、丁香1份和木瓜6份；或

桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻10份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶10份、菊花10份、菱角15份、肉桂5份、香橼10份、丁香6份和木瓜9份；或桑葚20份、余甘子6份、肉豆蔻7份、芡实20份、玫瑰花6份、淡竹叶8份、菊花8份、菱角9份、肉桂3份、香橼7份、丁香4份和木瓜8份。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物包括但不限于原料药、原料药制成的药粉、切片以及其提取物、发酵物或其他具有相同或相近生物活性的存在形式。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物的制备方法，取配方量的如下任意项混合、浓缩、干燥，制得所述组合物：桑葚、余甘子、肉豆蔻、芡实、玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角、肉桂、香橼、丁香和木瓜。

在本发明的一些具体实施方案中，具体地，所述组合物的制备方法，取配方量的中药混合，按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；冷冻干燥24h。

在本发明的一些具体实施方案中，所述第一次的料液比为1:10(w/v)，这里的料指的是药材混合物，所述浸泡的时间为20min，所述加热回流的时间为1.5h；第二次的料液比为1:8(w/v)，这里的料指的是滤渣，所述加热回流的时间为1h。

本发明还提供了所述制备方法制得的组合物。

本发明还提供了如下任意项在制备辅助治疗和/或治疗癌症的产品中的应用：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述癌症包括肺癌。

本发明还提供了如下任意项在制备抑制癌细胞增殖和/或迁移的产品中的应用：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述癌细胞包括肺癌细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肺癌细胞为人肺腺癌细胞A549。

本发明还提供了产品，包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述组合物；

所述产品包括食品、药物或药物组合。

在本发明的一些具体实施方案中，所述食品包括保健食品，包括如下任意项以及食品辅助添加剂：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述制备方法制得的组合物；

所述药物组合包括如下任意项以及其他任意有效成分：

(I)、所述组合物；和/或

(II)、所述制备方法制得的组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的剂型包括：汤剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或代茶饮中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述产品的给药方式为口服。

本发明提供了组合物及其制备方法和应用。本发明提供的组合物，经实验验证对人肺癌细胞A549具有明显的细胞杀伤作用以及明显的抑制迁移作用，可以用于制备辅助治疗/治疗肺癌的药物制剂或食疗营养品、保健品等。可对早期或发展期肺癌患者进行较为长期的干预治疗，以减缓患者病程发展，改善患者症状。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示试验例1中采用实施例1的组合物对肺癌细胞和T淋巴细胞中对肺癌相关通路的调控；

图2示试验例2中采用实施例和对比例的组合物抑制肺癌细胞增殖情况(CCK8)；

图3-1示试验例3中采用实施例和对比例的组合物抑制肺癌细胞迁移情况(24h)；

图3-2示试验例3中采用实施例和对比例的组合物抑制肺癌细胞迁移情况(48h)；

图4-1示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤增殖抑制的荧光图像(直观图)；

图4-2示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤增殖抑制的荧光强度(柱状图)；

图4-3示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤增殖抑制的荧光面积(柱状图)；

图5-1示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤迁移抑制的迁移图像(直观图)；

图5-2示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤迁移抑制的播散灶数量(柱状图)；

图5-3示试验例4中采用实施例1的组合物对斑马鱼移植瘤迁移抑制的最大迁移距离(柱状图)。

具体实施方式

本发明公开了组合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明旨在提供一种中药组方，该中药组方提取物对肺癌细胞具有细胞杀伤作用，对肺癌细胞具有明显的抑制迁移作用，可用于制备治疗肺癌的食品或药物，具体包括：

本发明提供一种治疗肺癌的中药组合物，由以下原料组成：桑葚、余甘子、肉豆蔻、芡实、玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角、肉桂、香橼、丁香和木瓜。

1)一种中药组方，由如下药物制成：

桑葚9～30份、余甘子3～9份、肉豆蔻3～10份、芡实9～30份、玫瑰花3～9份、淡竹叶6～10份、菊花5～10份、菱角3～15份、肉桂1～5份、香橼3～10份、丁香1～6份、木瓜6～9份，称量后混合，用超纯水提取后浓缩，冷冻干燥，溶解制得。

2)本发明所述中药组方可对肺癌患者进行较为长期的干预治疗，以减缓患者病程发展，改善患者症状。

中药组方中各单药桑葚、余甘子、肉豆蔻、芡实、玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角、肉桂、香橼、丁香、木瓜，选择一定份数制备提取物，对肺癌细胞具有明显的细胞杀伤作用，对肺癌细胞具有明显的抑制迁移作用。可对早期或发展期肺癌患者进行较为长期的干预治疗，以减缓患者病程发展。

有鉴于此，本发明提供了一种用于辅助治疗/治疗肺癌的组合物及其制备方法。本发明提供的组合物具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移的作用，从而对于肺癌的治疗、辅助治疗具有显著的效果。本发明发现的中药组合物提取物，用于肺癌的治疗或辅助治疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种用于辅助治疗/治疗肺癌的组合物，由以下重量份数的组分组成：桑葚9～30份、余甘子3～9份、肉豆蔻3～10份、芡实9～30份、玫瑰花3～9份、淡竹叶6～10份、菊花5～10份、菱角3～15份、肉桂1～5份、香橼3～10份、丁香1～6份、木瓜6～9份。

上述组合物的制备方法，是将所述各组分，称量后混合，用超纯水提取后浓缩，冷冻干燥。

本发明通过人肺腺癌细胞A549增殖抑制实验和划痕迁移抑制实验，证明了本发明提供的上述组合物具有明显的抑制肿瘤细胞增殖、迁移的作用，从而对于肺癌的治疗、辅助治疗具有显著的效果。可以用于制备辅助治疗/治疗肺癌的药物和/或制剂，所述药物和/或包括所述的组合物或所述制备方法获得的组合物、以及药学上可接受的助剂。制剂形式包括：汤剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、代茶饮中的一种或多种。

本发明组合物中的12味原料均为药食同源药材或可食用药材，不含有药典标明的毒性中药材成分，安全可靠。其中除菱角外的其他11味原料均在国家卫健委于2014年公布的《按照传统既是食品又是中药材物质目录管理办法(征求意见稿)》中有所公布；而菱角在我国历代本草文献中记载为：“轻身类食物”，《本草纲目》中说：菱角能补脾胃，强股膝，健力益气。故而本发明的组合物也可以提供作为一种保健食品形式，包括所述的组合物或所述制备方法获得的组合物、以及食品辅助添加剂，制备成临床患者更易接受的食疗形式，使得肺癌的辅助治疗在食疗方面获得更为早期的干预。

本发明的组合物，从传统中医学看来，方解为桑葚为君，余甘子、肉豆蔻、芡实为臣，玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角为佐，肉桂、香橼、丁香、木瓜为使。君臣佐使合用，互辅互助，合用共奏最佳效果。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。

本发明提供的组合物，在实际使用时，可按照各种已知的药物制剂或食品、保健品制备方法制备成各种内服剂型或食疗补品形式，其中原料药物的提纯、精制以及组合物的制备方法均可采用现有技术中已有的方法，本发明实施例提供下述的组合物的制备方法为举例性描述，不作为对本发明技术方案的限定。

后续实施例中涉及到的组合物，其在进行实验例时，采用的一种制备方法是：将组方中各组分(饮片形式)称量后混合，按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，备用；进行CCK8实验、划痕迁移实验、斑马鱼移植瘤增殖实验时，将冻干粉溶于pbs中制成提取物母液，-20℃保存。

一种用于辅助治疗/治疗肺癌的组合物，各组分的重量份数如下表所示：

技术方案阐述：

一、中药组方的制备，具体过程为：

1.一种辅助肺癌治疗的中药组方由如下药物组成：桑葚9～30份、余甘子3～9份、肉豆蔻3～10份、芡实9～30份、玫瑰花3～9份、淡竹叶6～10份、菊花5～10份、菱角3～15份、肉桂1～5份、香橼3～10份、丁香1～6份、木瓜6～9份，不同配比的中药组方均具有辅助肺癌治疗的作用，获得了优选的治疗肺癌的中药组方。

中药组方如下：

(1)桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻6份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶9份、菊花9份、菱角15份、肉桂3份、香橼6份、丁香6份、木瓜6份；

(2)桑葚9份、余甘子3份、肉豆蔻3份、芡实9份、玫瑰花3份、淡竹叶6份、菊花5份、菱角3份、肉桂1份、香橼3份、丁香1份、木瓜6份；

(3)桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻10份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶10份、菊花10份、菱角15份、肉桂5份、香橼10份、丁香6份、木瓜9份；

(4)桑葚20份、余甘子6份、肉豆蔻7份、芡实20份、玫瑰花6份、淡竹叶8份、菊花8份、菱角9份、肉桂3份、香橼7份、丁香4份、木瓜8份；

对比中药组方如下：

(1)桑葚30份、肉豆蔻6份、芡实30份、淡竹叶9份、菊花9份、菱角15份、香橼6份、木瓜6份(缺药实验，包含8味药)；

(2)桑葚30份、肉豆蔻6份、芡实30份、淡竹叶9份、菊花9份、香橼6份、木瓜6份(缺药实验，包含7味药)

2、中药组方的制备方法：

按剂量称取配方中各药(饮片)，称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于pbs中制成提取物母液，-20℃保存。

二、利用高通量转录组筛选技术检测中药组合物对肺癌细胞和T淋巴细胞通路的影响

具体实验过程为：

中药提取：中药组合物包含以下12种单药：桑葚、余甘子、肉豆蔻、芡实、玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角、肉桂、香橼、丁香、木瓜。药材通过超声或索式方法进行水提，制备成冻干粉。称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

利用上述12种提取物分别处理肺癌细胞A549、T淋巴细胞Jurkat 24h。药筛细胞的裂解，反转录及扩增建库参照相关试剂盒的使用说明进行，样品进行上机测序。

数据处理：以PBS处理组为对照组，药物处理组与对照组比较，计算相关通路基因及背景基因的变化倍数。利用基因集富集分析技术，进行肺癌相关信号通路富集分析，FDR<0.25，认为通路被显著调控。

三、A549肺癌细胞增殖检测实验(CCK-8)

1、细胞铺板与加药：

从培养箱中取A549细胞培养瓶，PBS清洗2次，加1mL胰酶至培养瓶，轻晃使整个细胞面都被胰酶覆盖到，放入培养箱消化至细胞部分漂浮，加2mL完全培养基，使用巴氏吸管吹打培养基，使细胞脱落，离心，弃上清，加2mL培养基将细胞轻轻吹打混匀，细胞计数板计数。按照384孔板，2500细胞/孔进行细胞铺板。置于培养箱中培养24h。从培养箱拿出细胞培养板，缓慢弃掉培养基。设置实验孔和对照孔，实验孔中加入不同浓度梯度的方剂实验工作液，以PBS为对照孔，培养箱中培养24h。

2、CCK-8检测

从培养箱拿出细胞培养板，缓慢弃掉培养基。加入已配置的CCK8完全培养基55μL(完全培养基：CCK8＝10:1)。在培养箱孵育3h后用酶标仪测量(波长450nm)。并根据细胞存活率计算公式计算细胞存活率。

细胞存活率计算公式：

细胞存活率(％)＝{(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)}×100％。

四、划痕实验分析组合物对人肺癌细胞迁移的调控。

A549细胞以12万/孔铺于24孔板中，置37℃、5％CO2细胞培养箱培养过夜后，在24孔板底画一条横线，用10μL无菌枪头在孔内垂直横线划痕，缓慢弃掉培养基，用PBS轻柔洗去刮下的悬浮细胞，各实验组加入无血清培养基配置的终浓度为1000μg/mL的提取物，同时设置溶剂对照组。于24h、48h后拍摄细胞迁移情况，应用Image J软件测量划痕面积，并计算细胞迁移率。

细胞迁移率计算公式：迁移率(％)＝{(0h划痕面积-24h或48h划痕面积)/0h划痕面积}×100％。

五、斑马鱼实验分析组合物对斑马鱼移植瘤增殖调控。

使用CM-Dil染料标记人肺癌细胞(A549细胞)，以显微注射的方式移植到受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人肺癌移植模型。将注射人肺癌细胞的斑马鱼培养至3dpf，在显微镜下挑选出移植瘤一致性较好的斑马鱼，随机分组。分别使用E3培养液溶解药物至终浓度为125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL，阳性对照组使用顺铂，终浓度为29μg/mL，同时设置模型对照组。药物处理48h后，荧光显微镜下采集图像。以荧光强度和荧光面积的统计分析结果评价药物对斑马鱼人肺癌异种移植瘤的增殖抑制作用。以播散灶数量和最大迁移距离的统计分析结果评价药物对斑马鱼人肺癌异种移植瘤的迁移抑制作用。

本发明发现辅助肺癌治疗的食药同源中药组合物，提取其有效成分，开发一种具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移的药物或食品，并从细胞和整体水平阐明了其作用效果，以期治疗或辅助治疗肺癌。

本发明提供的组合物及其制备方法和应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：中药组方的制备方法

中药组方：桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻6份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶9份、菊花9份、菱角15份、肉桂3份、香橼6份、丁香6份、木瓜6份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

实施例2：中药组方的制备方法

中药组方：桑葚9份、余甘子3份、肉豆蔻3份、芡实9份、玫瑰花3份、淡竹叶6份、菊花5份、菱角3份、肉桂1份、香橼3份、丁香1份、木瓜6份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

实施例3：中药组方的制备方法

中药组方：桑葚30份、余甘子9份、肉豆蔻10份、芡实30份、玫瑰花9份、淡竹叶10份、菊花10份、菱角15份、肉桂5份、香橼10份、丁香6份、木瓜9份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

实施例4：中药组方的制备方法

中药组方：桑葚20份、余甘子6份、肉豆蔻7份、芡实20份、玫瑰花6份、淡竹叶8份、菊花8份、菱角9份、肉桂3份、香橼7份、丁香4份、木瓜8份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

对比例1：缺药实验(包含8味药)

中药组方：桑葚30份、肉豆蔻6份、芡实30份、淡竹叶9份、菊花9份、菱角15份、香橼6份、木瓜6份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

对比例2：缺药实验(包含7味药)

中药组方：桑葚30份、肉豆蔻6份、芡实30份、淡竹叶9份、菊花9份、香橼6份、木瓜6份。

将上述配方中各药(饮片)称量后混合。按照料液比1:10(w/v)加水浸泡20min，浸泡后加热回流1.5h，200目纱布过滤药液，单独存放；滤渣中加入8倍量的水，按照料液比1:8(w/v)，加热回流1h，过滤药液，单独存放；将上述两次药液合并，离心10min，12000rpm/min，收集上清液；转移至低温真空干燥机冻干24h，制成提取物冻干粉，称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

试验例1：利用高通量转录组筛选技术检测中药组合物对肺癌细胞和T淋巴细胞通路的影响

具体实验过程为：

中药提取：中药组合物包含以下12种单药：桑葚、余甘子、肉豆蔻、芡实、玫瑰花、淡竹叶、菊花、菱角、肉桂、香橼、丁香、木瓜。药材通过超声或索式方法进行水提，制备成冻干粉。称取一定质量冻干粉，溶于PBS中制成提取物母液，-20℃保存。

利用上述12种提取物分别处理肺癌细胞系A549、T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat24h。细胞裂解，反转录及扩增建库参照相关试剂盒的使用说明进行，样品进行上机测序。

数据处理：以PBS处理组为对照组，药物处理组与对照组比较，计算相关通路基因及背景基因的变化倍数。利用基因集富集分析技术，进行肺癌相关信号通路富集分析，FDR<0.25，认为通路被显著调控。

图1展示了实施例1及其单药在肺癌细胞和T淋巴细胞中对14条肺癌相关通路的调控情况：肺癌细胞中通路包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径、癌症中的转录失调、蛋白聚糖在癌症中、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路；T淋巴细胞中通路包括IL-17信号通路、FcγR介导的吞噬作用、白细胞跨内皮迁移、抗原加工提呈、补体和凝血级联、粘着斑、PI3K-Akt信号通路。结果显示，实施例1和实施例5可有效改善上述14条肺癌相关通路。

试验例2：A549肺癌细胞增殖检测实验(CCK-8)

1、实验过程：

(1)细胞铺板与加药：

从培养箱中取A549细胞培养瓶，各加1mL胰酶至培养瓶，轻晃使整个细胞面都被胰酶覆盖到，放入培养箱消化至细胞部分漂浮，加2mL完全培养基终止消化，使用巴氏吸管吹打培养基，使细胞脱落，离心，弃上清，加2mL培养基将细胞轻轻吹打混匀，细胞计数板计数。

A549细胞在384孔板上，以2500细胞/孔进行细胞铺板，置37℃、5％CO2细胞培养箱培养24h后，缓慢弃掉培养基，设置实验孔和对照孔，实验孔中加入不同浓度梯度的实施例提取物工作液，以PBS为对照孔(溶剂对照组)，培养箱中培养24h。

(2)CCK-8检测：

从培养箱拿出细胞培养板，缓慢弃掉培养基。加入已配置的CCK8完全培养基55μL(完全培养基：CCK8＝10:1)。在培养箱孵育3h后，波长450nm处用酶标仪测量吸光度(OD值)，并计算细胞存活率。

细胞存活率计算公式：

细胞存活率＝{(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)}×100％。

2、实验结果：

组合物实施例1～4和对比例1～2实验结果如表1和图2所示，表1中数据是加入不同浓度的组合物后得到的细胞存活率(％)数据，均为三次实验平均值。图2为对应的折线图。

表1

其中*为p值<0.05，**为p值<0.01，***为p值<0.001。

表1的数据作图(中药组合物实验结果)如图2所示，图中存活率(百分比)越低证明组合物对肺癌细胞A549的抑制效果越好。从图中可以看出实施例1所示组合物浓度在600μg/mL时就能够有效抑制A549细胞的增殖，浓度在600、800、1000、1200μg/mL时，实施例1抑制作用优于实施例2、3、4，而对比例1～2均基本没有明显的细胞抑制效果。

试验例3：划痕实验分析组合物对人肺癌细胞迁移的调控

1、实验过程：

A549细胞以12万/孔铺于24孔板中，置37℃、5％CO

细胞迁移率计算公式：

迁移率＝{(0h划痕面积-24h或48h划痕面积)/0h划痕面积}×100％。

2、实验结果

组合物实施例1～4和对比例1～2实验结果如表2、图3-1、图3-2所示。表2中数据是药物作用24h和48h的迁移率(％)数据，图3-1为24h对应的柱状图，图3-2为48h对应的柱状图。

表2实施例和对比例的组合物抑制肺癌细胞迁移率

其中*为p值<0.05，**为p值<0.01，***为p值<0.001。

细胞划痕实验结果如图3-1和图3-2所示，从图中可以看出，实施例1、2、3、4均有明显抑制A549细胞迁移的作用，而相比来看，对比例1～2完全没有抑制细胞迁移的作用。同时，实施例1抑制A549细胞迁移的作用优于实施例2、3、4。

试验例4：斑马鱼实验分析组合物对斑马鱼移植瘤增殖的调控

1、实验过程：

使用CM-Dil染料标记人肺癌细胞(A549细胞)，以显微注射的方式移植到受精后2天(2dpf)野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人肺癌移植模型。将注射人肺癌细胞的斑马鱼培养至3dpf，在显微镜下挑选出移植瘤一致性较好的斑马鱼，随机分组。分别使用E3培养液溶解药物至终浓度为125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL，阳性对照组使用顺铂，终浓度为29μg/mL，同时设置模型对照组。药物处理48h后，荧光显微镜下采集图像。

以卵黄囊荧光强度和荧光面积的统计分析结果评价药物对斑马鱼人肺癌异种移植瘤的增殖抑制作用。组合物实施例1，实验浓度分别为125、250、500μg/mL，实验结果如表3、图4-1、图4-2、图4-3所示，表3-1中数据是实施例1对斑马鱼的A549移植瘤的增殖抑制作用结果，图4-1为对应表型图，图4-2是对应荧光强度柱状图，图4-3是对应荧光面积柱状图。

表3实施例1对斑马鱼A549移植瘤的增殖抑制作用

其中*为p值<0.05，**为p值<0.01，***为p值<0.001。

斑马鱼移植瘤增殖实验结果如图4-1、图4-2、图4-3所示，从图中可以看出，实施例1较模型对照组有明显的肿瘤增殖抑制作用。

以播散灶数量和最大迁移距离的统计分析结果评价药物对斑马鱼异种移植瘤的迁移抑制作用。组合物实施例1，实验浓度分别为125、250、500μg/mL，实验结果如表4、图5-1、图5-2、图5-3所示，表4中数据是实施例1对斑马鱼的A549移植瘤的迁移抑制作用结果，图5-1为对应表型图，图5-2是对应播散灶数量柱状图，图5-3是对应最大迁移距离柱状图。

表4实施例1对斑马鱼A549移植瘤的迁移抑制作用

其中*为p值<0.05，**为p值<0.01，***为p值<0.001。

斑马鱼移植瘤迁移实验结果如图5-1、图5-2、图5-3所示，从图中可以看出，实施例1较模型对照组有明显的肿瘤迁移抑制作用。

通过以上实验可以证明，本发明的组合物具有明显的细胞杀伤作用以及明显的抑制增殖和迁移作用，可以用于制备辅助治疗/治疗肺癌的药物制剂或食疗营养品、保健品等，对早期或发展期肺癌患者进行较为长期的干预治疗，以减缓患者病程发展。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。