酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术，尤其是一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法。

背景技术

DSB是一种非常严重的DNA损伤，若不及时修复，则会导致基因突变、诱发癌症等。DSB主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)来进行修复，构建可化学或物理诱导的DSB是研究上述DNA损伤途径必不可少的工具。传统的DNA损伤模型多用电离辐射、化学诱变剂等来诱导，并不能很好地将损伤类型限制在单一DSB损伤，还常常伴随DNA单链断裂(SSB)、碱基突变以及DNA双链交联等。此外，自然条件下细胞内DSB的产生通常不止一个，研究多个DSB同步产生时的毒理作用，以及机体的修复过程，具有重要的生物医学基础理论意义和使用价值。

如图1所示，电离辐射、化学诱变剂等外界因素诱导的DNA损伤类型复杂，且位点随机，无法有效研究HR、NHEJ等特定修复DSB的分子信号通路。本文构建了一个能稳定诱导产生双DSB定点产生的模型，两个DSB的间隔距离可根据需要改变，因而不仅可以排除其他损伤类型的干扰，更重要的是可研究同步产生的“聚集型”DSB相对于单个DSB，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程。鉴于“聚集型”DNA损伤是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种定点同步双DSB模型的构建方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，步骤如下：

⑴设计上、下游引物，引物两端加上I-SceI识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的I-SceI基因的表达盒及KanMX筛选基因GAL-I-SceI-KanMX从质粒pGSKU扩增下来；

⑵设计第二段引物进行第二次PCR扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；

⑶使用转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达I-SceI基因的酵母，激活启动子时，就能够表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。

而且，所述步骤⑴中上游引物为SEQNO.1，下游引物为SEQNO.2；

DNA聚合酶反应体系：ddH

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

而且，所述步骤⑵中上游引物为SEQNO.3，下游引物为SEQNO.4；

DNA聚合酶反应体系：ddH

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

而且，所述步骤⑶中上游引物为SEQNO.5，下游引物为SEQNO.6。

而且，所述步骤⑴中酿酒酵母诱导型启动子为半乳糖启动子GAL、己糖转运载体或乙醇脱氢酶Ⅱ。

而且，所述步骤⑴中能够根据需要通过重叠延伸PCR引入一段无用序列，从而调节两个DSB的间隔距离。

而且，所述步骤⑴中I-SceI基因的表达盒包括半乳糖启动子、I-SceI内切酶、KanMX/潮霉素/诺尔斯菌素筛选标记。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明建立了一种在酵母基因组的任何位点稳定诱导、同步产生两个DSB的方法，并可根据需要设置两个DSB的间隔距离。这一方法稍作延伸，即可在基因组的任何位置，同步产生多个DSB，是一个强大的DNA修复应答研究模型。特别适用于研究同源重组修复(HR)和非同源末端连接修复(NHEJ)，以及不同修复途径间的协同及互补机制，可以用于人体或其他生物的细胞。

2、多个DSB同步产生的“聚集型”DNA损伤是癌症放疗及众多化疗药物的特征损伤类型，本发明所建立的双DSB定点诱导模型，与传统的电离辐射和化学诱变剂等诱导的随机DNA损伤相比，只诱导单纯的DSB损伤，不仅可排除其他类型DNA损伤的干扰，更重要的是可在基因组的任何位置诱导“聚集型”DSB的产生，从而可精准获取多个DSB同时产生时，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程，是研究抗癌药物毒理及精准医疗的强有利工具。

3、本发明构建了一个能稳定诱导产生双DSB定点产生的模型，两个DSB的间隔距离可根据需要改变，因而不仅可以排除其他损伤类型的干扰，更重要的是可研究同步产生的“聚集型”DSB相对于单个DSB，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程。鉴于“聚集型”DNA损伤是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。

附图说明

图1为现有技术中产生DSB损伤的主要方法示意图；

图2为本发明双DSB同步诱导模型的一种构建示意图；可通过调节间隔序列(基因之间没有遗传效应的DNA片段)的长短来产生不同间隔长度的DSB；

图3为本发明中验证双DSB定点损伤模型构建是否成功示意图；实验组1-5显示扩增出3620bp的条带，表明间隔序列为3620bp的双DSB损伤模型构建成功。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，步骤如下：

⑴设计上、下游引物，引物两端加上I-SceI识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的I-SceI基因的表达盒及KanMX筛选基因GAL-I-SceI-KanMX从质粒pGSKU扩增下来；

⑵设计第二段引物进行第二次PCR扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；

⑶使用转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达SceI基因的酵母，激活启动子时，就能够表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。可以如图2所示。

较优地，所述步骤⑴中上游引物为SEQNO.1，下游引物为SEQNO.2；

DNA聚合酶反应体系：ddH

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

较优地，所述步骤⑵中上游引物为SEQNO.3，下游引物为SEQNO.4；

DNA聚合酶反应体系：ddH

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

较优地，所述步骤⑶中上游引物为SEQNO.5，下游引物为SEQNO.6。

较优地，所述步骤⑴中酿酒酵母诱导型启动子为半乳糖启动子GAL、己糖转运载体或乙醇脱氢酶Ⅱ。

较优地，所述步骤⑴中能够根据需要通过重叠延伸PCR引入一段无用序列，从而调节两个DSB的间隔距离。

较优地，所述步骤⑴中I-SceI基因的表达盒包括半乳糖启动子、I-SceI内切酶、KanMX/潮霉素/诺尔斯菌素筛选标记。

具体地：

一种酵母中双DSB模型的构建方法，步骤如下：

⑴在质粒中构建由半乳糖启动子(GAL)控制的I-SceI基因的表达盒(GAL-I-SceI)及添加必要的抗性筛选基因(HYG，KanMX等)。I-SceI是一类由内含子编码的归位内切酶，含235个氨基酸。此内切酶能特异性地识别含18个非对称核苷酸的DNA序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)，在含有此碱基序列的位点处将DNA切割，形成DSB。类似的内切酶还有多种，可根据需要灵活选用。

⑵通过PCR扩增GAL-I-SceI基因序列，设计的PCR上、下游引物两端分别添加I-SceI酶所识别的DNA序列(TAGGGATAACAGGGTAAT)，以及基因组整合所需要的同源臂。根据需要调整两个I-SceI酶识别序列的插入位置，以便产生不同距离间隔的双DSB。为有效的将GAL-I-SceI整合到目标生物基因组的特定位点处，同源臂的长度应大于80bp。

⑶使用化学转化法或其他转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功。

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达I-SceI基因的酵母，激活启动子时，即可大量表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。

更为具体地，相关制备及检测如下：

一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，具体步骤如下：

⑴设计上、下游引物F1、F2，引物两端加上I-SceI识别位点，用F1、F2将半乳糖启动子(GAL)控制的I-SceI基因的表达盒及KanMX筛选基因(GAL-I-SceI-KanMX)从质粒pGSKU扩增下来。该引物设计的两个DSB的间隔距离为3620，可根据实验需要通过重叠延伸PCR引入一段间隔序列(基因之间没有遗传效应的DNA片段)，从而调节两个DSB的间隔距离。F1序列：TTTCAGAGGTCGCCTGACGCTAGGGATAACAGGGTAATATACGCAAACCGCCTCTCCC，F2序列：TCCCAATTTTTCAGTTGAAAATAGGGATAACAGGGTAATGTCACCAAAGAACCAAGGGG；

pGSKU是可公开获取的质粒，I-SceI基因的表达盒是从pGSKU质粒上直接扩增出来的目的片段。pGSKU图谱连接：https://www.addgene.org/72243/。

FastpfuDNA聚合酶反应体系：ddH

FastpfuDNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

⑵设计第二段引物F2、R2进行第二次PCR扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp。F2:ATCAAATTCGATGACTGGAAATTTTTTGTTAATTTCAGAGGTCGCCTGACGC；R2:ATGAAAAGCCGGTTCCGGCGCTCTCACCTTTCCTTTTTCTCCCAATTTTTCAGTTGAAA。该引物设计的插入位点为Ⅲ号染色体91055-91143处，插入位点可根据不同的实验需求更改。

FastpfuDNA聚合酶反应体系:ddH

FastpfuDNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

⑶使用化学转化法或其他转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功。上游引物：CAAGTAATTGGTTGTTTGGC；下游引物：TAGCCAGTTTGTTGAAAGCTTGGT。其中，对照组(W)：不能用验证引物扩增出条带；实验组(1-5)：能用引物扩增出3620bp的片段；结果如图3所示；

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达I-SceI基因的酵母，激活启动子时，即可大量表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学，齐鲁理工学院

<120> 酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA/RNA

<213> F1序列(Unknown)

<400> 1

tttcagaggt cgcctgacgc tagggataac agggtaatat acgcaaaccg cctctccc 58

<210> 2

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> F2序列(Unknown)

<400> 2

tcccaatttt tcagttgaaa atagggataa cagggtaatg tcaccaaaga accaagggg 59

<210> 3

<211> 52

<212> DNA/RNA

<213> 第二段引物F2(Unknown)

<400> 3

atcaaattcg atgactggaa attttttgtt aatttcagag gtcgcctgac gc 52

<210> 4

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> 第二段引物R2(Unknown)

<400> 4

atgaaaagcc ggttccggcg ctctcacctt tcctttttct cccaattttt cagttgaaa 59

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 上游引物(Unknown)

<400> 5

caagtaattg gttgtttggc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 下游引物(Unknown)

<400> 6

tagccagttt gttgaaagct tggt 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 18个非对称核苷酸的DNA序列(Unknown)

<400> 7

tagggataac agggtaat 18