一种黄芪甲苷类化合物的药物用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种黄芪甲苷类化合物的药物用途。

背景技术

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，具有感染宿主广泛，传播迅速，致病率高等特点。流感病毒容易引发流感大流行，其死亡率高于季节性流感，对人类和动物的生命健康造成了严重的威胁。甲型流感和乙型流感是引起流感的两种不同的病毒类型。甲型流感病毒除感染人以外，在动物中也广泛存在如禽类、猪、马、海豹以及鲸鱼、水貂等。乙型流感病毒主要在人体内循环并引起季节性的流感，往往在冬春季节易流行。甲型流感病毒是抗原发生变异后产生新的亚型，常常引起世界性的大流行。乙型流感病毒抗原的变异性比较小，只形成变种而无新的亚型出现，故常常造成局部爆发的小流行。疫苗是预防流感的主要策略，但流感病毒的高度变异，疫苗研发的滞后性以及对不同流感毒株不能产生交叉保护作用等缺陷限制了疫苗的有效使用。目前，临床上可用的抗流感病毒药物包括M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦)。M2离子通道抑制剂因多年使用已造成临床流行毒株对其100％耐药，神经氨酸酶抑制剂的耐药毒株也在日益增加。疫苗与化药的缺陷使得流感的防治举步维艰。

因此，迫切需要开发新型高效广谱抗流感病毒药物来应对流感病毒，祖国传统医学中用中草药治疗流感历史悠久。流感,在祖国医学属风寒伤于足太阳经, 即时病的范畴。现代的体外实验也证实了中草药的抗病毒作用。《中国药典》中记载黄芪(RadixAstragali)为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]或膜荚黄芪[Astragalus membranace(Fisch.)Bge.]的干燥根(国家药典委员会,2010)，多年生草本植物，是我国传统名贵中药材，具有利尿排毒、补气固表、敛疮生肌、排脓等功效。黄芪甲苷(AstragalosideⅣ)是黄芪的主要活性物质，在药典中被作为黄芪质量检测标志物。黄芪甲苷为羊毛酯醇型的四环三萜皂苷，分子式为C

发明内容

本发明要解决目前缺乏安全有效抗乙型流感病毒药物的技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种黄芪甲苷或其药学上可接受的盐类在制备抗乙型流感病毒药物中的用途；

进一步的，所述抗乙型流感病毒是指对乙型流感病毒增殖具有抑制作用；

进一步的，所述黄芪甲苷的结构如下式所示：

进一步的，所述药学上可接受的盐为所述黄芪甲苷与化学上可接受的酸或碱反应制得的盐；更进一步的，所述化学上可接受的酸为无机酸或有机酸；进一步优选的，所述无机酸选自盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸中的任意一种或几种；或进一步优选的，所述有机酸选自乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、乳酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、马来酸，苯甲酸、琥珀酸、苦味酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸中的任意一种或几种；

进一步的，所述药学上可接受的盐为所述黄芪甲苷与化学上可接受的碱进行反应制得的盐；更进一步的，所述化学上可接受的碱为无机碱或有机碱；进一步优选的，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的任意一种或几种；或进一步优选的，所述有机碱选自三甲胺、三乙胺、吡啶中的任意一种或几种；

更进一步的，所述药学可接受的盐可以为钾盐、钠盐、铵盐、钙盐、吡啶盐、胆碱盐中任意一种或几种；

本发明的第二方面提供了一种抗乙型流感病毒的药物组合物，包含黄芪甲苷或其药学上可接受盐以及药学上可接受的载体，在制备抗乙型流感病毒药物中的用途；

进一步的，所述药物组合物中所述黄芪甲苷或其药学上可接受盐占所述药物组合物质量的0.01～90％；优选的，所述药物组合物中所述黄芪甲苷或其药学上可接受盐占所述药物组合物质量的0.05～70％；进一步优选的，所述药物组合物中黄芪甲苷或其药学上可接受盐占所述药物组合物质量的0.1～30％；

进一步的，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、溶剂中的任意一种或几种；更进一步的，本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；更进一步的，所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；更进一步的，所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；更进一步的，所述崩解剂包括但不限于淀粉、碳酸氢钠和/或枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；更进一步的，所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚、羧甲基甲壳酯等；更进一步的，所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等；

更进一步的，所述药学上可接受的载体还可以包括香味剂或甜味剂；

进一步的，所述黄芪甲苷、其药学上可接受盐或包含黄芪甲苷或其药学上可接受盐的药物组合物的给药方式施用方式为口服、全身施用(例如，透过皮肤的、鼻吸入的或者以栓剂形式给药)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)；优选的施用方式是口服；

进一步的，所述药物剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、贴剂、丸剂、半固体、喷雾剂、气雾剂或注射剂；进一步优选的，所述药物剂型为片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂。

附图说明

图1是本发明实施例1的ATPlite检测黄芪甲苷对细胞毒性作用的测定结果图；

图2是本发明实施例2的AST对流感病毒SH0218的抑制作用结果图；

图3是本发明实施例2的AST对SH0218毒株增殖动态抑制结果图；

图4是本发明实施例2的荧光定量RT-PCR检测SH0218毒株抑制作用图；

图5是本发明实施例2的TCID

有益效果

本发明通过实验证明:

1.黄芪甲苷AST对乙型流感病毒具有明显的抑制作用，这种作用尤其是在体外；

2.黄芪甲苷AST对乙型流感病毒的抑制率与黄芪甲苷AST浓度呈正相关，当黄芪甲苷浓度＞60μg/ml时，抑制病毒作用起效，而当其浓度在100μg/ml时，效果最佳，当其浓度≤100μg/ml时，无细胞毒作用，安全有效；

3.黄芪甲苷AST对乙型流感病毒起抑制作用具有时间依赖性。

本发明为进一步开发抗乙型流感病毒药物奠定了坚实的物质基础，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1黄芪甲苷(AST)对细胞毒性测定实验

黄芪甲苷AST按5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、 100μg/ml的浓度分别作用MDCK细胞72h时，MDCK细胞在黄芪甲苷AST浓度80μg/ml时，在光镜下有部分变圆，但没有明显的毒性，而在100μg/ml浓度时，则出现明显的细胞变圆，高于100μg/ml浓度时，细胞毒性更明显，出现明显的细胞聚团现象。MTT法测定各孔OD值，结果显示：MDCK细胞在浓度 100μg/ml时，存活率93％以上，而200μg/ml时，存活率降低到30％，超过200μg/ml时，细胞几乎没有活性(如图1所示)。这说明黄芪甲苷AST在100μg/mL及其以下浓度时，对MDCK细胞不具有明显的细胞毒性作用，可用于药效试验。

实施例2黄芪甲苷(缩写为AST)对流感病毒的抑制实验

1.药物与试剂

黄芪甲苷(Astragaloside IV)，经HPLC测得其纯度≥98％，购自AMA CopoeiaReference(40mg)，使用时用DMSO溶解；胎牛血清(FBS)、四甲基噻唑蓝(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)以及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；胰蛋白酶-EDTA、青霉素、链霉素溶液购自Gibco公司；二抗

2.病毒和细胞

将采集的流感样病例咽拭子标本进行核酸、病毒分离检测定型，对选取的1 株乙型流感病毒分离株SH0218毒株采用一步法RT-PCR方法扩增其HA基因和 NA基因，扩增产物经纯化测序，采用生物信息软件从核苷酸、氨基酸以及分子进化层面对毒株进行分子特征分析。分离的乙型流感病毒HA基因和NA基因聚类的分支关系基本一致，属于Victoria系毒株，分布于Victoria Clade 1A分支，属Brisbane/60类毒株。Victoria系毒株共涉及2个抗原表位，120-loop抗原表位的117、129位点，190-helix抗原表位的197、199位点。Victoria系毒株HA和 NA抗原基因变异位点在在不停发生改变。通过犬肾传代细胞系(MDCK)测定滴度(TCID

3.主要仪器与耗材

多功能全波长酶标检测仪购自美国Biotek公司；低温4℃离心机购自德国，有Eppendorf公司提供；荧光倒置显微镜购自德国Zeiss公司；HeraCell 150i二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司；生物安全柜购自热电公司。96孔细胞培养板、细胞冻存管、细胞培养瓶、EP管、离心管等均购自美国Corning公司。

4.常用试剂配制

(1)无Ca

(2)DMEM基础培养液：DMEM培养液中加入质量体积浓度为5％的青霉素+5％链霉素的双抗。

(3)质量体积浓度为1％鸡红细胞悬液：采取隔离饲养并且禽流感病毒抗体阴性的健康SPF级公鸡心脏血，用灭菌PBS洗涤3次以除去血浆及白细胞，再用无菌PBS配成红细胞悬液其浓度为1v/v％，放置于4℃冷藏保存备用。

5.流感病毒株的扩增

(1)流感病毒鸡胚接种：将流感病毒用含青霉素的无菌生理盐水适当稀释，选取10日龄形态完整，血管清晰，胎动明显，绒毛尿囊膜发育界线明显的SPF 鸡胚，用灯照视，在气室交界处标记接种部位，并且避开胚胎头部及血管，用碘酒、酒精消毒操作，开孔器打孔，注射器吸取0.1mL病毒稀释液缓慢注射入鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL，注射结束石蜡封孔，然后将接种后的鸡胚放于35℃、饱和湿度的恒温箱48h。间断12小时胚胎一次，除去24小时之内死去的鸡胚。

(2)鸡胚尿囊液收毒：将鸡胚置于4℃冰箱过夜，消毒并放弃蛋壳，小心吸出尿囊液，3000rpm，离心20min，留上清液保存。

(3)HA法测定血凝效价：在96孔血凝板A-H行的2～12孔内加入25μL PBS，在A-H行的第一孔加入待检鸡胚尿囊液，二倍倍比稀释，混合匀第11孔，除去25μL液体，将第12孔作为阴性对照组，之后将每孔加入25μL的1％的鸡红细胞悬液，从低浓度往高浓度参入，混和均匀，室温放置30min，观察鸡红细胞凝集状况。

(4)挑选血凝滴度大于1:256的清亮尿囊液，混合均匀后，进行1500rpm，离心10min，选择上清液，分装好，做好记号放于-80℃冻存以后再用。

6.病毒抑制实验

培养MDCK细胞，检测每孔细胞数为104时，设计组为正常对照组、IBV 感染组、AST药效检测组(浓度为0～100μg/ml)。用生物倒置显微镜每天观察各组细胞生长状况，描述如下：病变<25％用弱阳性(±)表示；25％用(+)显示、50％用(++)显示、75％用(+++)显示、100％用(++++)显示，不断记录，直到病毒对照组细胞的CPE出现为75％～100％，放入噻唑蓝(MTT)开始活细胞染色，2小时后使用酶标仪进行各组细胞吸光度值的测定。

在培养瓶中培养MDCK细胞。在病毒感染的不同时间(12、24、48、72、 96、120h)获取细胞，采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次来去除上清液中还未穿过细胞的病毒。然后将上述细胞冻融3次，裂解细胞，获得病毒，过滤掉细胞碎片。对将各组细胞裂解液做病毒滴度的检测，观察药物是否抑制细胞中病毒的繁殖。

7.荧光定量PCR测定乙型流感病毒HA基因和细胞因子mRNA表达量

获取对数生长期的MDCK细胞，并往12孔板中的每孔中参入1mL(1×106 个细胞/孔)，待细胞单层生长到汇合度90％后除去培养液，并用PBS液洗涤两遍，然后参入SH0218病毒，量为500μL/孔，在4℃条件下孵育1小时，除去病毒上清液，接着PBS洗涤两次，在接着分别在0h、2h、4h、6h、10h参入25μg/mL的黄芪甲苷，剂量是1mL/孔。设正常对照组(分别为不加受试药物和不加流感病毒)和病毒对照组(为不加受试药物)，每个受试浓度设置三个平行。细胞继续37℃培养，至感染后10h终止培养。观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总RNA极速抽提试剂盒(公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总RNA抽提。提取RNA后立即在特定引物下进行反转录，合成cDNA模板，内参基因选为GAPDH，Real-time qPCR检测的HA 基因拷贝数；以正常对照组做参照，评价M mRNA的的表达情况。乙型流感病毒Victoria lineage毒株的HA基因的正反引物序列：FluB-HA-940-FAAATACGGTGGATTAAACAAAAGCAA(SEQ ID NO：1)；FluB-HA-1109-R CCAGCAATAG CTCCGAAGAAA(SEQ ID NO：2)；内参GAPDH基因正反引物序列：GAPDH-F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'(SEQ ID NO：3)； GAPDH-R：5'-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3'(SEQ ID NO：4)。将稀释后的病毒悬液按照浓度大小加入96孔板中，每个梯度8个重复，每孔200μL。分别设置未经处理病毒液的阳性对照和不加病毒只加200μL培养基的阴性对照。各8 个重复。将96孔板置于37℃，5％CO

8.红细胞抗原凝集试验(HA)计算处理前后病毒TCID

感染上述各组病毒液72h后，取出96孔板，用排枪将板中悬液吸出50μL 加入红细胞凝集反应板中，然后用排枪每孔快速滴入50μL鸡红细胞悬液。室温孵育30min。观察HA结果：发生红细胞凝集的孔为阳性孔，未发生红细胞凝集孔为阴性。记录阳性孔和阴性孔数量。计病毒悬液TCID

*Mv值判定标准参照ISO18184-2014

9.结果判定

根据以下公式对结果进行计算，结果记录在表1中。

TCID

距离比例＝(高于50％凝集的百分数-50％)/(高于50％凝集率的百分数-低于50％病变率的百分数)

lgTCID

Mv＝-lg(TCID

判定标准如下：

3.0＞Mv≥2.0：能够有效抑制；Mv≥3.0：能够完全抑制

表1

10.结果：

(1)AST对流感病毒B/SH/02/18毒株(SH0218)的抑制作用

使用5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml 的AST在体外作用于MDCK细胞，在不影响细胞活性的情况下，观察48h，检测AST对SH0218病毒的抑制作用。结果发现：AST对SH0218具有明显的抑制作用，在高浓度的80μg/ml时，SH0218病毒的抑制率为75％，而100μg/ml AST 作用时，SH0218病毒的抑制率为97％(如图2所示)。AST对SH0218在MDCK 细胞形成典型的溶细胞病变中，具有明显的抑制病毒作用。

以上实验不难看出，黄芪甲苷AST在体外对乙型流感病毒具有明显的抑制作用，且抑制率与黄芪甲苷AST浓度呈正相关，在黄芪甲苷浓度为100μg/ml 时，黄芪甲苷组细胞形态较DMSO组相比，细胞形态更加完整，接近于正常细胞形态，而对照组DMSO组的MDCK细胞形态变得大小不一，部分空泡形成，分布不均，部分浓聚。细观发现在黄芪甲苷组，当黄芪甲苷AST浓度达到20μg/ml 时，其对SH0218开始起抑制作用，当AST浓度低于20μg/ml时，几乎未见其对SH0218的抑制作用。

(2)AST对流感病毒B/SH/02/18毒株动态抑制情况

使用20μg/ml、60μg/ml、100μg/ml三种不同浓度的AST在体外作用于MDCK 细胞，分别检测4h、8h、12h等不同感染时间点，分别检测AST对B/SH/02/18 (SH0218)病毒的抑制作用。结果发现：100μg/ml AST在1mol SH0218毒株感染的8h时，已经开始对SH0218毒株具有明显的抑制作用，SH0218毒株病毒在上清中的滴度降低明显，从对照的8.34×10

该部分实验可以看出黄芪甲苷AST对SH0218毒株起抑制作用需要时间依赖性，需8h时才体现出抑制作用，为后期实验测定细胞因子及动态观察AST 对SH0218毒株的抑制情况提供了时间依据，黄芪甲苷AST作为中药黄芪提取物，其作用相对较温和，即使具有一定的抑制作用，仍然需要时间的依赖性，同样也暗示了其生物安全性较可靠，为临床开发药材提供了良好的依据。

相应地，SH0218毒株在AST用药与否，对病毒增殖用Real-time qPCR鉴定HA基因的相对增加比例，由图4可见，在100μg/ml AST作用下，病毒HA 基因与β-actin的相对比值由原来的358.0倍降低为38.6倍(P<0.01)。在60μg/ml AST作用下，病毒HA基因与β-actin的相对比值由原来的358.0倍降低为76.2 倍(P<0.01)。这些均显示该药物对SH0218毒株病毒体外感染具有明显的抑制作用，当然与时间关系较密切，12h为不同浓度AST出现差异的时间点，故实验时间选择可依此为依据，避免盲目。

在12hpi后，不同浓度AST作用下，收集SH0218毒株感染的MDCK细胞，利用NP抗体检测，结果显示，60μg/ml、100μg/ml两种浓度的AST对病毒具有明显的抑制作用。这说明该药对SH0218毒株病毒的体外细胞培养中具有明显的治疗作用，并且AST的起效浓度为60μg/ml，最佳浓度为100μg/ml(如图5所示)，超过100μg/ml时，AST的毒副作用大于其治疗作用。由此印证了AST 的体外抗SH0218毒株作用以及AST的最佳抗SH0218毒株浓度，为进一步的研究提供了合适的浓度范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第五人民医院

<120> 一种黄芪甲苷类化合物的药物用途

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

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ccagcaatag ctccgaagaa a 21

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<212> DNA

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gcaccgtcaa ggctgagaac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

tggtgaagac gccagtgga 19