一种细胞培养液及其制备方法

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域；涉及一种细胞培养液及其制备方法。

背景技术

细胞培养是指细胞在体外条件的生长。体外培养细胞的生存条件有三个。第一为营养。体外培养细胞所需的营养物质主要包括糖、氨基酸和维生素。大多情况下使用合成培养基提供上述营养物质，但仍需加入人或动物的血清、血浆和胎汁等。例如，要使细胞正常生长，通常需加10-15％的小牛血清。第二为环境。无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物。部分污染微生物的繁殖速度甚至比细胞更快，而且产生毒素导致细胞死亡。细胞培养的最适宜温度为35-37℃；所需的气体主要有O

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，调控因素主要有BMP-2；其能诱导基质细胞向成骨细胞分化。成骨细胞为梭形、锥形或立方形，胞浆嗜硷性。核位于细胞的一端，核仁明显，表面有短的突起与相邻细胞连接。

1979年Mills等人首次报道采用体外组织块培养法成功培养了人成骨细胞；随后陆续有其他人报道成功培养成骨细胞。主要的培养方法包括酶消化法和组织块法，以及改良的酶消法-组织块法联合培养方法。

成骨细胞培养所需的条件与一般细胞培养所需的条件相同，营养与环境条件要满足细胞培养的需求。

中国专利申请CN105567629A公开了一种体外培养成骨细胞的培养基。其特征在于：包括基础培养基10.0-15.0g/L，银耳多糖100-300mg/L，血清8-10mL，适量碳酸氢钠调pH值为7.2-7.6，加水定容至1L；所述的基础培养基为DMEM，α-MEM，RPMI-1640，F12，DMEM/F12；所述的银耳多糖的纯度大于75％；所述的血清为胎牛血清、小牛血清、人血清、马血清和羊血清；该培养基用于体外培养成骨细胞，能够加快成骨细胞的生长，且能减少血清的使用量。

孙晓坤研究了纳米羟基磷灰石陶瓷使用含有10％FBS的α-MEM作为完全培养基浸提72h得到的浸提液，所得成骨细胞增殖率为98.4％，与空白组100％相比无明显差异。此外，纳米羟基磷灰石陶瓷支持成骨细胞的附着和生长，并且具有良好的促进细胞矿化的作用，但上述效果仍不够显著。

针对现有技术存在的缺陷，迫切需要寻找一种针对成骨细胞培养效果更为显著的细胞培养液及其制备方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种细胞培养液。针对成骨细胞前体细胞，所述细胞培养液具有显著的促进细胞增殖作用，同时对细胞矿化具有更为显著的促进效果。

本发明的目的之二在于提供一种上述细胞培养液的制备方法。所述制备工艺简单易行，易于操作，适合用于规模化生产。

为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种细胞培养液，包括基础培养液和添加剂，所述基础培养液包括85-95v％DMEM培养液和5-15v％胎牛血清以及5-15mL/L的双抗储备液；其特征在于，所述添加剂选自壳聚糖改性的纳米羟基磷灰石。

优选地，所述基础培养液包括88-92v％DMEM培养液和8-12v％胎牛血清以及8-12mL/L的双抗储备液。

在一个具体的实施方式中，所述基础培养液包括90v％DMEM培养液和10v％胎牛血清以及10mL/L的双抗储备液。

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述壳聚糖选自粘均分子量Mv＝2-3.5×10

优选地，所述壳聚糖选自粘均分子量Mv＝2.5-3×10

在一个具体的实施方式中，所述壳聚糖选自粘均分子量Mv＝2.72×10

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述纳米羟基磷灰石选自碳酸根取代的B型羟基磷灰石。

在本发明中，除B型羟基磷灰石之外，碳酸根取代的羟基磷灰石还包括A型羟基磷灰石和C型羟基磷灰石。上述羟基磷灰石的划分是按照碳酸根取代羟基磷灰石的阴离子种类进行的。A型羟基磷灰石表示碳酸根仅取代羟基磷灰石的OH

根据本发明所述的细胞培养液，其中，B型羟基磷灰石的碳酸根含量为8-18wt％。

优选地，B型羟基磷灰石的碳酸根含量为10-15wt％。

在一个具体的实施方式中，B型羟基磷灰石的碳酸根含量为12.8wt％。

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述壳聚糖与纳米羟基磷灰石的重量比为1：(10-30)。

优选地，所述壳聚糖与纳米羟基磷灰石的重量比为1：(15-25)。

在一个具体的实施方式中，所述壳聚糖与纳米羟基磷灰石的重量比为1：20。

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述添加剂的加入量为5-50mg/L，基于所述基础培养液的体积。

优选地，所述添加剂的加入量为10-40mg/L，基于所述基础培养液的体积。

在一个具体的实施方式中，所述添加剂的加入量为20mg/L，基于所述基础培养液的体积。

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述DMEM培养液的配制方法如下：将高糖DMEM干粉13.4g溶于950ml三蒸水，加入3.7g碳酸氢钠，添加N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液调整pH＝7.2，定容至1L。

根据本发明所述的细胞培养液，其中，所述双抗储备液的配制方法如下：80万单位的青霉素和0.8g链霉素溶于80mL PBS缓冲液中，微孔滤膜过滤，-20℃保存。

另一方面，本发明还提供了一种上述细胞培养液的制备方法，包括如下步骤：

配制DMEM培养液和双抗储备液；

按照配方，将所述DMEM培养液和胎牛血清混合，再按比例加入所述双抗储备液，得到基础培养液；

将预先制备的壳聚糖改性的纳米羟基磷灰石加入所述基础培养液中，搅拌使其分散均匀，得到细胞培养液。

本发明的有益效果是：

(1)针对成骨细胞，根据本发明所述细胞培养液具有显著的促进细胞增殖作用，同时对细胞矿化具有更为显著的促进效果。

(2)根据本发明所述的细胞培养液的制备方法简单易行，易于操作，适合用于规模化生产。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明，并不限定本发明的应用。

实施例1

(1)制备纳米羟基磷灰石：将11.8g(50mmol)四水硝酸钙(分析纯)加入80mL丙酮(分析纯)，搅拌使其溶解，得到硝酸钙溶液。将3.96g(30mmol)磷酸氢二铵(分析纯)和1.19g(15mmol)碳酸氢铵(分析纯)加入200mL三蒸水，搅拌使其溶解，调节pH＝11.0。将两种溶液在搅拌条件下混合，混合完毕后搅拌30s，得到纳米羟基磷灰石悬浮液。动态光散射DLS法测定纳米羟基磷灰石的平均粒径为20nm。立即使用Millipore全玻璃换膜过滤器进行过滤，并使用三蒸水洗涤三次。最后，纳米羟基磷灰石悬浮液冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石。使用文献(J Mater Sci:Mater Med 29,103)方法确认碳酸根取代类型为B型羟基磷灰石，并计算其碳酸根含量为12.8wt％。

(2)制备壳聚糖改性的纳米羟基磷灰石：取300mg碳酸根取代的B型纳米羟基磷灰石，加入12mL三蒸水中，超声使其分散均匀，得到分散液。另取15mg壳聚糖(粘均分子量Mv＝2.72×10

(3)配制DMEM培养液：将高糖DMEM干粉13.4g溶于950ml三蒸水，加入3.7g碳酸氢钠，添加N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液调整pH＝7.2，定容至1L。

(4)配制双抗储备液：80万单位的青霉素和0.8g链霉素溶于80mL PBS缓冲液中，微孔滤膜过滤，-20℃保存。

(5)制备基础培养液：将90体积份的DMEM培养液和10体积份的胎牛血清混合，再向其中加入10mL/L的双抗储备液，得到基础培养液。

(6)将壳聚糖改性的纳米羟基磷灰石加入所述基础培养液中，所述添加剂的加入量为20mg/L，基于所述基础培养液的体积；搅拌使其分散均匀，得到实施例1的细胞培养液。

比较例1

在实施例1方法步骤(1)基础上，省略碳酸氢铵，获得未经碳酸根取代的纳米羟基磷灰石。动态光散射DLS法测定纳米羟基磷灰石的平均粒径为24nm。

其余步骤同实施例1，最终得到比较例1的细胞培养液。

比较例2

在实施例1方法基础上，省略步骤(2)，即不进行壳聚糖改性；而且步骤(6)直接加入碳酸根取代的B型纳米羟基磷灰石。

其余步骤同实施例1，最终得到比较例2的细胞培养液。

细胞增殖性能

细胞增殖性能采用四唑盐(MTT)比色法，具体方法如下：将对数生长的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1，购自上海邦景实业有限公司)以5×10

细胞矿化性能

将对数生长的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)以1×10

上述结果如下表1所示。

表1

由表1可以看出，针对成骨细胞前体细胞，本发明实施例1细胞培养液相对于比较例1和2具有更为显著的促进细胞增殖作用，同时对细胞矿化具有更为显著的促进效果。

应理解，本发明的具体实施方式仅用于阐释本发明的精神和原则，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明的技术方案作出各种改动、替换、删减、修正或调整，这些等价技术方案同样落于本发明权利要求书所限定的范围。