一种快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法

技术领域

本发明属于水稻遗传育种技术领域，尤其涉及一种快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法。

背景技术

目前，杂交粳稻经历了上世纪80年代的辉煌之后一直处于低谷状态，虽然育成了一系列杂交粳稻新组合，但在生产上推广面积不大，难以与常规粳稻竞争，粳稻区仍然是常规品种一统天下的局面。同时，早期育种者对杂交稻稻米品质的重视不够，与常规稻相比，杂交粳稻米质总体偏差。现有技术1对56个国审杂交粳稻和常规粳稻分析表明，杂交粳稻虽然在整精米率、直链淀粉含量指标上与常规粳稻差别不大，但在垩白粒率和垩白度指标上杂交粳稻品质远低于常规粳稻。选育适合当前市场需求的优质杂交粳稻新品种成为杂交粳稻发展的主要目标。

随着人民经济收入不断提高、生活水平的不断改善，对生活质量的需求也进一步提升，尤其是对饮食质量要求也大幅度提高。科技的进步给人民带来了丰富的农产品，优质大米需求达到极大的满足，优良食味稻米品种应运而生。江苏省农业科学院是率先开展优良食味水稻遗传育种的研究单位，育成了适合江苏不同区域种植的南粳46、南粳5055、南粳9108等11个系列优良食味粳稻品种。目前南粳系列优良食味粳稻品种在江苏省的年种植面积占全省水稻种植面积的三分之一以上。在南粳系列优良食味粳稻品种的带动下，江苏省优良食味水稻遗传育种、品质保优栽培技术以及食味品质评价、品牌建设等方面均取得了突破性进展。在南粳系列优良食味品种的带动下，江苏省优良食味水稻品种选育快速发展，宁粳8号、丰粳1606、苏香粳3号等多个优良食味品种育成并应用。截止到2020年底，我省育成的优良食味粳稻品种适宜种植区域不仅覆盖了江苏省全省，而且在上海、安徽、山东、浙江、湖北、河南等省份广泛种植。

半糯型优良食味品种的育成和广泛应用，取得很好的社会和经济效益，为杂交粳稻研究提供了新的思路和拓展方向，在杂交粳稻恢复系中导入半糯基因，培育品质优良的半糯型杂交粳稻恢复系现在还处于空白，缺少的就是含有半糯基因的粳稻恢复系材料。利用含半糯型基因的优良食味水稻品种作为亲本，将半糯型基因导入到粳稻恢复系中，将半糯基因和雄性不育育性恢复基因组合在一起，得到半糯型粳稻恢复系，再通过组合测配，进而改良杂交粳稻食味品质。常规育种方法选育半糯型粳稻恢复系的方法选育时间长、目标性状选择效率低。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的选育半糯型粳稻恢复系的方法选育时间长、目标性状选择效率低。

解决以上问题及缺陷的难度为：常规育种手段在解决以上技术难题时，往往要费很长的时间周期和大量的数据检测以及稻米外观品质鉴定等，必须要等育种目标材料目标性状稳定以后才能进行鉴定和检测。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明创制半糯型育种材料从低世代开始就对半糯基因和雄性不育恢复基因进行分子标记辅助选择，不仅选择效率高，而且目标基因选择正确率也高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法。

本发明是这样实现的，一种杂交粳稻快速精准选育方法，所述杂交粳稻快速精准选育方法采用半糯型粳稻恢复系。

本发明的另一目的在于提供一种快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法，所述快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法包括：

步骤一，选择含有胚乳低直链淀粉含量纯合基因型wx

步骤二，以南粳9108为轮回亲本母本，F

步骤三，将二次回交获得的BC

步骤四，种植BC

进一步，步骤二中，所述对BC

(1)采用SDS法进行水稻植株基因组DNA的提取；

(2)利用四引物PCR分子标记对提取的DNA进行半糯基因Wx

(3)利用InDel标记引物InDel-Rfla对提取的DNA进行粳稻雄性不育恢复基因Rfla的分子检测，所述引物InDel-Rfla的序列如SEQ.ID.No.3所示。

进一步，所述PCR分子标记四引物序列如下：

正向外引Wx

进一步，步骤(1)中，所述采用SDS法进行水稻植株基因组DNA的提取包括：

(1.1)取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600uL提取液，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；

(1.2)加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30min；加入由氯仿、异戊醇按24:1的比例配置的混合液300～400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；

(1.3)8,000～10,000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清至另一离心管；加入等体积氯仿、异戊醇，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；

(1.4)8,000rpm离心15分钟，转移上清至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000rpm离心6min；

(1.5)弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200uL TE，-20℃保存。

进一步，步骤(1.1)中，所述提取液由20％SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5MNaCl，65℃预热得到。

进一步，步骤(2)中，所述利用四引物PCR分子标记对提取的DNA进行半糯基因Wx

(2.1)PCR扩增提取的水稻基因组DNA，选择半糯基因wx

(2.2)将四条分子标记引物Wx

(2.3)在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，得到检测结果。

进一步，所述选择半糯基因wx

若扩增水稻基因组DNA，同时有439bp和292bp两条特征条带，则为半糯基因wx

若扩增水稻基因组DNA，同时有439bp和200bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因的Wx

若扩增水稻基因组DNA，同时存在439bp、292bp和200bp的三条特征条带，则说明该植株是为暗胚乳突变基因Wx

进一步，步骤(2.1)中，所述PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

进一步，步骤(2.2)中，所述PCR反应体系包括：

PCR反应体系为20μL，具体包括：10ng/μL的DNA 2.0μL，4pmol/μL的引物2.0μL，其中引物Wx

进一步，步骤(3)中，所述利用InDel标记引物InDel-Rfla对提取的DNA进行粳稻雄性不育恢复基因Rfla的分子检测包括：

首先，PCR扩增提取的水稻基因组DNA，选择恢复系基因具有1,145bp特征条带的Rf1a纯合基因型单株；

其次，将InDel标记引物InDel-Rfla加入PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

最后，在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，得到检测结果。

进一步，所述PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、Rf1a基因在55℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min。

进一步，步骤四中，所述对群体中的单株进行分子标记检测，选择含有Wx

将二次BC

进一步，步骤四中，所述选择株系内所有单株都含有Wx

对所述含有wx

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过特定分子标记快速检测方法筛选，采用快速精准高效转育和分子辅助选择来提高育种效率，在粳稻恢复系中实现半糯基因、恢复系基因的有效聚合，加快了育种进程的同时加速了半糯型杂交粳稻在生产中的快速应用。

本发明方法中涉及辅助选择的分子标记均为PCR标记，由于不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，因此操作简便、费用较便宜，更为高效、快捷，同时在选育过程中的各个世代苗期就可以快速、准确实现对半糯基因wx

本发明方法，不仅在半糯型粳稻恢复系选育过程中避免了对恢复基因的测交鉴定，同时也大幅度减少了半糯性筛选的工作量，提高了育种效率，简化了育种程序，降低了劳动强度，缩短了育种年限。

本发明方法针对性强，新育成的半糯型粳稻恢复系R346，在农艺性状、配合力等方面均有较好的表现，利用其与半糯型不育系配制的新组合有一定的杂种优势，且品质达到半糯品种特性。同时半糯型粳稻恢复系的成功研制，可作为优良亲本进一步杂交选育新的同类型恢复系。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的南粳9108//宁恢821/南粳9108BC

图中：A：半糯基因wx

图3是本发明实施例提供的宁恢821//宁恢821/南粳9108BC

图中：C：半糯基因wx

图4是本发明实施例提供的宁恢821//宁恢821/南粳9108BC

图中：G：半糯基因wx

图5是本发明实施例提供的BC

图中：G：半糯基因wx

图6是本发明实施例提供的半糯型粳稻恢复系选育系谱图。

图7是本发明实施例提供的半糯型粳稻恢复系、非半糯型恢复系宁恢821植株形态图；

图中：I：半糯型粳稻恢复系R346；J：非半糯恢复系宁恢821。

图8是本发明实施例提供的半糯型粳稻恢复系与宁恢821米样比较图；

图中：K：半糯型粳稻恢复系R346米样；L：非半糯恢复系宁恢821米样。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的快速精准选育半糯型粳稻恢复系的方法包括以下步骤：

S101，选择含有胚乳低直链淀粉含量纯合基因型wx

S102，以南粳9108为轮回亲本母本，F

S103，将BC

S104，种植BC

步骤S102中，本发明实施例提供的对BC

(1)采用SDS法进行水稻植株基因组DNA的提取；

(2)利用四引物PCR分子标记对提取的DNA进行半糯基因Wx

(3)利用InDel标记引物InDel-Rfla对提取的DNA进行粳稻雄性不育恢复基因Rfla的分子检测，所述引物InDel-Rfla的序列如SEQ.ID.No.3所示。

本发明实施例提供的PCR分子标记四引物序列如下：

正向外引Wx

步骤(1)中，本发明实施例提供的采用SDS法进行水稻植株基因组DNA的提取包括：

(1.1)取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600uL提取液，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；

(1.2)加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30min；加入由氯仿、异戊醇按24:1的比例配置的混合液300～400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；

(1.3)8,000～10,000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清至另一离心管；加入等体积氯仿、异戊醇，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；

(1.4)8,000rpm离心15分钟，转移上清至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000rpm离心6min；

(1.5)弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200uL TE，-20℃保存。

步骤(1.1)中，本发明实施例提供的提取液由20％SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5MNaCl，65℃预热得到。

步骤(2)中，本发明实施例提供的利用四引物PCR分子标记对提取的DNA进行半糯基因Wx

(2.1)PCR扩增提取的水稻基因组DNA，选择半糯基因wx

(2.2)将四条分子标记引物Wx

(2.3)在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，得到检测结果。

步骤S102中，本发明实施例提供的选择半糯基因wx

若扩增水稻基因组DNA，同时有439bp和292bp两条特征条带，则为半糯基因wx

若扩增水稻基因组DNA，同时有439bp和200bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因的Wx

若扩增水稻基因组DNA，同时存在439bp、292bp和200bp的三条特征条带，则说明该植株是为暗胚乳突变基因Wx

步骤1)中，本发明实施例提供的PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

步骤2)中，本发明实施例提供的PCR反应体系包括：

PCR反应体系为20μL，具体包括：10ng/μL的DNA 2.0μL，4pmol/μL的引物2.0μL，其中引物Wx

步骤(3)中，本发明实施例提供的利用InDel标记引物InDel-Rfla对提取的DNA进行粳稻雄性不育恢复基因Rfla的分子检测包括：

首先，PCR扩增提取的水稻基因组DNA，选择恢复系基因具有1,145bp特征条带的Rf1a纯合基因型单株；

其次，将InDel标记引物InDel-Rfla加入PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

最后，在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，得到检测结果。

本发明实施例提供的PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、Rf1a基因在55℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min。

步骤S104中，本发明实施例提供的对群体中的单株进行分子标记检测，选择含有Wx

将二次BC

步骤S104中，本发明实施例提供的选择株系内所有单株都含有Wx

对所述含有wx

下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。

实施例1：

(1)亲本选择

宁恢821，粳稻恢复系，江苏省农业科学院粮食作物研究所育成，2017年获得品种权。该恢复系穗大粒多，恢复力强，花粉量足，稻米品质优，配组优势明显，具有明显的杂种优势，但属于非半糯型恢复系。

南粳9108，半糯型优良食味粳稻品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所育成，2009年育成，该品种米质理化指标根据农业部食品质量检测中心2012年检测：整精米率71.4％，垩白粒率10.0％，垩白度3.1％，胶稠度90毫米，直链淀粉含量14.5％，属半糯类型，为优质食味品种。该品种属于常规稻类型，不含有雄性不育恢复基因。

南粳9108，审定编号为“苏审稻201306”，新品种权号为“CNA20101060.9”；宁恢821，品种权号为“CNA20140156.2”。以上两个品种(系)均为公知公用材料，江苏省农业科学院可提供。

(2)分子标记的开发

1)粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a InDel标记的开发

根据Wang(The Plant cell,2006,18(3):676-687)等的研究结果，利用水稻恢复基因位点Rf1a的基因组信息，设计引物对该位点序列进行PCR扩增并直接测序，获得Rf1a位点的基因组序列。通过序列分析证实，已测序的多个粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系和不育系(同核异质保持系)在Rf1a位点都存在的574bp的碱基差异。利用Rf1a基因的核苷酸序列在水稻基因组网站(Gene Bank,www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载其位于水稻第10染色体长臂所在PAC克隆(P1-derived artificial chromosome，PAC)的核酸序列(OSJNBa0017E08，AC068923)，并对相关序列进行分析；然后，利用Primer Premier 5.0(http://www.premierbiosoft.com)在574bp碱基插入缺失区域的附近，设计、合成相应的插入/缺失标记，并命名为InDel-Rf1a。其正向引物序列为5'-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3'，反向引物序列为5'-TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'，退火温度为55℃。

2)半糯基因Wx

根据关东194和Milky Queen在Wx位点第497位核苷酸(第4外显子)共有的G到A单碱基差异，设计了四引物PCR分子标记，其引物序列为：

正向外引物(Wx-mq-O-F)序列为：

5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'

反向外引物(Wx-mq-O-R)序列为：

5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'

正向内引物(Wx-mq-I-F)序列为：

5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'

反向内引物(Wx-mq-I-R)序列为：

5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。

3)水稻植株基因组DNA的提取水稻植株基因组DNA的提取参照SDS法(DellaportaS L,et al.,PlantMol B iolRep,1983,1(1):19221.)。具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600uL提取液(20％SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5MNaCl，65℃预热)，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇(24:1)300～400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8,000～10,000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400uL左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；8,000rpm离心15分钟，转移上清(400uL左右)至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200uLTE，-20℃保存。

4)PCR扩增和电泳检测

20μL PCR反应体系包括：10ng/μL的DNA2.0μL，4pmol/μL的引物2.0μL，其中基因正、反向引物各1.0μL，10×PCR含有25mmol/LMgCl2的Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，5U/μL的Taq 0.5μL和ddH2O 13.1μL；PCR反应程序包括：PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、(55℃，Rf1a基因；65℃，Wx-mq基因)复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

反应产物在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

(3)半糯型粳稻恢复系的选育过程

1)2015年夏，选用恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a宁恢821为母本，半糯基因突变位点为wx

2)2015年冬，以南粳9108为母本，F

3)2016年夏，种植42株BC

4)2016年冬，种植35株BC

5)2017年夏，种植中选的9个BC

6)2017年冬，种植12个目标单株，形成12个株系(每个株系40株)的480个单株对群体中的单株进行分子标记检测(图5)，恢复系基因型选择具有1,145bp特征条带的Rf1a纯合基因型单株；半糯基因型选择同时有439bp和292bp两条特征条带基因型wx

如图6所示，本发明实施例提供的快速精准选育半糯型粳稻恢复系的育种方法包括以下步骤：

1)进行杂交亲本选择：选择含有半糯突变基因wx

2)杂交：以“南粳9108”作为杂交父本，“宁恢821”作为杂交母本进行杂交获得F

3)回交：第一季，以“南粳9108”为母本，F

4)自交：第三季BC

5)分子标记辅助选择：从第一季开始，对每个世代的单株进行恢复基因Rf1a和半糯基因wx

6)半糯性和恢复力检测：选择具有目标性状的优良单株进行新组合测配，测定半糯性和恢复性，从而获得半糯型粳稻恢复。

表1半糯型恢复系与亲本主要农艺性状和直链淀粉含量的比较

注：Duncan新复极差检测，表中数据后的字母相同表示差异不显著，大写字母表示在0.01水平上差异显著，小写字母表示在0.05水平上差异显著性。

表2半糯型杂交组合F1与非半糯杂交组合F1主要农艺性状与直链淀粉含量的比较

注：Duncan新复极差检测，表中数据后的字母相同表示差异不显著，大写字母表示在0.01水平上差异显著，小写字母表示在0.05水平上差异显著性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。