一种纳米包裹白藜芦醇的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种纳米包裹白藜芦醇的复合物及其制备方法和应用。

背景技术

白藜芦醇(RSV)又称为芪三酚，是一种天然多酚类黄酮化合物，可以在葡萄(红葡萄酒)、桑椹、花生、大黄等植物的种子和皮中找到，白藜芦醇具有抗氧化，抗自由基的作用。白藜芦醇含有顺式和反式异构体，后者被认为是具有生物活性且含量最丰富的。白藜芦醇作为天然的抗氧化剂，最突出的作用就是清除自由基或抑制自由基的形成，延缓肌肤细胞衰老的过程，抑制脂质过氧化并抑制酪胺酸酶的活性，减少黑色素的形成，达到美白、淡斑、保湿等护肤作用。白藜芦醇经静脉注射后，迅速(在不到2小时内)在肝脏和肠上皮细胞中代谢成葡糖醛酸和硫酸盐酚基团的缀合物，然后将该基因缀合物消除。白藜芦醇的生物利用度低，这也限制了其在生物学和药理学中的应用。同时，白藜芦醇水溶性差并且在化学上不稳定，当暴露于高温、pH变化、紫外光或酶中时则被异构化降解。

目前化妆品中的纳米包裹聚乙二醇，是一种合成聚合物，能够将大多数小分子封装成球形纳米粒。聚乙二醇具有良好的水溶性，作为增稠剂、润滑性、溶剂、软化剂和保湿剂广泛用于化妆品中。聚乙二醇通常用作化妆品的护肤底霜。但有报道化妆品中使用聚乙二醇及其衍生物会有一定风险和不利影响。聚乙二醇在破损的皮肤上使用会引起刺激和全身毒性，审查化妆品成分安全性的工业小组得出结论认为，一些聚乙二醇化合物在受损皮肤上使用不安全(尽管评估通常认可这些化学品在化妆品中的使用)。此外，聚乙二醇的作用是渗透增强剂，以增加皮肤的通透性，让更多的产品吸收，这其中也包括有害成分。

卵磷脂(LC)是胆碱的一种，是一种重要的营养物质。卵磷脂能增强大脑活力，消除大脑疲劳，增强记忆力，提高学习工作效率，而且能修复受损伤的脑细胞，预防老年性痴呆症的发生；卵磷脂也是一种天然解毒剂，能分解体内的毒素。通过增加血红素，为皮肤提供充分的水和氧气，使皮肤变得光滑柔润；人体如果缺乏卵磷脂，就会降低皮肤细胞的再生能力，导致皮肤粗糙、有皱纹，如能适当摄取卵磷脂，皮肤再生活力就可以得到保障，皮肤就会更有光泽，且卵磷脂具有良好的亲水性和亲油性，利于渗透作用。另外，卵磷脂所含的肌醇含有毛发的主要营养物质，能抑制脱发，使白发慢慢变黑。由此可见，卵磷脂作为天然纳米载体更安全、具有更好的生物活性。而提供一种对消费者而言完全天然的、安全无害的化妆品添加剂，也具有巨大的市场。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯天然、安全无害的白藜芦醇添加剂及其制备方法，以使白藜芦醇添加剂质量稳定，并具有更好的生物活性和利用效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种纳米包裹白藜芦醇复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将卵磷脂溶液和白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液；

(2)将第一混合液加入到水中，得到第二混合液；

(3)将第二混合液纯化后，即可得到纳米包裹白藜芦醇的复合物。

优选的，所述卵磷脂溶液的浓度为10～40mg/mL，所述白藜芦醇溶液的浓度为10～40mg/mL。

优选的，所述白藜芦醇和卵磷脂的质量比为1:1～10。

优选的，步骤(2)中所述水与第一混合物的体积比为4～6:0.045。

优选的，步骤(3)中所述纯化是将第二混合液进行超滤。

本发明还提供了一种纳米包裹白藜芦醇的复合物。

本发明还提供了所述纳米包裹白藜芦醇的复合物作为化妆品添加剂的应用。

优选的，所述化妆品为面膜、乳液或面霜。

本发明通过将白藜芦醇包裹在卵磷脂中，形成的纳米包裹白藜芦醇的复合物，有持续缓效释放抗氧化成分的效果，和促进抗氧化物经皮渗透的良好作用，在作用皮肤部位的滞留时间增长、提高白藜芦醇的生物利用度；开发得到的纳米包裹白藜芦醇的复合物质量稳定，在4℃下保持3个月其形态和粒径均未见明显变化，38℃下保持25天其形态和粒径均未见明显变化，稳定性良好。而且可以实现白藜芦醇有更好、更高的生物活性。本发明提供的白藜芦醇纳米粒，可用于化妆品中。

附图说明

图1为实施例6中卵磷脂纳米载体的细胞活力统计图；

图2为实施例10中在38℃下放置24天的白藜芦醇纳米粒的尺度变化图；

图3为实施例10中在38℃下放置24天的白藜芦醇纳米粒液；

图4为实施例11白藜芦醇纳米粒的释放动力学曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种纳米包裹白藜芦醇的复合物及其制备方法，制备的白藜芦醇纳米粒产品质量稳定、可缓效释放、生物活性更好、利用效率更高。

本发明所述的卵磷脂购自(上海太伟药业有限公司)，白藜芦醇购自ChemMedExpress，本发明说明书中所用原料及试剂如无特殊说明，均为商业购买。

本发明提供了一种纳米包裹白藜芦醇复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将卵磷脂溶液和白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液；

(2)将第一混合液加入到水中，得到第二混合液；

(3)将第二混合液纯化后，即可得到纳米包裹白藜芦醇的复合物。

本发明在制备纳米包裹白藜芦醇复合物时，先将卵磷脂溶液和白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液。

在本发明中，所述卵磷脂溶液和白藜芦醇溶液均是通过二甲基亚砜增溶得到。

在本发明中，所述卵磷脂溶液的浓度优选为10～40mg/mL，进一步优选为20mg/mL；所述白藜芦醇溶液的浓度优选为10～40mg/mL，进一步优选为20mg/mL。

在本发明中，所述白藜芦醇和卵磷脂的质量比优选为1:1～10，进一步优选为1:1～5，再进一步优选为1:1.25。

制得第一混合液后，将第一混合液加入到水中，得到第二混合液。

在本发明中，所述水与第一混合液的体积比优选为4～6:0.045，进一步优选为5:0.045。

在本发明中，优选将第一混合物滴加到搅拌中的水中。

在本发明中，所述水优选为纯化水。

在本发明中，所述搅拌的速率优选为1000～5000rpm，进一步优选为2000～3000rpm。

制得第二混合液后，将第二混合液纯化后，即可得到纳米包裹白藜芦醇的复合物。

在本发明中，所述纯化优选为超滤。

在本发明中优选采用AmiconFilter(100KDa)进行超滤，以去除二甲基亚砜和未包封的白藜芦醇。第二混合液优选在转速1000～3000转/分钟，进一步优选为2000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余物，即得到卵磷脂包裹白藜芦醇的纳米包裹白藜芦醇复合物。

本发明还提供了一种纳米包裹白藜芦醇的复合物。

本发明还提供了所述纳米包裹白藜芦醇的复合物作为化妆品添加剂的应用。

在本发明中，所述化妆品优选为面膜、乳液或面霜。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)将100mg卵磷脂溶解在10mL的DMSO中，得到10mg/mL的卵磷脂溶液；将100mg白藜芦醇溶解在10mL的DMSO中，得到10mg/mL白藜芦醇溶液；

(2)取25μL卵磷脂溶液，20μL白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液；

(3)在第二容器中，将5mL纯化水以3000rpm搅拌；

(4)将第一混合液滴加至搅拌中的纯化水中，得到第二混合液；

(5)将第二混合液用AmiconFilter(100KDa)进行纯化，去除DMSO和未包封的RSV，该溶液在转速3000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余物，得到纳米包裹白藜芦醇复合物，即白藜芦醇纳米粒。

实施例2

(1)将200mg卵磷脂溶解在10mL的DMSO中，得到20mg/mL的卵磷脂溶液；将200mg白藜芦醇溶解在10mL的DMSO中，得到20mg/mL白藜芦醇溶液；

(2)将25μL卵磷脂，20μL白藜芦醇混合，得到第一混合液；

(3)在第二容器中，将5mL纯化水以2000rpm搅拌；

(4)将第一混合液滴加至搅拌中的纯化水中，得到第二混合液；

(5)将第二混合液用AmiconFilter(100KDa)进行纯化，去除DMSO和未包封的RSV，该溶液在转速2000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余的LC(RSV)，得到纳米包裹白藜芦醇复合物，即白藜芦醇纳米粒。

实施例3

(1)将400mg卵磷脂溶解在10mL的DMSO中，得到40mg/mL的卵磷脂溶液；将400mg白藜芦醇溶解在10mL的DMSO中，得到40mg/mL白藜芦醇溶液；

(2)将25μL卵磷脂，20μL白藜芦醇混合，得到第一混合液；

(3)在第二容器中，将5mL纯化水以1000rpm搅拌；

(4)将第一混合液滴加至搅拌中的纯化水中，得到第二混合液；

(5)将含有LC(RSV)的溶液用AmiconFilter(100KDa)进行纯化，去除DMSO和未包封的RSV，该溶液在转速1000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余的LC(RSV)，得到纳米包裹白藜芦醇复合物，即白藜芦醇纳米粒。

实施例4

(1)将400mg卵磷脂溶解在10mL的DMSO中，得到40mg/mL的卵磷脂溶液；将100mg白藜芦醇溶解在10mL的DMSO中，得到10mg/mL白藜芦醇溶液；

(2)取25μL卵磷脂溶液，20μL白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液；

(3)在第二容器中，将5mL纯化水以3000rpm搅拌；

(4)将第一混合液滴加至搅拌中的纯化水中，得到第二混合液；

(5)将第二混合液用AmiconFilter(100KDa)进行纯化，去除DMSO和未包封的RSV，该溶液在转速3000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余物，得到纳米包裹白藜芦醇复合物，即白藜芦醇纳米粒。

实施例5

(1)将400mg卵磷脂溶解在10mL的DMSO中，得到40mg/mL的卵磷脂溶液；将50mg白藜芦醇溶解在10mL的DMSO中，得到5mg/mL白藜芦醇溶液；

(2)取25μL卵磷脂溶液，20μL白藜芦醇溶液混合，得到第一混合液；

(3)在第二容器中，将5mL纯化水以3000rpm搅拌；

(4)将第一混合液滴加至搅拌中的纯化水中，得到第二混合液；

(5)将第二混合液用AmiconFilter(100KDa)进行纯化，去除DMSO和未包封的RSV，该溶液在转速3000转/分钟下，离心7分钟，间歇洗涤，以去除纳米粒中所有的有机溶剂，离心后，收集剩余物，得到纳米包裹白藜芦醇复合物，即白藜芦醇纳米粒。

实施例6卵磷脂纳米载体的毒性测试

为了确保卵磷脂的安全性，我们首先在体外测试了卵磷脂的细胞毒性。卵磷脂的细胞毒性具体的测试方法为：体外用卵磷脂检测对正常人上皮细胞的增殖实验。将卵磷脂分为九组浓度从8μM到1000μM，用cck8法检测上皮细胞增殖程度。

从图1可看出，卵磷脂即使在高微摩尔浓度(1000μM)下也对细胞无毒，表明卵磷脂不仅是天然的，也是安全的，可供人类使用或食用。

实施例7白藜芦醇纳米粒的毒性测试

本实施例以实施例1制备的白藜芦醇纳米粒为样品测试了：动物模型豚鼠皮肤光毒性试验、动物模型豚鼠的皮肤变态反应试验-局部封闭涂皮试验、动物模型兔的急性皮肤刺激性试验、动物模型兔的急性眼刺激性/腐蚀性试验以及动物模型兔多次皮肤刺激性试验。

(1)动物模型豚鼠皮肤光毒性试验具体测试方法为：

实验前18h～24h，将动物脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常。一共备4块去毛区，每块去毛区约为2cm×2cm。将动物固定，在动物去毛区1和2涂敷0.2mL白藜芦醇纳米粒液体。30min后，左侧(去毛区1和3)用铝箔覆盖，胶带固定，右侧(去毛区2和4)用UVA进行照射。用辐射计量仪在实验动物背部照射区设定6个点测定光强度(mW/cm

本试验中UVA光源波长为365nm，光强度平均值为3.6mW/cm

(2)动物模型豚鼠的皮肤变态反应试验-局部封闭涂皮试验具体测试方法为：

试验前24h，将豚鼠背部左侧去毛，去毛范围2cm×3cm。诱导接触：取0.2mL样品(阳性对照物用0.6％的2,4-二硝基氯苯溶液)涂敷在试验组实验动物去毛区皮肤上，以两层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定6小时。第7天和第14天以同样的方法重复一次。激发接触：末次诱导后14天，取0.2mL样品(阳性对照物用0.3％的2,4-二硝基氯苯溶液)涂敷在试验组和阴性对照组豚鼠背部右侧去毛区，接触前24小时脱毛，然后用两层纱布和一层玻璃纸覆盖，再以无刺激胶布固定6小时。动物观察：激发接触后24小时和48小时观察皮肤反应。实验组20只，对照组16只/雌雄不限。实验动物白色豚鼠，余姚市建飞实验动物养殖场提供，生产许可号：SCXK(浙)2017-0002；饲养环境，普通环境豚鼠房，使用许可证号：SYXK(浙)2018-0003；室温21.0℃～23.6℃，相对湿度54.7％～68.8％。根据皮肤致敏强度等级分级，白藜芦醇纳米粒未见皮肤变态反应。

(3)动物模型兔的急性皮肤刺激性试验具体测试方法为：

实验前24小时，将实验动物背部脊柱两侧被毛去除，去毛范围左右各3cm×3cm。取0.5mL样品涂敷于一侧皮肤，另一侧皮肤作为对照，2小时后去除敷料，用温水清洗接触部位。观察时间去敷料后1小时，24小时，48小时，72小时。按皮肤刺激强度等级分级，观测卵磷脂包裹的白藜芦醇纳米粒对家兔刺激情况。实验动物为新西兰白兔，由桐乡银海兔业提供，生产许可号：SCXK(浙)2018-0002；4只雌雄不限；饲养环境，普通环境豚鼠房，使用许可证号：SYXK(浙)2018-0003；室温21.1℃～23.9℃，相对湿度53.1％～69.3％。按皮肤刺激强度分级，白藜芦醇纳米粒对家兔皮肤刺激强度属无刺激性。

(4)动物模型兔的急性眼刺激性/腐蚀性试验具体测试方法为：

取0.1mL样品滴入兔一侧眼睛结膜囊中，另一侧眼睛作为正常对照。观察时间1h，24h，48h，72h，4d，7d。观察每只动物角膜，虹膜，结膜充血和结膜水肿的积分均值均为0。

实验动物为新西兰白兔，3只雌雄不限，由桐乡银海兔业提供，生产许可号：SCXK(浙)2018-0002；饲养环境，普通环境豚鼠房，使用许可证号：SYXK(浙)2018-0003；室温21.1℃～23.9℃，相对湿度53.1％～69.3％。

(5)动物模型兔多次皮肤刺激性试验具体测试方法为：

实验前24h，将实验动物背部脊柱两侧被毛去除，去毛范围左右各3cm×3cm。取0.5mL原样品涂覆于一测皮肤，另一侧皮肤作为对照，1h后观察结果。每天涂抹一次，连续14天。按皮肤刺激强度分级，该样品对家兔皮肤的刺激性属无刺激性样品。实验动物为新西兰白兔，由桐乡银海兔业提供，生产许可号：SCXK(浙)2018-0002；4只雌雄不限；饲养环境，普通环境豚鼠房，使用许可证号：SYXK(浙)2018-0003；室温21.1℃～23.9℃，相对湿度53.1％～69.3％。按皮肤刺激强度分级，白藜芦醇纳米粒对家兔皮肤刺激强度属无刺激性。

实施例8白藜芦醇纳米粒的粒径测定

为了确定白藜芦醇纳米粒的尺寸，我们通过动态光散射(DLS)进行了粒径分析。如表1所示，白藜芦醇没有显示纳米粒的形成，白藜芦醇在溶液中形成大团聚体。卵磷脂可形成平均粒径约为150nm的纳米粒，而白藜芦醇纳米粒的纳米颗粒尺寸在100nm左右，表明白藜芦醇与卵磷脂之间存在电荷/静电相互作用，导致卵磷脂纳米粒的致密化。

表1：白藜芦醇和卵磷脂包裹前后粒径大小

实施例9白藜芦醇纳米粒的包封率和载药量测定

白藜芦醇在330nm处有独特的紫外吸光度，可用于白藜芦醇浓度的测定。为了确定白藜芦醇的包封率，我们用以下公式计算了白藜芦醇在卵磷脂中的包封量，并与最初使用的白藜芦醇量进行了比较：

由该方程可以估算出白藜芦醇的包封率值在92.5％左右。

根据该方程计算出白藜芦醇的载药量约为18.5wt.％。

实施例10白藜芦醇纳米粒的稳定性

白藜芦醇纳米粒在室温下38℃下保持24天后稳定性好，从包封率与载药量、形态与粒径、表面电性、泄漏率、磷脂的氧化程度等来评价纳米粒子的封装质量。白藜芦醇纳米粒在38℃下保持24天，如图2所示，白藜芦醇纳米粒的尺寸未见明显变化，证明白藜芦醇纳米粒的稳定性好。结合图3可知，溶液中未见聚集或云雾，进一步表明白藜芦醇纳米粒的稳定性好。

实施例11白藜芦醇纳米粒的释放动力学

我们测定了白藜芦醇纳米粒的释放动力学。如图4所示，游离RSV在15分钟后释放70％，而本发明所述的白藜芦醇纳米粒在12小时后释放的白藜芦醇不到50％，表明卵磷脂成功地保护了白藜芦醇从纳米粒中提前释放。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。