在磁性支架上固定化的酶和微粒体

对相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月5日提交的美国临时申请号62/727,519的权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明提供了用于产生用于测量化学化合物的毒性的代谢物的装置和方法。其包含酶微粒体和磁性地捕获酶的磁性纳米颗粒。这些酶系统催化化学物以产生可测量的代谢产物。包含酶的微粒体和磁性纳米颗粒与大孔支架和非反应性组分(促进酶反应)缔合。

背景技术

已开发的许多药物和化学物本身可能是安全的，但可能被代谢为毒素。因此，药物和化学物开发的一个关键方面是早在其进入人体测试阶段或进入消费者市场之前就通过建立化合物的安全性以确保不安全的化合物“快速失效”。每年大约有2,000种新化学物被商业化，快速确定化学物安全性的关键部分是评估人体从原本安全的母体化学物中产生的潜在有毒代谢物的影响。因此，捕获此类化学代谢物(或分解产物)并对其毒性进行筛查对于确保商业化学物(包括药物)的安全性至关重要。当前，可以快速评估体外代谢的工具有限。因此，长期目标是用多种人类异生物质代谢酶改进现有的毒物筛选测定平台。

磁性酶固定化涉及酶在介孔磁性簇中的捕获，所述介孔磁性簇在酶周围自组装。固定化效率取决于许多因素，包括酶和纳米颗粒的初始浓度、酶表面的性质、酶的静电势、纳米颗粒表面和接触时间。用于工业或医学制造的生物催化过程中的酶在过程之前和过程中应高效、稳定、可在几个生物催化循环中重复使用且经济。用于筛选和测试药物或化学物的酶应稳定、可靠、灵敏、经济并且与高通量自动化兼容。

P450催化的反应可以用于确定测试化合物的毒性。细胞色素P450(称为P450或CYP)属于E.C.1.14类酶。(Br.J.Pharmacol.158(Suppl 1):S215–S217(2009)，全文以引用的方式并入本文。)其构成单加氧酶的一个家族，涉及药物、异生物质、烷、萜和芳香族化合物的生物转化。它们还参与化学致癌物的代谢以及生理相关化合物(诸如类固醇、脂肪酸、类花生酸、脂溶性维生素和胆汁酸)的生物合成。此外，它们还参与环境中异生物质例如杀虫剂和其他工业有机污染物的降解。它们通过将一个羟基基团掺入许多代谢途径中发现的底物中来发挥作用。在该反应中，伴随着辅因子(如NAD(P)H)的氧化将双氧还原为一个羟基基团和一个H

单加氧酶是在所有生命系统中充当解毒生物催化剂并引发内源或外源毒性分子降解的关键酶。异生物质的I期代谢包括功能化反应，例如氧化、还原、水解、水合和脱卤。细胞色素P450单加氧酶代表参与75-80％的代谢的最重要的一类酶。其他的I期酶包括单胺氧化酶、含黄素的加氧酶、酰胺酶和酯酶。

II期代谢涉及I期代谢物上极性基团(例如葡萄糖醛酸，硫酸根和氨基酸)的缀合反应(葡萄糖醛酸化，硫酸化，GSH缀合，乙酰化，氨基酸缀合和甲基化)。

近年来，人们对P450生物催化剂的应用越来越感兴趣。通常，P450和大多数代谢氧化性酶都需要辅因子来转化其目标化合物。质子(H

GDH(E.C.1.1.1.47)催化β-D-葡萄糖氧化为β-D-1,5-内酯，同时将NADP+还原为NADPH或将NAD+还原为NADH。FDH(EC1.2.1.2)是指一组催化甲酸氧化为二氧化碳的酶。其将电子捐赠给第二底物，例如NAD+。这些酶，特别是来自真核生物来源的酶，属于在任何酶中具有最低的总转换数的酶。使用细胞色素P450的生物催化反应效率极低，因为底物氧化与副产物活性氧种类(ROS)(例如过氧化氢和超氧化物)的产生相关联。对于真核单加氧酶，大部分来自酶的活化的氧从靶标的氧化中转移出来并转化为ROS，其通过单电子还原的三元复合物的衰变从而产生超氧阴离子自由基(O-2)，而过氧细胞色素P450的质子化和氧的四电子还原从而产生H

与真核P450相比，细菌P450更有效，因为少于10％的总电子摄入被转移至ROS，从而在氧化途径中产生了更高的O

由于产生活性氧种类(ROS)而引起的氧化抑制是P450生物催化的主要限制之一。活性氧种类(ROS)是P450和其他氧化酶(包括NADPH氧化酶(NOX)，脂加氧酶(LOX)和环加氧酶(COX))的代谢反应的主要副产物。活性氧种类(ROS)包括高活性氧自由基[超氧化物(O2·-)，羟基(·OH)，过氧化基(RO2·)，烷氧基(RO·)]和非自由基，它们是氧化剂和/或容易转变为自由基。实例包括次氯酸(HOCl)，臭氧(O

本领域已知的在I、II、III期代谢中产生代谢物的其他代谢酶包括UDP-葡萄糖醛酸基转移酶，磺基转移酶，含黄素的单加氧酶，单胺氧化酶和羧酸酯酶。代谢酶的活性低，离体尤其不稳定。为了高产量和快速地生产用于筛选或生化生产的化学代谢物，P450的浓度历来很高(50％至200％的底物负载)。为了提高目标化合物的氧化速率，氧含量也需要很高，在过化学计量(over-stoichiometric)的浓度。这导致产生超氧化物阴离子，其使酶变性并使反应效率受到限制。

生命科学和制药市场中使用的大多数代谢过程系统都是基于体外培养的肝细胞(例如HepG，HepaRG)。基于细胞的平台的优势在于能够在单个集成平台中共同激活多个生物化学网络，这些网络由代谢酶(CYP，UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)，羧酸酯酶等)的系统组成。具有如此高的生物复杂性的代谢加工增加了模拟肝脏生理的机会。不幸的是，基于体外细胞的系统易受代谢物积聚和细胞应激(由延长的氧化加工引起)所赋予的细胞毒性作用影响。与相应的无细胞的酶促系统相比，这导致了较短的孵育时间(1-2小时)和显著更低的酶促速率

本领域需要用于测量化合物毒性的有效方法，从而以酶法筛选数千种化学物。需要在设备和方法中配置代谢酶以协助高通量毒性筛选。

发明内容

本发明提供了用于产生用于测量化学化合物的毒性的代谢物的装置和方法。其包含酶微粒体和磁性地捕获酶的磁性纳米颗粒。这些酶系统催化化学物以产生可测量的代谢产物。包含酶的微粒体和磁性纳米颗粒与大孔支架和非反应性组分(促进酶反应)缔合。

因此，本发明提供了一种装置，其包含微粒体和磁性纳米颗粒的自组装介孔聚集体，其中在微粒体中含有需要可扩散辅因子的具有第一酶活性的第一酶，其中包含辅因子再生活性的第二酶被磁性捕获在介孔内，其中在第一酶活性中利用该辅因子；其中第一酶和第二酶通过将可扩散的底物转化为可扩散的产物而起作用；其中所述磁性纳米颗粒与大孔支架磁性缔合；其中微粒体与大孔支架缔合；并且其中包含磁性纳米颗粒的大孔支架与非反应性部分缔合，该非反应性部分可操作用于将大孔支架置于反应溶液中或从反应溶液中取出。

在本发明的一些实施方案中，所述装置还包括用于稳定地维持所述微粒体，所述磁性纳米颗粒，所述第一酶，所述第二酶和所述大孔支架的功能部分。在优选的实施方案中，所述功能部分包括缓冲剂。在其他优选的实施方案中，所述功能部分包含所述第二酶的底物。在其他优选的实施方案中，所述功能部分包含辅因子。在其他优选的实施方案中，所述功能部分是磁性的。

在本发明的一些实施方案中，将所述辅因子与所述第一酶和第二酶一起捕获在磁性纳米颗粒的介孔聚集体中。

在本发明的一些实施方案中，所述大孔支架形状为圆柱形柱销(pin)，球，珠，胶囊，立方体，方棒，棱锥，菱形或无定形。在一个优选的实施方案中，所述大孔支架形状为圆柱形柱销。

在本发明的一些实施方案中，所述非反应性部分包括金属，塑料，陶瓷，复合材料或其组合。在其他实施方案中，所述非反应部分包含用于操纵装置的手柄。在其他实施方案中，所述非反应部分可操作用于由机械臂操纵以进行高通量筛选。在其他实施方案中，所述非反应部分允许气体扩散。

在本发明的一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒的介孔聚集体具有氧化铁组成。在其他实施方案中，所述磁性纳米颗粒的介孔聚集体具有其中至少90％的磁性纳米颗粒有至少3nm且多达30nm的尺寸的磁性纳米颗粒尺寸分布，以及其中至少90％的磁性纳米颗粒介孔聚集体有至少10nm且多达500nm的尺寸的聚集的颗粒尺寸分布。

在本发明的一些实施方案中，磁性纳米颗粒的介孔聚集体具有至少10emu/g的饱和磁化强度。在其他实施方案中，磁性纳米颗粒的介孔聚集体具有多达5emu/g的残余磁化强度。

在本发明的一些实施方案中，所述第一酶和第二酶以多达饱和容量的100％包含在磁性纳米颗粒的介孔聚集体中。

在本发明的一些实施方案中，所述第一酶和第二酶是微生物实体上不可接近的。

在本发明的一些实施方案中，所述第一酶是氧化性酶。在优选的实施方案中，所述氧化性酶是含黄素的加氧酶；其中组合物还包含与所述第一酶共定位的具有辅因子还原酶活性的第三酶。在其他优选的实施方案中，所述氧化性酶是P450单加氧酶；其中组合物还包含与所述第一酶共定位的具有辅因子还原酶活性的第三酶。

在本发明的一些实施方案中，单个蛋白质包含所述P450单加氧酶和所述第三酶。在其他实施方案中，所述P450单加氧酶与第三酶在脂质膜内共定位。

在本发明的一些实施方案中，所述第三酶是细胞色素P450还原酶。在其他实施方案中，所述P450单加氧酶包含哺乳动物的P450序列。

在一个优选的实施方案中，所述P450单加氧酶包含人的P450序列。在另一个优选实施方案中，所述P450单加氧酶包含CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2A7,CYP2A13,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C18,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP2F1,CYP2J2,CYP2R1,CYP2S1,CYP2U1,CYP2W1,CYP3A4,CYP3A5,CYP3A7,CYP3A43,CYP4A11,CYP4A22,CYP4B1,CYP4F2,CYP4F3,CYP4F8,CYP4F11,CYP4F12,CYP4F22,CYP4V2,CYP4X1,CYP4Z1,CYP5A1,CYP7A1,CYP7B1,CYP8A1,CYP8B1,CYP11A1,CYP11B1,CYP11B2,CYP17A1,CYP19A1,CYP20A1,CYP21A2,CYP24A1,CYP26A1,CYP26B1,CYP26C1,CYP27A1,CYP27B1,CYP27C1,CYP39A1,CYP46A1,或CYP51A1。

在本发明的一些实施方案中，所述P450单加氧酶包含P450序列，该P450序列的来源选自灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马，牛，绵羊和山羊。在其他实施方案中，P450单加氧酶包含P450序列，该P450序列的来源选自昆虫，鱼，真菌，酵母，原生动物和植物。

如权利要求1至30中任一项所述的装置，其中所述第二酶选自羰基还原酶，醛脱氢酶，芳基醇脱氢酶，醇脱氢酶，丙酮酸脱氢酶，D-1木糖脱氢酶，氧化戊二酸脱氢酶，异丙醇脱氢酶，葡萄糖6-磷酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶，苹果酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，苯甲醛脱氢酶，谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶。

在本发明的一些实施方案中，所述辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+氢(NADH)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸+氢(NADPH)，黄素腺嘌呤二核苷酸+氢(FADH)或谷胱甘肽。

在本发明的一些实施方案中，所述第一酶参与I期代谢。

本发明的一些实施方案提供了参与II期代谢的第三酶。

本发明的一些实施方案提供了还原活性氧种类(ROS)的第四酶。在其他实施方案中，第四酶是过氧化氢酶，超氧化物歧化酶(SOD)或谷胱甘肽过氧化物酶/谷胱甘肽-二硫化物还原酶或其组合。

本发明的一些实施方案提供了第五酶，其选自UDP-葡萄糖醛酸转移酶，磺基转移酶，单胺氧化酶和羧酸酯酶。

在本发明的一些实施方案中，所述大孔支架是磁性大孔支架。在其他实施方案中，所述大孔磁性支架是聚合性杂合支架，其包含交联的水不溶性聚合物和大致均匀分布的嵌入的磁性微粒(MMP)。在其他实施方案中，所述磁性大孔聚合性杂合支架包含PVA和选自CMC、藻酸盐、HEC、EHEC的聚合物。在其他实施方案中，所述磁性大孔聚合性杂合支架包含亲水性聚合物。在其他实施方案中，所述亲水性聚合物是黄原胶。

在本发明的一些实施方案中，一种或多种酶是通过重组DNA技术产生的。在其他实施方案中，一种或多种酶是合成的。

在本发明的一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒包含人肝微粒体(HLM)或来自人肝细胞溶质级分(HLCF)的酶。

本发明提供了一种利用本文公开的装置测量化合物的代谢物的毒性的方法，该方法包括在反应溶液中将化合物与可扩散底物混合，使包含磁性纳米颗粒的大孔支架与可扩散底物接触，和测量由溶液中的酶促反应产生的产物。

在一些实施方案中，该方法进一步包括从溶液中取出包含微粒体和磁性纳米颗粒的大孔支架的步骤。在其他实施方案中，该方法被并入高通量筛选方法中，以筛选多种化合物的毒性。在其他实施方案中，该方法被并入用于从代谢酶的混合物中筛选代谢物的高通量筛选方法中。

本发明提供一种制造本文公开的装置的方法，该方法包括将第二酶磁性地捕获在磁性纳米颗粒的介孔聚集体中，将聚集体(与第二酶一起)与包含第一酶的微粒体组合，将聚集体和微粒体模板化(template)到大孔支架上，并将支架模板化到非反应性部分上。

在本文公开的方法的一些实施方案中，所述聚集体还包含具有辅因子还原酶活性的第三酶。在其他实施方案中，所述聚集体还包含第四酶，其为过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)或谷胱甘肽过氧化物酶/谷胱甘肽-二硫化物还原酶。在其他实施方案中，所述聚集体还包含参与II期代谢的第五酶。

附图说明

图1A显示了在用大孔功能性尖端功能化之前的用于2ml管的柱销。图1B示出了用大孔支架功能化的柱销的图。

图2A是微板96柱销阵列的侧视图。图2B是微板96柱销阵列的底部透视图。

图3A和图3B从不同的角度显示了功能化柱销的图片。图3C显示了2ml管中的功能化柱销。

图4A示出了具有菱形形状的涂层材料的侧视图的扫描电子显微图(SEM)。图4B示出了侧表面的SEM。图4C示出了顶部表面的SEM。图4D示出了不良壁(poor wall)的SEM。

图5使用荧光测定法测定的固定化的CYP3A4的储存和稳定性分析，所述荧光测定法测量7-乙氧基试卤灵(7-ethoxyresorufin)(7-ER)至试卤灵(resorufin)(RFN)的脱烷基化。第一组的条(A)表示固定化的CYP3A4在4℃存储。第二组的条(B)显示在-20℃存储。第三组的条(C)显示在-80℃存储。

图6显示了使用包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6DH)，过氧化氢酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)和固定化的NADP的自足的酶系统在37℃孵育1小时和18小时后的CYP3A4活性。固定条件：(1)pH为11的250μg/ml纳米颗粒，和(2)pH为11的1000μg/ml纳米颗粒。显示在7天的稳定性。

图7显示了在37℃下1小时反应中游离的和固定化的人肝微粒体的CYP3A4活性。

图8A显示了CYP2B6在＜10μm磁铁矿粉末上的固定化产率和在相同蛋白质浓度下与游离CYP2B6相比的固定化的CYP2B6的相对活性。图8B显示了以发光单位测量的固定化的CYP2B6和游离CYP2B6活性。

图9固定化的CYP2B6保留了大于或等于50％的新鲜游离CYP2B6的活性。

图10A显示了UGT1A6在<10μm磁铁矿粉末上的固定化产率以及在相同的蛋白质浓度下与游离UGT1A6相比固定化的UGT1A6的相对活性。图10B显示了以发光单位测量的固定化的UGT1A6和游离UGT1A6活性。

图11显示了固定化的UGT1A6保留了大于或等于50％的新鲜游离UGT1A6的活性。

图12A显示CYP3A4的固定化产率，一式两份测定，分别对应于固定化缓冲液pH7.0、pH 7.5和pH 8.0为97％±0.4％、91％±5％和92％±0.5％。

图12B显示在相同的蛋白质浓度下，相对于游离CYP3A4酶的固定化的CYP3A4活性，分别对应于固定化缓冲液pH7.0、pH 7.5和pH 8.0为35％±3％、30％±3％和36％±5％。

图13A显示了相对于游离CYP3A4，在-20℃储存的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天后分别保留了46％±4％、39％±3％、46％±1％和53％±3％的活性。相对于新鲜固定的CYP3A4，在-20℃储存的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天后分别保留了63％±6％、53％±4％、62％±1％和72％±4％的活性。

图13B显示了相对于游离CYP3A4，固定化的CYP3A4冷冻干燥后保存在4℃在1、3、7和14天后分别保留了18％±12％、23％±1％、23％±0％和19％±4％的活性。相对于新鲜固定的CYP3A4，固定化的CYP3A4冷冻干燥后保存在4℃在1、3、7和14天后分别保留了25％±16％、31％±2％、31％±0.3％和25％±6％的活性(图13B)。

发明详述

本发明提供了用于产生代谢物以随后测量化学化合物的毒性的装置和方法。包含酶的微粒体和磁性纳米颗粒与大孔支架和非反应性组分(促进酶反应)缔合。

本发明提供了用于固定和稳定用于生物催化过程的酶的通用平台。无细胞技术的工作原理是将酶或酶混合物的分子捕获在模板化到磁性载体上的自组装纳米颗粒(NP)簇中，而无需蛋白质修饰或共价偶联。离子强度、缓冲液pH和NP浓度是控制簇大小和固定化产率的主要参数。磁性材料允许以不同的规模(从纳米到宏观)自组装，以精确控制酶的负载、稳定性和活性。Corgie等人,Catalysis&Biocatalysis–Chemistry Today 34(5):15-20(2016)在此全文引入作为参考。该技术现已扩展到无细胞代谢谱分析，以通过固定的CYP和自足的代谢酶系统进行下游高通量毒理学筛查。

无细胞代谢谱分析与基于细胞的方法相比具有一些优点。由于无细胞酶不受竞争背景细胞维持和增殖过程的限制，因此无细胞系统中的酶转化率(例如，CorningSupersomes https://www.corning.com/worldwide/en/products/life-sciences/products/adme-tox-research/recombinant-metabolic-enzymes.html)产生的代谢物量通常比人类原代肝细胞(hPH)高10倍，后者是代谢、清除和肝毒性的“金标准”。这是在1-2小时的孵育时间进行测量的。此外，底物、代谢物和活性氧种类(ROS)的细胞毒性负荷限制了代谢寿命。

另一个优势是代谢多态性。增加和维持酶组分的受控比率的能力使得能够制定组织/器官特异性代谢谱并解决人类代谢的遗传多样性。另外，通过调节酶浓度可以容易地获得低、中和高代谢活性水平。除了肝脏代谢外，其他器官或体腔的代谢酶构建体也可以很容易地获得。这包括胃肠道或甚至微生物群系(通过添加细菌代谢酶)。

另一个优势是测试设计和处理。与复杂的细胞生长培养基(例如DMEM)相比，无细胞酶反应系统的组成(缓冲液，盐，糖，辅因子)简单且可控。更干净的化学谱可简化数据和模式分析，从而获得更稳健的统计。不存在细胞过程会产生低背景代谢组，其是亲本底物和所选酶(一种或多种)特异性的，从而产生更稳健的剂量应答谱，尤其是在孵育时间更长的情况下。

在一些实施方案中，本文公开的装置和方法用于无细胞毒理学筛选中。在其他实施方案中，其与基于细胞的解决方案并行使用。在一些实施方案中，基于细胞的测定用作毒性代谢物的广泛的第一筛选。然后，无细胞代谢物筛选可以用作一种精细的机械方法，以鉴定超出基本情况范围的代谢物。与HT筛选相结合，使用代谢酶组合的无细胞谱分析可以从每种化学底物产生一系列代谢组，从而(1)快速捕获人代谢组的多态性，并且(2)可以阐明复杂代谢途径的代谢产物。本发明支持毒性试验中动物的减少、改良或替代，以及对异常代谢谱中潜在毒性代谢物的早期认识。

市售的无细胞代谢酶(包括人肝微粒体(HLM)，人重组微粒体和纯化的人重组CYP单加氧酶)是众所周知地不稳定并且仅在1-2小时的孵育时间内保持其活性。人肝微粒体也是稀有且昂贵的，因为其是从代表群体的源自尸体的合并肝微粒体级分产生的。由于产生作为副产物的抑制性活性氧种类(ROS)—过氧化氢和超氧化物，人CYP尤其具有非常低的总转换数。延长CYP的代谢活性是产生足够量的代谢物以确保充分的分析检测的主要障碍，特别是在低清除代谢物的情况下。

在一些实施方案中，本发明使用稳定化的合成酶系统产生化学代谢物，所述合成酶系统固定在大孔支架上，所述大孔支架被设计为与自动操作的高通量(HT)毒性测定法或化学分析兼容。在其他实施方案中，大孔支架不是设计用于自动操作的HT测定，而是用于较小规模的台式分析。

包含磁性固定的酶的自组装介孔纳米簇在使用之前和使用期间是高度活性和稳定的。磁性固定的酶不需要结合剂即可掺入由磁性纳米颗粒(MNP或NP)形成的自组装介孔中。不需要对酶的永久性的化学修饰或交联到MNP。该技术是生物化学、纳米技术和生物工程学在三个集成级别上的架构的联合：1级是酶(以及在一些情况下辅因子)与MNP的自组装，用于合成磁性介孔纳米簇。该级别使用分子自我捕获的机制来固定酶和辅因子。固定在自组装磁性纳米颗粒中的酶在本文中称为“生物纳米催化剂”(BNC)。2级是将MNP或微粒体稳定化为其他组件，例如磁性或聚合物基质。在某些实施方案中，将BNC或微粒体“模板化”到用于商业或其他应用的微观或宏观结构之上或之中。在一个实施方案中，2级模板是磁性微粒(MMP)。3级是使用1+2级固定化酶的产物调理。

在一个实施方案中，第一步是将CYP微粒体与1级G6DH-ROS再循环酶系统组合。将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6DH)共固定化以确保在簇中共定位，以实现有效的NADPH再循环系统。G6DH可确保在较长的孵育时间(例如18小时)内提供NADPH。将纳摩尔浓度的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)共固定化以确保活性氧种类(ROS)清除。这种组合确保了自足反应所需的所有酶的共定位。

在该实施方案中，第二步骤稳定了1级和2级磁性材料上的微粒体。将NP簇(1级)通过磁性自组装在更大的多孔磁性支架(2级)上模板化，以防止过度聚集，稳定簇和酶，并允许易于处理固定化的酶。2级磁性材料需要通过保持磷脂膜的完整性而适于微粒体吸附。微粒体通过静电和/或疏水相互作用被有效地吸附到2级。

在一些实施方案中，重组人CYP酶系统固定在3D打印的磁性柱销上，用于小体积的代谢加工。所述柱销具有非反应部分，用于支持或操纵。在其他实施方案中，所述柱销呈96柱销阵列，用于在与自动操纵和下游分析兼容的96孔微板中进行代谢谱分析。增材制造(Additive manufacturing)(也称为3D打印)是一种新兴的工业生产方法，通过实现其他制造方法无法获得的设计和组成，适合于大规模生物技术应用。固定化可稳定酶，使其易于使用(“插入，孵育，分析”)，并防止酶进入产物流。

在其他实施方案中，对象化学物的无细胞代谢是通过柱销固定化的微粒体的组合完成的。在优选的实例中，所述微粒体组合可以包括CYP3A4，CYP2B6，CYP2E1，UGT1A6，与1级CAT，SOD和GDH组合。CYP3A4是细胞色素P450酶家族的成员。该家族中的酶是参与药物代谢的单加氧酶。

在一些实施方案中，本发明提供了用于微板应用的可印刷3D柱销。在优选的实施方案中，由磁铁矿组成的大孔性较高的2级支架粉末材料(颗粒尺寸100nm，50％w/w)被嵌入冻干的聚乙烯醇-纤维素交联的复合材料中(称为整体式(monolith)支架)。在一些实施方案中，所述粉末需要外部自动磁力搅拌器。在其他实施方案中，CYP被固定在通过立体平版印刷(SLA)从甲基丙烯酸酯树脂(Formlabs https://formlabs.com/store/us/form-2/materials/clear)印刷的圆柱形柱销(例如

在一些实施方案中，本发明的BNC在磁性大孔聚合性杂合支架中提供，所述磁性大孔聚合性杂合支架包含交联的水不溶性聚合物和大致均匀分布的包埋的磁性微粒(MMP)。所述聚合物至少包含聚乙烯醇(PVA)，具有约50-500nm尺寸的MMP，约1至约50μm尺寸的孔，约20％至95％w/w的MMP，其中所述支架包含用于掺入生物纳米催化剂(BNC)的有效表面积，约总共1-15m

在优选的实施方案中，所述交联的水不溶性聚合物基本上是聚乙烯醇(PVA)。在更优选的实施方案中，所述支架还包含选自聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚丙烯酸，聚丙烯酸酯盐，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸酯盐，聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙酸乙烯酯，聚氟乙烯，聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，酚树脂，间苯二酚甲醛树脂，聚酰胺，聚氨酯，聚酯，聚酰亚胺，聚苯并咪唑，纤维素，半纤维素，羧甲基纤维素(CMC)，2-羟乙基纤维素(HEC)，乙基羟乙基纤维素(EHEC)，木聚糖，壳聚糖，菊粉，葡聚糖，琼脂糖，藻酸，藻酸钠，聚乳酸，聚乙醇酸，聚硅氧烷，聚二甲基硅氧烷和聚磷腈的聚合物。

在其他更优选的实施方案中，所述磁性大孔聚合性杂合支架包含PVA和CMC，PVA和藻酸盐，PVA和HEC，或PVA和EHEC。大孔聚合性杂合支架在美国临时申请号62/323,663中教导，其全部内容通过引用合并于此。

MNP允许在生物催化过程中使用酶的更宽范围的操作条件，例如温度，离子强度，pH和溶剂。MNP的大小和磁化会影响BNC的形成和结构。这对所捕获的酶的活性具有重大影响。由于其在各种反应条件下的惊人顺应性，自组装的MNP簇可以用作酶的优良固定化材料，取代聚合树脂，交联凝胶，交联酶聚集体(CLEA)，交联磁珠等等。此外，它们可用于酶在可扩散底物上的任何应用。

BNC含有介孔，其是成簇的磁性纳米颗粒之间的间隙空间。酶被固定在磁性BNC的至少一部分介孔内。如本文所使用的，术语“磁性”涵盖所有类型的有用的磁性性质，包括永久磁性，超顺磁性，顺磁性和铁磁性行为。

本发明的BNC尺寸为纳米级，即通常不超过500nm。如本文所用，术语“尺寸/大小”可以指的是当磁性纳米颗粒为近似或基本上是球形时的磁性纳米颗粒的直径。在磁性纳米颗粒不是近似或基本是球形(例如，基本上是卵形或不规则)的情况下，术语“尺寸/大小”可以指磁性纳米颗粒的最长维度或三个维度的平均值。术语“尺寸/大小”还可以指磁性纳米颗粒群中计算出的平均尺寸。

在不同的实施方案中，所述磁性纳米颗粒的尺寸为精确地、约、多达或小于例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm，或由前述示例性尺寸中的任何两个限定的范围内的尺寸。

在BNC中，各个磁性纳米颗粒可以是具有以上提供的任何尺寸的初级纳米颗粒(即初级微晶)。BNC中纳米颗粒的聚集体的尺寸大于纳米颗粒的尺寸，并且通常具有至少约5nm的尺寸(即，二级尺寸)。在不同的实施方案中，聚集体的尺寸为精确地、约、至少、大于、多达或小于例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm，或由前述示例性尺寸中的任何两个限定的范围内的尺寸。

通常，初级和/或聚集的磁性纳米颗粒或其BNC具有尺寸分布，即，它们通常在尺寸上狭窄或广泛地分散。在不同的实施方案中，初级或聚集体尺寸的任何范围可以构成初级或聚集体尺寸的总范围的主要或次要部分。例如，在一些实施方案中，特定范围的初级颗粒尺寸(例如，至少约1、2、3、5或10nm，和多达约15、20、25、30、35、40、45或50nm)，或特定范围的聚集颗粒尺寸(例如，至少约5、10、15或20nm和多达约50、100、150、200、250或300nm)构成初级颗粒尺寸总范围的至少或大于约50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或100％。在其他实施方案中，特定范围的初级颗粒尺寸(例如，小于约1、2、3、5或10nm，或大于约15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定范围的聚集颗粒尺寸(例如，小于约20、10或5nm，或大于约25、50、100、150、200、250或300nm)构成初级颗粒尺寸总范围的不超过或小于约50％，40％，30％，20％，10％，5％，2％，1％，0.5％或0.1％。

磁性纳米颗粒的聚集体(即“聚集体”)或其BNC可以具有任何程度的孔隙度，包括基本上缺乏孔隙度，取决于制成其的个体初级微晶的量。在特定的实施方案中，所述聚集体通过包含间隙介孔(即，位于初级磁性纳米颗粒之间的介孔，通过堆积布置而形成)是介孔性的。所述介孔的尺寸通常至少为2nm且多达50nm。在不同的实施方案中，所述介孔的孔尺寸可以是精确地或大约为例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm，或孔尺寸在由前述示例性孔尺寸中的任何两个限定的范围内。与颗粒尺寸的情况相似，介孔通常具有尺寸分布，即它们通常在尺寸上狭窄或广泛地分散。在不同的实施方案中，介孔尺寸的任何范围可以组成介孔尺寸或总孔体积的总范围的主要或次要比例。例如，在一些实施方案中，介孔尺寸的特定范围(例如，至少约2、3或5，并且多达8、10、15、20、25或30nm)构成介孔尺寸的总范围或总孔体积的至少或大于约50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或100％。在其他实施方案中，介孔尺寸的特定范围(例如，小于约2、3、4或5nm，或大于约10、15、20、25、30、35、40、45或50nm)构成介孔尺寸的总范围或总孔体积的不超过或小于约50％，40％，30％，20％，10％，5％，2％，1％，0.5％或0.1％。

所述磁性纳米颗粒可以具有本领域已知的任何组成。在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒是或包括磁性的零价金属部分。这样的零价金属的一些例子包括钴，镍和铁，以及它们的混合物和合金。在其他实施方案中，所述磁性纳米颗粒是或包括磁性金属的氧化物，例如钴，镍或铁的氧化物，或其混合物。在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒具有不同的核心和表面部分。例如，所述磁性纳米颗粒可以具有由元素铁，钴或镍组成的核心部分，以及由钝化层(例如金属氧化物或贵金属涂层，例如金、铂、钯或银层)组成的表面部分。在其他实施方案中，金属氧化物磁性纳米颗粒或其聚集体涂覆有贵金属涂层的层。所述贵金属涂层可以例如减少磁性纳米颗粒表面上的电荷数量，这可以有益地增加溶液中的分散性并更好地控制BNC的尺寸。贵金属涂层保护磁性纳米颗粒免受氧化，通过浸取或通过螯合的增溶(当在生物化学反应或过程中使用螯合有机酸例如柠檬酸盐、丙二酸盐或酒石酸盐时)。所述钝化层可以具有任何合适的厚度，并且特别地，至少、多达、或小于例如约0.1nm，0.2nm，0.3nm，0.4nm，0.5nm，0.6nm，0.7nm，0.8nm，0.9nm，1nm，2nm，3nm，4nm，5nm，6nm，7nm，8nm，9nm或10nm，或由这些值中的任何两个限定的范围内的厚度。

可用于本发明的磁性材料是本领域众所周知的。非限制性实例包括铁磁和铁磁材料，包括矿石，例如铁矿石(磁铁矿或磁石)，钴和镍。在其他实施方案中，使用稀土磁体。非限制性实例包括钕，钆，钷，钐-钴，钕-铁-硼等。在另外的实施方案中，所述磁体包括复合材料。非限制性示例包括陶瓷，铁素体和铝镍钴合金磁体。在优选的实施方案中，所述磁性纳米颗粒具有氧化铁组合物。所述氧化铁组合物可以是本领域已知的任何磁性或超顺磁性氧化铁组合物，例如磁铁矿(FesO/O，赤铁矿(α-Fe2θ3)，磁赤铁矿(γ-Fe2C>3)，或根据式AB

在一些实施方案中，通过利用超顺磁性NP的不稳定性来形成BNC。磁铁矿的零电荷点(PZC)的pH值为7.9，在该点附近，磁性NP不能互相排斥并且容易聚集。NP在PZC之下带正电，在PZC之上带负电。簇的形成可以由静电相互作用驱动。酶表面来自带电氨基酸的相反的静电荷可以补偿NP的表面电荷。酶可以同化为中和多个NP电荷的聚阴离子或聚阳离子。每种酶都有自己的等电点(pI)和带电荷氨基酸的表面组成，这会触发纳米颗粒的聚集。然后可以将酶捕获并稳定在介孔簇中。初始NP和酶浓度、pH和离子强度是控制聚集速率和最终簇大小的主要参数。簇的大小极大地影响了反应的效率，这是因为底物和产物进入和离开簇的质量传递限制。可以将它们从100nm调整为10μm簇，以控制酶的负载和底物扩散速率。

被捕获的酶称为1级。刚性支架中的“锁定”簇可能是由于将它们模板化到更大或更稳定的磁性或聚合物支架上或内部而产生的，称为2级。这防止了过度聚集并增加了物质的磁化，以易于被外部磁体捕获。

在特定的实施方案中，将上述磁性纳米颗粒的介孔聚集体(BNC)掺入到连续的大孔支架中，以形成具有第一和第二级组装的分级催化剂组装。在BNC中可以发现第一级组装。在将BNC掺入连续的大孔支架中发现第二级组装。在一些实施方案中，2级组装是磁性的。

如本文中用于大孔磁性支架的术语“连续的”表示不是颗粒组装的材料，即，不是由彼此组装以形成宏观结构的颗粒或离散物体构成的材料。与微粒组装相反，连续结构在大孔周围基本上是无缝且均匀的，所述大孔周期性地中断了该无缝且均匀的结构。因此，连续支架中的大孔不是凝聚颗粒之间的间隙空间。然而，连续支架可以由较小的初级连续支架组装或聚集构成，只要初级连续支架的组装或聚集不包括由初级连续支架之间的间隙空间形成的大孔(例如，大于约50nm且多达约100)。特别是在无机材料(例如陶瓷或元素材料)的情况下，连续支架也可包含或可不包含结晶区域或相界。

在特定的实施方案中，将上述磁性纳米颗粒的介孔聚集体(BNC)掺入到连续的大孔支架中，以形成具有第一和第二级组装的分级催化剂组装。在BNC中可见第一级组装。在将BNC掺入连续的大孔支架中可见第二级组装。至少通过BNC的存在，整体分级催化剂组装是磁性的。

大孔支架包含尺寸大于50nm的大孔(即，宏观尺度尺寸的孔)。在不同的实施方案中，大孔的尺寸为精确地、约，至少，大于，多达或小于例如60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，150nm，200nm，300nm，400nm，500nm，600nm，700nm，800nm，900nm，1微米(1μm)，1.2μm，1.5μm，2μm，3μm，4μm，5μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm或100μm，或由前述示例性尺寸中的任何两个限定的范围内的尺寸。

大孔支架可以具有任何合适的尺寸，只要它可以容纳大孔即可。在典型的实施方案中，大孔支架具有至少一个宏观尺度的尺寸维度。所述至少一个宏观尺度的维度为大于50nm，并且可以是上文为大孔提供的任何值，并且特别地，维度为精确地、约，至少、大于、多达或小于，例如，1μm，2μm，3μm，4μm，5μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm，100μm，200μm，300μm，400μm，500μm，600μm，700μm，800μm，900μm，1mm，2mm，5mm或1cm，或由前述示例性尺寸中的任何两个限定的范围内的尺寸。在只有一个或两个尺寸维度处于宏观尺度时，其余的一个或两个维度可以处于纳米尺度，例如以上为磁性纳米颗粒提供的任何值(例如，独立地、精确地、约、至少、高于、多至、或小于，例如，1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100nm，或由前述值中的任何两个限定的范围内的值)。在一些实施方案中，大孔支架的至少两个或全部尺寸维度为宏观尺度。

在第一组实施方案中，其中并入BNC的连续大孔支架是磁性的，即，即使在不存在BNC的情况下也是如此。连续的大孔支架可以是磁性的，例如通过由磁性聚合物组合物组成。磁性聚合物的一个例子是PANiCNQ，它是四氰二甲基苯醌(tetracyanoquinodimethane)(TCNQ)和基于翠绿亚胺的形式的聚苯胺(PANi)的组合，这在本领域中是众所周知的。备选地或另外，通过将不属于BNC的磁性颗粒嵌入其中，连续的大孔支架可以是磁性的。不属于BNC的磁性颗粒可以是例如，不与FRP酶或任何酶相缔合的磁性纳米颗粒或微米颗粒。磁性微粒可具有如上文针对大孔所提供的尺寸或尺寸分布，尽管与大孔尺寸无关。在特定的实施方案中，磁性微粒尺寸为约、精确地、或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、100、200、300、400、500、600、700，800、900、1000nm或上述示例性尺寸中的任何两个限定的范围内的尺寸。在一些实施方案中，连续的大孔支架具有嵌入其中的磁性微粒，所述磁性微粒被吸附到至少一部分BNC，或者其中磁性微粒不与BNC缔合或不被吸附到BNC。

在第二组实施方案中，其中并入了BNC的连续支架是非磁性的。然而，至少通过并入其中的BNC的存在，包含非磁性支架的整体分级催化剂组装保持磁性。

在一个实施方案中，连续的大孔支架(或其前体)具有聚合物组合物。聚合物组合物可以是本领域已知的任何固体有机、无机或杂合有机-无机聚合物组合物，并且可以是合成的或生物聚合物，其充当粘合剂。优选地，聚合物大孔支架在意图将分级催化剂用于其中的水或其他介质中不溶解或降解。合成有机聚合物的一些示例包括乙烯基加成聚合物(例如，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚丙烯酸或聚丙烯酸酯盐，聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯盐，聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯醇等)，含氟聚合物(例如，聚氟乙烯，聚偏氟乙烯，聚四氟乙烯等)，环氧化物(例如酚树脂，间苯二酚-甲醛树脂)，聚酰胺，聚氨酯，聚酯，聚酰亚胺，聚苯并咪唑及其共聚物。生物聚合物的一些例子包括多糖(例如，纤维素，半纤维素，木聚糖，壳聚糖，菊粉，葡聚糖，琼脂糖和藻酸)，聚乳酸和聚乙醇酸。在纤维素的特定情况下，纤维素可以是微生物或藻类衍生的纤维素。无机或杂合的有机-无机聚合物的一些实例包括聚硅氧烷(例如，通过溶胶凝胶合成制备的，例如聚二甲基硅氧烷)和聚磷腈。在一些实施方案中，以上提供的任何一种或多种类别或特定类型的聚合物组合物被排除作为大孔支架。

在另一个实施方案中，连续的大孔支架(或其前体)具有非聚合物组成。非聚合物组成可具有例如陶瓷或元素组成。陶瓷组成可以是结晶的、多晶的或无定形的，并且可以具有本领域已知的任何组成，包括氧化物组成(例如氧化铝，氧化铍，铈土，氧化钇或氧化锆)和非氧化物组成(例如碳化物、硅化物、氮化物、硼化物或硫化物组成)。元素组成也可以是晶体、多晶或无定形的，并且可以具有任何合适的元素组成，例如碳、铝或硅。

在其他实施方案中，BNC驻留在非连续的大孔支撑物中，该支撑物包含磁性微粒(MMP)的组装(即，聚集)(或由其构建)，其包括大孔作为磁性微粒之间的间隙空间。磁性微粒通常是铁磁性的，并且可以由磁铁矿或其他铁磁性材料制成。BNC嵌入在磁性微粒的聚集体的至少一部分大孔中，并且也可以驻留在磁性微粒的表面上。BNC可以通过磁性相互作用与磁性微粒的表面缔合。磁性微粒可以涂覆或可以不涂覆金属氧化物或贵金属涂层。在一些实施方案中，如上所述，将BNC-MMP组件并入(即嵌入)到连续的大孔支架中，以提供分级的催化剂组装。

在一些实施方案中，支架包含交联的水不溶性聚合物和大致均匀分布的包埋的磁性微粒(MMP)。交联的聚合物包括聚乙烯醇(PVA)和任选的其他聚合物材料。在制备支架的过程中，通过使用铸模，支架可以采用任何形状。备选地，可将支架研磨成微粒以用于生物催化剂反应。备选地，可以将支架成形为珠子以用于生物催化剂反应。备选地，支架可以是整体式的。还提供了制备和使用支架的方法。

在其他实施方案中，磁性大孔聚合性杂合支架包含交联的水不溶性聚合物和大致均匀分布的嵌入的磁性微粒(MMP)。该聚合物至少包含聚乙烯醇(PVA)，具有约50-500nm尺寸的MMP，约1至约50μm尺寸的孔，约20％至95％w/w的MMP，其中支架包含用于掺入生物纳米催化剂(BNC)的有效表面积，约为1-15m

个体磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适程度的磁性。例如，磁性纳米颗粒、BNC或BNC支架组装可具有至少或多达约5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度(Ms)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架组装优选具有不大于(即，多达)或小于5emu/g，和更优选地，多达或小于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、0.5emu/g或0.1emu/g的剩余磁化强度(Mr)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-支架组装的表面磁场可以为约或至少例如，约0.5、1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯(G)，或由上述任何两个值限定的范围内的磁场。如果包括微粒，则微粒也可以具有任何上述磁性强度。

取决于应用，可以使磁性纳米颗粒或其聚集体吸附合适量的酶，直至或低于饱和水平，以产生所得的BNC。在不同的实施方案中，磁性纳米颗粒或其聚集体可吸附约、至少、多至或小于例如1、5、10、15、20、25或30pmol/m2的酶。备选地，磁性纳米颗粒或其聚集体可以吸附大约、至少、多至或小于例如约饱和水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的量的酶。

磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适的孔体积。例如，磁性纳米颗粒或其聚集体可具有约，至少，多至或小于例如约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1cm3/g的孔体积，或上述值中的任何两个所限定的范围内的孔体积。

磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适的比表面积。例如，磁性纳米颗粒或其聚集体的比表面积可以为约，至少，多至或小于例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g。

MNP、其结构、组织、合适的酶和用途在WO2012122437，WO2014055853，国际申请号PCT/US16/31419和PCT/US17/26086以及US20180200701中有所描述。US20180200701公开了BNC的自动化连续生产。WO2018102319描述了磁固定的酶和辅因子系统。前述内容通过引用整体并入本文。

本发明提供了具有磁性捕获的单加氧酶(E.C.1.13)的BNC。在一个实施方案中，所述单加氧酶是P450(EC_1.14.-.-)。在一个优选的实施方案中，所述单加氧酶是人源的。(参见，例如，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2884625/.)在另一个优选的实施方案中，所述单加氧酶是细菌来源的。在其他优选的实施方案中，所述单加氧酶是藻类，真菌，植物或动物来源的。

在一些实施方案中，所述P450是人的。在其他实施方案中，人P450为不溶形式，并包埋在小泡状细胞器的膜中。细胞器可包含与单加氧酶一起起作用或增强单加氧酶活性的其他酶。在其他实施方案中，所述P450在超体(supersome)中。(参见，例如，Corning，https：//www.corning.com/worldwide/en/products/life-sciences/products/adme-tox-research/recombinant-metabolic-enzymes.html.)在其他实施方案中，所述P450在细菌体(bactosome)中。(例如，参见Cypex，http：//www.cypex.co.uk/ezcypbuf.htm.)

在一些实施方案中，所述P450单加氧酶包含来源选自灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛、绵羊和山羊的P450序列，或其衍生物。在其他实施方案中，所述P450单加氧酶包含P450序列，其来源选自昆虫、鱼、真菌、酵母、原生动物和植物。

细胞色素p450(CYP)(EC 1.14.13.-)是存在于所有生物中的NAPDH依赖性的氧化血红素蛋白的一个多样化家族。这些酶在组织之间具有不同的表达谱，执行异生物质或非内源性化学物质的代谢。(Denisov等人，Chem.Rev.105(6)：2253-78(2005)，通过引用整体并入本文。)CYP产生的代谢物比其母体化合物具有更高的溶解度，以促进从体内清除。CYP的底物范围很广并且在各种同等型之间变化，这些同等型能够进行羟基化，环氧化，脱氨基，脱烷基和脱芳基反应等。

作为对药物、消费品和食品添加剂开发的安全尽职调查的一部分，将组织微粒体和重组CYP用于产生代谢物以评估其毒性。然而，众所周知，CYP在工业中的使用具有挑战性，因为其通常具有较低的过程稳定性，并且由于作为CYP介导的氧化副产物而形成的活性氧种类(ROS)而易受氧化变性的影响。人CYP被膜结合并位于内质网中在细胞色素P450还原酶(CPR)和细胞色素b5附近，后者有时会改善CYP活性，而前者则是活性所需的。(图2)

本发明的P450可以进行脂族羟基化，芳族羟基化，环氧化，杂原子脱烷基化，炔烃氧化，杂原子氧化，芳族环氧化和NIH迁移，脱卤，脱氢，酯的还原和裂解。

本发明提供在BNC中使用其他代谢酶，其在I，II和III期代谢中产生代谢物。实例包括UDP-葡萄糖醛酸基转移酶，磺基转移酶，含黄素的单加氧酶，单胺氧化酶和羧酸酯酶。

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGT，EC2.4.1.17)催化葡糖醛酸部分向异生物质的添加。UGT途径是清除人体常用处方药，异生物质，饮食物质，毒素和内源性毒素的主要途径。

磺基转移酶的超家族(E.C.2.8.2.)是催化磺基从供体分子向受体醇或胺的转移的转移酶。最常见的磺基供体是3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(PAPS)。对于大多数异生物质和小的内源性底物，通常认为磺化是一种排毒途径，导致更多的水溶性产物，从而有助于它们通过肾脏或胆汁排泄。

含黄素的单加氧酶(FMO，E.C.1.14.13.8)进行异生物质的氧化以促进其排泄。这些酶可以氧化各种各样的杂原子，尤其是柔性亲核体，例如胺、硫化物和亚磷酸盐。该反应需要双氧，NADPH辅因子和FAD辅基。

单胺氧化酶(MAO，E.C.1.4.3.4)催化单胺的氧化脱氨基。氧用于从分子中除去胺基，产生相应的醛和氨。MAO是药理学中众所周知的酶，因为其是许多单胺氧化酶抑制剂药物作用的底物。

羧酸酯酶(E.C.3.1.1.1)将羧酸酯和H

在一些实施方案中，本发明的氧化还原酶是过氧化氢酶。过氧化氢酶(EC1.11.1.6)是可见于几乎所有暴露于氧气的活生物体的酶。其催化过氧化氢(H

在其他实施方案中，本发明的氧化还原酶是超氧化物歧化酶(例如，EC1.15.1.1)。这些是交替催化超氧化物(O

在其他实施方案中，氧化还原酶是葡萄糖氧化酶(例如葡糖氧化酶(Notatin)，EC1.1.3.4)。其催化葡萄糖氧化为过氧化氢和D-葡萄糖酸-δ-内酯。例如，其可用于生成过氧化氢作为氧化剂，用于消耗过氧化氢的酶(如过氧化物酶)。

在其他实施方案中，代谢酶是羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)。羧酸酯酶在自然界中广泛分布并且在哺乳动物肝脏中很常见。许多参与毒素或药物等异生物的I期代谢；然后将所得的羧酸与其他酶缀合以增加溶解度并最终排出。进化相关蛋白(彼此具有清晰序列同源性的那些)的羧酸酯酶家族包括许多具有不同底物特异性的蛋白，例如乙酰胆碱酯酶。

本发明提供了磁固定的P450催化系统，用于生产P450的化学代谢物。在一些实施方案中，最大化酶稳定性或活性，同时降低辅因子需求。在其他实施方案中，将酶固定化在可重复使用的磁性载体上以用于代谢物制造。在其他实施方案中，磁固定的P450提高了化学制造的生产能力，增强了酶的回收，或降低了成本和环境污染。在本发明的其他实施方案中，酶活性的损失最小或没有损失。在优选的实施方案中，仅约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16-20或20-30％的酶活性是损失的。在本发明的其他实施方案中，酶活性和生产率增加。在其他实施方案中，除P450外还将一种或多种酶磁固定。这可以促进将与磁性过程相结合的磁性材料应用于现有的制造基础设施中，或者实现绿色化学方法。

本发明提供了基于P450代谢酶/BNC的生物催化合成，其产生生物学上相关的代谢物，否则这些代谢物难以通过传统化学方法合成。在一些实施方案中，本发明模拟了生物体暴露于异生物后产生的代谢物的多样性。这在评估氧化的代谢物可能具有不利作用或相反比其衍生自的母体分子具有更高药理作用的药物评估中特别相关。在这里，代谢谱分析可以提高新药的安全性。(参见美国食品和药物管理局(FDA)的Metabolites in SafetyTesting guideline,http://www.fda.gov/downloads/Drugs/.../Guidances/ucm079266.pdf，通过引用将其全部内容并入本文。)通常，药物和化学物的代谢谱分析受到难以产生足够量的生物学相关代谢物或难以以高通量方式产生多种代谢物的限制。

P450细胞色素代表一种酶的基因超家族，其负责很多种异生物(包括药物)的氧化性代谢。Wrighton和Stevens,Crit.Rev.Tox.22(1):1-21(1992)；Kim等人,Xenobiotica 27(7):657-665(1997):Tang,等人J.Pharm.Exp.Therap.,293(2):453-459(2000)；Zhu等人,Drug Metabolism and Disposition 33(4):500-507(2005)；Trefzer等人Appl.Environ.Microbiol.73(13):4317-4325(2007)；Dresser等人ClinicalPharmacokinetics 38(1):41-57(2012)。为了在药物开发中产生药物代谢物，人肝微粒体、人重组微粒体或纯化的人重组P450单加氧酶是可商购的，但通常会受到工艺不稳定和活性水平差的困扰。Iribarne,等人,Chem.Res.Tox.9(2):p.365-373(1996)；Yamazaki等人,Chem.Res.Tox.11(6):p.659-665(1998)；Joo等人,Nature,399(6737):670-673(1999)。前述内容通过引用整体并入。

本发明的P450 BNC可以用于例如药物或特种化学品的制造中。在一些实施方案中，所制造的化合物是小分子。在其他实施方案中，所制造的化合物是活性药物成分(API)。在其他实施方案中，所制造的化合物是农业活性成分，例如杀虫剂。在其他实施方案中，所制造的化合物是活性成分例如激素和信息素。在其他实施方案中，所制造的化合物是调味剂、香料和食物着色剂。

P450酶不稳定并且众所周知难以在生物催化反应中使用。但是，它们是药物和异生物转化的代谢途径的主要组成部分，因此在药物代谢物的产生中起主要作用。人P450具有广泛的底物范围。例如，人类CYP1A1将EROD转化为试卤灵；人CYP1A2可将非那西汀转化为对乙酰氨基酚，并且对氯氮平，奥氮平，丙米嗪，普萘洛尔和茶碱具有活性；人类CYP2A6将香豆素转化为7-羟基香豆素；人CYP2B6将丁氨苯丙酮转化为羟基丁氨苯丙酮，并且还对环磷酰胺，依非韦伦(Efavirenz)，奈韦拉平，青蒿素(Artemisisin)，美沙酮和Profofol有活性；人CYP2C8将紫杉醇转化为6α-羟基紫杉醇；人CYP2C9将双氯芬酸转化为4'-羟基双氯芬酸，并且对氟比洛芬，布洛芬，萘普生，苯妥英，吡罗昔康甲苯磺丁脲和华法林有活性；人CYP2C19将美芬妥英转化为4'-羟基苯妥英，并且对阿米替林，环磷酰胺，安定，丙咪嗪，奥美拉唑和苯妥英也有活性；人CYP2D6将右美沙芬转化为去甲基右美沙芬，并且还对阿米替林，丙咪嗪，普萘洛尔，可待因，右美沙芬，地昔帕明和Bufaralol具有活性；人CYP2E1对于氯唑沙宗转化为6-羟基氯唑沙宗具有活性，并且还转化对乙酰氨基酚；人CYP2A4将咪达唑仑转换为1-羟基咪达唑仑，并且还对阿普唑仑，卡巴咪嗪，睾丸酮，环孢素，咪达唑仑，辛伐他汀，三唑仑和安定具有活性。

其他代谢酶，例如人UGT，将例如7-羟基香豆素转化为7-羟基香豆素葡糖苷酸，而人SULT将7-羟基香豆素转化为7-羟基香豆素硫酸盐。

在工业过程中使用单加氧酶的一个困难是辅因子再生，特别是β-1,4-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。NADPH太昂贵而无法化学计量地使用。因此，在一些实施方案中，本发明提供了与P450 BNC一起使用的辅因子再生组合物和方法。在优选的实施方案中，BNC与再循环酶一起使用。在更优选的实施方案中，再循环酶是葡萄糖脱氢酶(GDH)。在其他优选的实施方案中，再循环酶例如GDH与P450共固定。

本发明提供了使用磁性固定在BNC中的P450代谢酶的过程。在一些实施方案中，机器提供磁混合并捕获P450。

本发明提供了从编码酶多肽的核酸表达的酶。在某些实施方案中，编码酶多肽的重组核酸可与一个或多个调节核苷酸序列在表达构建体中可操作地连接。调节核苷酸序列通常将适合于用于表达的宿主细胞。对于多种宿主细胞，众多类型的合适的表达载体和合适的调节序列是本领域已知的。

通常，一个或多个调节核苷酸序列可包括但不限于，启动子序列，前导序列或信号序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，也可以是组合了超过一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体如质粒上，或者表达构建体可以插入染色体中。在一个具体的实施方案中，表达载体包括可选择标记基因，以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，该表达载体包含与至少一个调节序列可操作连接的编码酶多肽的核苷酸序列。用于本文的调节序列包括启动子，增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，考虑到要转化的宿主细胞的选择，期望表达的特定酶多肽，载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力或载体编码的任何其他蛋白质(如抗生素标志物)的表达来设计表达载体。

另一方面包括筛选通过本文所述核酸的组合诱变产生的组合文库的基因产物。这样的筛选方法包括，例如，将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，并在形成此类文库的条件下表达组合基因。筛选方法任选地进一步包括检测期望的活性并分离所检测的产物。如下所述的每个说明性测定法都适合进行必要的高通量分析，以筛选通过组合诱变技术产生的大量简并序列。

某些实施方案包括在微生物中表达核酸。一个实施方案包括在细菌系统中表达核酸，例如在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，大肠杆菌及其衍生物中表达核酸。示例性的启动子包括1-阿拉伯糖诱导的araBAD启动子(PBAD)，lac启动子，1-鼠李糖诱导的rhaP BAD启动子，T7 RNA聚合酶启动子，trc和tac启动子，λ噬菌体启动子P1和脱水四环素诱导型tetA启动子/操纵子。

其他实施方案包括在酵母表达系统中表达核酸。酵母载体中使用的示例性启动子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255：2073(1980))；其他糖酵解酶的启动子(Hess等人，J.Adv.Enzyme Res.7：149(1968)；Holland等人，Biochemistry17：4900(1978)。其他启动子来自例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，葡糖激酶醇氧化酶I(AOX1)，醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，和上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。任何含有酵母相容性启动子和终止序列，具有复制起点或没有复制起点的质粒载体均适用。特定酵母表达系统可购自，例如，Clontech Laboratories，Inc。(加利福尼亚州Palo Alto，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)的Pyex 4T家族的载体)，Invitrogen(加利福尼亚州Carlsbad,例如Ppicz系列Easy Select Pichia表达试剂盒)和Stratagene(加利福尼亚州La Jolla，例如，用于粟酒裂殖酵母(S.pombe)的ESP.TM.酵母蛋白质表达和纯化系统以及用于酿酒酵母的Pesc载体)。

其他实施方案包括在哺乳动物表达系统中表达核酸。合适的哺乳动物启动子的例子包括，例如，来自以下基因的启动子：仓鼠的泛素蛋白/S27a启动子(WO 97/15664)，猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子，腺病毒主要晚期启动子，小鼠金属硫蛋白I启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区，小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)，莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白，免疫球蛋白或热休克启动子(一种或多种)。在一个具体的实施方案中，使用酵母醇氧化酶启动子。

在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞中的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒例如多瘤病毒，禽痘病毒(UK2,211,504，1989年7月5日公开)，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子，免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段的形式获得，其还包含SV40病毒的复制起点。Fiers等人，Nature 273：113-120(1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为HindIII E限制性片段方便地获得。Greenaway，P.J.等人，Gene 18：355-360(1982)。前述参考文献通过引用整体并入。

其他实施方案包括在昆虫细胞表达系统中表达核酸。采用昆虫细胞宿主的真核表达系统可以依赖质粒或杆状病毒表达系统。典型的昆虫宿主细胞衍生自秋季行军虫(fallarmy worm)(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))。为了表达外源蛋白，用重组形式的杆状病毒苜蓿尺蠖(Autographa californica)核多角体病毒感染这些细胞，该重组形式具有在病毒多角体启动子的控制下表达的目的基因。受该病毒感染的其他昆虫包括商业上称为“High 5”(Invitrogen)的细胞系，该细胞系源自粉纹夜蛾(cabbage looper，Trichoplusiani)。有时使用的另一种杆状病毒是感染家蚕(Bombyx mori)的家蚕核多角体病毒。许多杆状病毒表达系统是可商购的，例如购自Thermo Fisher(Bac-N-Blue

在一些实施方案中，用表达本文所述核酸的载体转化细胞。用于将新的遗传物质插入包括动物和植物细胞的真核细胞中的转化技术是众所周知的。病毒载体可用于将表达盒插入宿主细胞基因组。或者，可以将载体转染到宿主细胞中。转染可通过磷酸钙沉淀，电穿孔，光学转染，原生质体融合，穿刺转染(impalefection)和流体动力学递送来完成。

某些实施方案包括在哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和Vero细胞中表达编码酶多肽的核酸。该方法任选地进一步包括回收酶多肽。

在一些实施方案中，本发明的酶与天然存在的酶同源。“同源物”是在核苷酸序列、肽序列、功能或结构水平上与参考分子相似的生物活性分子。同源物可以包括与参考序列具有一定百分比同一性的序列衍生物。因此，在一个实施方案中，同源或衍生序列共享至少70％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共享至少80％或85％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共享至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共享至少95％的序列同一性。在一个更具体的实施方案中，同源或衍生序列共享至少50、55、60、65、70、75、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性。同源或衍生核酸序列也可以通过它们在高严格性杂交条件下保持与参考核酸序列结合的能力来定义。与参考分子具有结构或功能相似性的同源物可以是参考分子的化学衍生物。检测、产生和筛选结构和功能同源物以及衍生物的方法是本领域已知的。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指如使用以下描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)或通过目视检查测量的，当比较和比对以获取最大对应性时，两个或更多个序列或子序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较的序列的一段区域上，例如一段功能域上，或者可替代地，存在于要被比较的两个序列的全长上。为了进行序列比较，通常将一个序列用作与测试序列进行比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列(一个或多个)相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的寻找相似性方法、通过这些算法的计算机实施Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，见下文)来进行。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。可通过美国生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得进行BLAST分析的软件。

本发明的另一方面包括在体外合成反应中合成的酶多肽。在一个实例中，体外合成反应选自无细胞蛋白合成、液相蛋白合成和固相蛋白合成，如本领域众所周知的。

为了可以更充分地理解本文所述的发明，阐述了以下实施例。应当理解，这些实施例仅用于示例说明目的，而不应以任何方式解释为限制本发明。

实施例

实施例1：柱销制造

用于制造柱销的材料是购自Formlabs的高温树脂(在0.45MPa 289℃，https：//formlabs.com/store/us/form-2/materials/high-temp-resin/)。使用计算机辅助设计对柱销建模，然后柱销导出到PreForm(Formlabs https://formlabs.com/tools/preform/)，在此对模型进行定向和支撑。使用Form 2(Formlabs https://formlabs.com/3d-printers/form-2/)打印机和高温树脂对柱销进行3D打印。打印后，将柱销在两次异丙醇浴中分别洗涤5分钟。将柱销从浴中移出并在室温风干。然后将柱销放置在后固化室中，并在60℃暴露于405nm的光下60分钟。最后，移去支撑物，并用水以及800和1200砂的砂纸湿磨柱销直至光滑。打印的柱销如图1所示。微板柱销阵列的图如图2所示。

实施例2：功能化的柱销涂层材料和方法

用于制造功能性柱销涂层的材料是氧化铁(II，III)(磁铁矿，Sigma-Aldrich<5μm颗粒，Cat#310069-500G)，羧甲基纤维素(CMC，Aqualon TM，CMC 7H3SXF PH，Ashland Cat#426352)，聚乙烯醇(PVA，89-98K 99％，Aldrich Cat#341584-500G)，纳米原纤化纤维素(NFC，3％w/w水分散体，缅因大学工艺开发中心)，无水柠檬酸(VWR)，黄原胶(100％纯度的Judee’s Gluten Free)和milli-Q水。

对于柱销涂层制备，将纳米原纤化纤维素(NFC)分散在水中，并在冰浴中以40％的振幅超声处理几秒钟。之后，将柠檬酸加入到NFC分散体中，并在连续搅拌下溶解几分钟。在搅拌混合物的同时，添加几毫升的聚乙烯醇(PVA)和羧甲基纤维素(CMC)水溶液。当分散体看起来均匀时，加入氧化铁(II，III)颗粒，并剧烈搅拌混合物。最后，将混合物在冰浴中以35％的振幅超声处理几秒钟。将产生的材料与柱销倒入硅酮模具中，并在-20℃至-196℃的温度范围内冷冻，然后在-12℃和低于100mTorr冻干，直至材料干燥。冷冻干燥后，将涂覆的柱销在烘箱中在130℃交联数分钟，并通过将材料用水冲洗几次来除去未反应的柠檬酸。

实施例3：柱销涂层制剂

在30秒脉冲打开和10秒脉冲关闭下通过以40％的振幅超声处理1分钟将1g的3％w/w的NFC分散体添加到6.3mL的水中来产生NFC的分散体。然后在500RPM下将80mg柠檬酸加入分散体中直至溶解。随后在700RPM搅拌下添加2.7mL 2％w/w的CMC和1.37mL 10％w/w的PVA水溶液。然后将823mg磁铁矿添加到先前的分散体中，以800RPM搅拌2分钟，然后在冰浴中以6秒脉冲打开和2秒脉冲关闭下以35％超声处理1分钟。

在另一种制剂中，将1g NFC分散在17.41mL的0.5％w/w的黄原胶水溶液和700μL的水中，然后如上所述进行超声处理。随后加入80mg柠檬酸。此后，在700RPM的搅拌下添加2.7mL 2％w/w的CMC和700μL15％v/v的PVA。当分散体看起来均匀时，加入823mg磁铁矿并在800RPM下搅拌，然后如上所述进行超声处理。图3显示了功能涂层柱销的一些示例。

在用金-钯靶溅射涂覆(7nm厚度)之后，在场发射扫描电子显微镜(FESEM，TescanMira3)下观察涂层材料的微观结构特征。交联的涂层材料的SEM图像示于图4。在图4A中，观察到菱形材料的整体结构。图4B示出了侧表面的更高分辨率的图像，该侧表面是材料中最主要的结构。

实施例4：固定化CYP3A4的储存和稳定性

在储存7天后固定化的CYP3A4是稳定的。开发了一种荧光测量替代底物测定法来评估游离和固定化CYP3A4的活性。CYP3A4微粒体购自Corning(cat.456202：人CYP3A4+P450还原酶+细胞色素b

该测定法测量了7-乙氧基试卤灵(7-ER)到试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。一式两份反应在37℃下在2mL试管中进行，反应体积为500μL，并在旋转器上混合1-18小时。CYP3A4反应包含6.25nM(3.125pmol)CYP3A4、100mM KHPO

将固定化的CYP粉末用5mM Tris(pH 7.5)洗涤两次，并悬浮在200μl的5mM TrispH 7.5、100mM海藻糖中。将样品(A)储存在4℃，(B)冷冻并储存在-20℃，以及(C)冷冻并储存在-80℃。1天、3天和7天后，将样品快速融化和/或温热至室温，并去除冷冻保护剂/冻干保护剂缓冲液，并用100mM KHPO

CYP3A4活性在7天的过程中没有减少。冷冻样品(B，C)的活性略低于在4℃储存的样品(A)的活性。

实施例5：延长的CYP3A4活性

当与游离CYP3A4相比时，在无细胞测定法中固定化的CYP3A4活性显著延长。CYP3A4微粒体(cat.456202：人CYP3A4+P450还原酶+细胞色素b

如先前在Corgie等人，Catalysis&Biocatalysis–Chemistry Today 34(5)：15-20(2016)(其通过引用全文并入本文)中所述制备氧化铁纳米颗粒(NP)。将它们在4℃以pH 11在N

开发了荧光测量替代底物测定法以评估游离的和固定化的CYP3A4的活性。该测定法测量了7-乙氧基试卤灵(7-ER)至试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。一式两份反应在37℃在2mL试管中进行，反应体积为500μL，并在旋转器上混合1-18小时。CYP3A4反应包含6.25nM(3.125pmol)CYP3A4、100mM KHPO

在1小时和18小时反应时间之间观察到从7-ER到试卤灵的转化增加280％和370％。(图2)

这些结果表明，固定化的CYP3A4在1小时后显示出活性，转化显著增加，范围为2.7倍-3.7倍。相比之下，游离CYP3A4在1小时时几乎完全失活。这表明固定化的CYP3A4可以在延长的时间中代谢底物并产生低清除的代谢物。另外，如在游离溶液中不存在添加的NADP或G6DH的情况下的活性所证实的，辅因子NADP和辅因子再生酶G6DH被成功地固定化并起作用。

实施例6：人肝微粒体固定化

人肝微粒体(

将HLM储备液(20mg/ml)在37℃浴中快速融化，并在补充有25mM蔗糖的冷的50mMTris pH 7.5中稀释至终浓度125μg/ml。将500μl HLM溶液添加到5mg磁铁矿粉末中，并在4℃孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：来自BioRad的Quick Start TM Bradford1x染料试剂#5000205)定量固定化产率。

开发了荧光测量替代底物测定法以评估游离的和固定化的HLM的活性。该测定法测量了7-乙氧基试卤灵(7-ER)至试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。一式两份反应在37℃在2mL试管中进行，反应体积为500μL，并在旋转器上混合1小时。HLM反应包含100mM KHPO

HLM的固定化产率一式三份地确定为96+/-2.9％。在相同浓度下相对于游离HLM的活性确定为55+/-4％(图3)。

合并的人肝微粒体几乎完全固定化，并且通过将其与游离HLM反应进行比较来显示其CYP3A4活性。这表明固定化CYP微粒体，包括其他微粒体(例如CYP2D6，CYP1A2，CYP2C9，UGT1A1)或其组合的广泛适用性。

实施例7：在柱销装置上的微粒体固定化

通过将PVA、CMC和柠檬酸(7％w/v)的悬浮液浇铸成圆柱销形状的薄壁铸件(thin-walled cast)并将其在-80℃冷冻(如实施例3中所述)，来构建酶柱销装置。将柱销在-12℃和＜100mTorr下冻干3天，并立即通过在烘箱中在160℃固化1小时交联。

CYP3A4微粒体(cat.456202：人CYP3A4+P450还原酶+细胞色素b

如先前所述制备氧化铁纳米颗粒(NP)，并在4℃以pH 11在N

CYP3A4活性：开发了荧光测量替代底物测定法以评估游离的和固定化的HLM的活性。该测定法测量了7-乙氧基试卤灵(7-ER)至试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。一式两份反应在37℃在2mL试管中进行，反应体积为200μL，并在定轨振荡器上以500rpm旋转1小时。CYP3A4反应包含100mMKHPO

柱销显示出高度多孔和海绵状的行为，并且容易吸收两份25μl体积的液体。通过Bradford方法测定的CYP3A4和CAT/G6DH/SOD的固定化产率为91.8+/-1.5％，相对于游离CYP3A4的活性为29.5％+/-3.8％。因此，通过毛细作用力依次吸入溶液，成功地将辅因子和ROS再循环酶系统以及CYP3A4均以浓缩储备液固定化。

实施例8：CYP2B6在磁铁矿粉末上的固定化和活性

CYP2B6是细胞色素P450酶家族的成员。该家族中的酶是参与药物代谢的单加氧酶。对于相同浓度的蛋白质，固定化的CYP2B6活性等于或大于游离酶的活性。

CYP2B6酶(

将CYP2B6储备液(1nmol/ml)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0中稀释至4pmol/ml的终浓度。将500μl的CYP2B6溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的Quick Start

使用发光底物测定法(Promega P450-Glo

CYP2B6的固定化产率一式三份地测定为85％+/-1％。相对于游离CYP2B6酶的活性测定为114％+/-3％。对于相同浓度的蛋白质，固定化的CYP2B6具有等于或大于游离酶的活性。从反应瓶中容易回收固定化的CYP2B6，仅留下反应混合物进行分析。

实施例9：固定化的CYP2B6的储存和稳定性

固定化的CYP2B6在储存14天时是稳定的。CYP2B6酶(

将CYP2B6储备液(1nmol/ml)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0中稀释至4pmol/ml的终浓度。将500μl的CYP2B6溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的Quick Start

使用发光底物测定法(Promega P450-Glo

固定化的CYP2B6粉末用5mM Tris(pH 7.0)洗涤两次，并悬浮在100μl的5mM TrispH 7.5、100mM蔗糖中。样品储存在-20℃。在2天、7天和14天后，样品在37℃浴中快速解冻，去除冷冻保护缓冲剂，并用100mM KHPO

固定化的CYP2B6保留大于或等于新鲜游离CYP2B6的50％活性(图9)。

实施例10：固定化在磁铁矿粉上的UGT1A6

UGT1A6是一种UDP葡萄糖醛酸基转移酶，是将小亲脂性分子转化为水溶性、可排泄代谢物的葡萄糖醛酸化途径中的一种酶。在相同的蛋白质浓度下，固定化的UGT1A6活性等于或大于游离的UGT1A6活性。

UGT1A6酶(

将UGT1A6储备液(5mg/mL)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0中稀释至25μg/mL的最终浓度。将500μl的UGT1A6溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的Quick Start

使用荧光测量测定法(BioVision UGT活性测定法/配体筛选试剂盒，Cat#K692)测量游离和固定化的UGT1A6的活性。该测定法利用高荧光UGT底物，并通过跟踪底物转化为非荧光葡萄糖醛酸苷时荧光发射的下降来测量UGT活性。通过比较荧光损失与在不存在所需辅因子UDPGA的情况下进行的对照反应来计算UGT比活性。以500μl反应体积在0.5打兰玻璃瓶(

UGT1A6的固定化产率一式三份测定为92％+/-1％(图10A)。在相同浓度，相对于游离UGT1A6酶的活性测定为109％+/-27％(图10A)。固定化的UGT1A6消耗平均0.63±0.16纳摩尔的BioVision UGT活性测定法底物，游离的UGT消耗平均0.58±0.39纳摩尔的底物(图10B)。固定化的UGT1A6容易地从反应瓶中回收，只留下反应混合物供分析。

实施例11：固定化的UGT1A6的储存和稳定性

UGT1A6酶(

将UGT1A6储备液(5mg/mL)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0中稀释至25μg/mL的最终浓度。将500μl的UGT1A6溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的Quick Start

使用荧光测量测定法(BioVision UGT活性测定法/配体筛选试剂盒，Cat#K692)测量游离和固定化的UGT1A6的活性。该测定法利用高荧光UGT底物，并通过跟踪底物转化为非荧光葡萄糖醛酸苷时荧光发射的下降来测量UGT活性。通过比较荧光损失与在不存在所需辅因子UDPGA的情况下进行的对照反应来计算UGT比活性。以500μl反应体积在0.5打兰玻璃瓶(

固定化的UGT1A6粉末用5mM Tris(pH 7.0)洗涤两次，并悬浮在100μl的5mM Tris(pH 7.5)、100mM蔗糖中。样品储存在-20℃。在1天和14天后，样品在37℃浴中快速解冻，去除冷冻保护缓冲液，并用100mM KHPO

实施例12：固定化在磁铁矿粉末上的CYP3A4

CYP3A4在磁铁矿粉上的固定化及活性。固定化反应缓冲液pH是固定化反应的重要参数。

CYP3A4酶(

将CYP3A4储备液(2nmol/ml)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0、pH 7.5或pH 8.0中稀释至6.25pmol/ml的最终浓度。将500μl的CYP3A4溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的QuickStart

开发了荧光测量替代底物测定法，以评估游离和固定化的CYP3A4的活性。该测定法测量7-乙氧基试卤灵(7-ER)到试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。在37℃，以500μl反应体积在2mL试管中进行一式两份反应，并在旋转器上混合1-18小时。CYP3A4反应包含6.25nM(3.125pmol)CYP3A4、100mM KHPO4 pH 7.5、2μM 7-ER、2.3mM MgCl2和2.3mM G6P，但缺乏辅因子再生系统(NADP、G6PDH)。产物(RFN)通过在535/587nm激发/发射处的荧光检测，并通过比较RFN标准曲线的荧光进行定量。

对于固定化缓冲液pH7.0、pH7.5和pH8.0，CYP3A4的固定化产率一式两份地测定为97％±0.4％、91％±5％和92％±0.5％(图12A)。在相同蛋白质浓度下，对于固定化缓冲液pH7.0、pH7.5和pH8.0的相对于游离CYP3A4酶的活性分别测定为35％±3％、30％±3％和36％±5％(图12B)。固定化的CYP3A4容易地从反应瓶中回收，只留下反应混合物供分析。

实施例13：固定化的CYP3A4的储存和稳定性

固定化的CYP3A4在储存14天是稳定的。CYP3A4酶(

将CYP3A4储备液(2nmol/ml)在37℃浴中快速解冻，并在冷的50mM Tris pH 7.0中稀释至6.25pmol/ml的最终浓度。将500μl的CYP3A4溶液添加到5mg磁铁矿粉中，并在4℃振荡孵育1小时。通过Bradford方法(Bradford试剂：BioRad的Quick Start

开发了荧光测量替代底物测定法，以评估游离和固定化的CYP3A4的活性。该测定法测量7-乙氧基试卤灵(7-ER)到试卤灵(RFN)的脱烷基。7-ER购自BioVision(细胞色素P450 3A4(CYP3A4)活性测定试剂盒；K701200)。在37℃，以500μl反应体积在2mL试管中进行一式两份反应，并在旋转器上混合1-18小时。CYP3A4反应包含6.25nM(3.125pmol)CYP3A4、100mM KHPO4 pH 7.5、2μM 7-ER、2.3mM MgCl2和2.3mM G6P，但缺乏辅因子再生系统(NADP、G6PDH)。产物(RFN)通过在535/587nm激发/发射处的荧光检测，并通过比较RFN标准曲线的荧光进行定量。

固定化的CYP3A4粉末用5mM Tris(pH 7.0)洗涤两次，并悬浮在100μl的5mM TrispH 7.5、100mM蔗糖中。样品储存在1)-4℃、2)-80℃、3)-20℃和4)冷冻干燥后储存在4℃。在1天、3天、7天和14天之后，样品在37℃浴中快速解冻，去除冷冻保护缓冲液，并用100mMKHPO

储存在4℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于游离CYP3A4分别保留55％±6％、54％±2％、55％±3％和44％±0.1％的活性。储存在4℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于新鲜固定化的CYP3A4分别保留75％±8％、74％±3％、75％±4％和60％±0.1％。储存在-80℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于游离CYP3A4分别保留46％±3％、48％±10％、53％±6％和51％±3％的活性。储存在-80℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于新鲜固定化的CYP3A4分别保留63％3％、65％13％、72％8％和69％4％。储存在-20℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于游离CYP3A4分别保留46％±4％、39％±3％、46％±1％和53％±3％的活性。储存在-20℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于新鲜固定化的CYP3A4分别保留63％±6％、53％±4％、62％±1％和72％±4％(图13A)。冷冻干燥然后储存在4℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于游离CYP3A4分别保留18％±12％、23％±1％、23％±0％和19％±4％的活性。冷冻干燥然后储存在4℃的固定化的CYP3A4在1、3、7和14天相对于新鲜固定化的CYP3A4分别保留25％±16％、31％±2％、31％±0.3％和25％±6％(图13B)。

示例性序列

SEQ ID NO:1

细胞色素P450 3A4同等型1[智人(Homo sapiens)]

MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNILSYHKGFCMFDMECHKKYGKVWGFYDGQQPVLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKSAISIAEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRREAETGKPVTLKDVFGAYSMDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDPFFLSITVFPFLIPILEVLNICVFPREVTNFLRKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELVAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVQQKLQEEIDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVVNETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGVVVMIPSYALHRDPKYWTEPEKFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLQNFSFKPCKETQIPLKLSLGGLLQPEKPVVLKVESRDGTVSGA

SEQ ID NO:2

细胞色素P450 1A2[智人]

MALSQSVPFSATELLLASAIFCLVFWVLKGLRPRVPKGLKSPPEPWGWPLLGHVLTLGKNPHLALSRMSQRYGDVLQIRIGSTPVLVLSRLDTIRQALVRQGDDFKGRPDLYTSTLITDGQSLTFSTDSGPVWAARRRLAQNALNTFSIASDPASSSSCYLEEHVSKEAKALISRLQELMAGPGHFDPYNQVVVSVANVIGAMCFGQHFPESSDEMLSLVKNTHEFVETASSGNPLDFFPILRYLPNPALQRFKAFNQRFLWFLQKTVQEHYQDFDKNSVRDITGALFKHSKKGPRASGNLIPQEKIVNLVNDIFGAGFDTVTTAISWSLMYLVTKPEIQRKIQKELDTVIGRERRPRLSDRPQLPYLEAFILETFRHSSFLPFTIPHSTTRDTTLNGFYIPKKCCVFVNQWQVNHDPELWEDPSEFRPERFLTADGTAINKPLSEKMMLFGMGKRRCIGEVLAKWEIFLFLAILLQQLEFSVPPGVKVDLTPIYGLTMKHARCEHVQARLRFSIN

SEQ ID NO:3

CYP2D6[智人]

MGLEALVPLAMIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYPPGPLPLPGLGNLLHVDFQNTPYCFDQLRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGRPFRPNGLLDKAVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKVLRFQKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLCIVVADLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVIHEVQRFGDIVPLGVTHMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHFLDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGVFAFLVTPSPYELCAVPR

SEQ ID NO:4

细胞色素P450-2E1[智人]

MSALGVTVALLVWAAFLLLVSMWRQVHSSWNLPPGPFPLPIIGNLFQLELKNIPKSFTRLAQRFGPVFTLYVGSQRMVVMHGYKAVKEALLDYKDEFSGRGDLPAFHAHRDRGIIFNNGPTWKDIRRFSLTTLRNYGMGKQGNESRIQREAHFLLEALRKTQGQPFDPTFLIGCAPCNVIADILFRKHFDYNDEKFLRLMYLFNENFHLLSTPWLQLYNNFPSFLHYLPGSHRKAIKNVAEVKEYVSERVKEHHQSLDPNCPRDLTDCLLVEMEKEKHSAERLYTMDGITVTVADLFFAGTETTSTTLRYGLLILMKYPEIEEKLHEEIDRVIGPSRIPAIKDRQEMPYMDAVVHEIQRFITLVPSNLPHEATRDTIFRGYLIPKGTVVVPTLDSVLYDNQEFPDPEKFKPEHFLNENGKFKYSDYFKPFSTGKRVCAGEGLARMELFLLLCAILQHFNLKPLVDPKDIDLSPIHIGFGCIPPRYKLCVIPRS

SEQ ID NO:5

细胞色素P450-2E1[智人]

MSALGVTVALLVWAAFLLLVSMWRQVHSSWNLPPGPFPLPIIGNLFQLELKNIPKSFTRLAQRFGPVFTLYVGSQRMVVMHGYKAVKEALLDYKDEFSGRGDLPAFHAHRDRGIIFNNGPTWKDIRRFSLTTLRNYGMGKQGNESRIQREAHFLLEALRKTQGQPFDPTFLIGCAPCNVIADILFRKHFDYNDEKFLRLMYLFNENFHLLSTPWLQLYNNFPSFLHYLPGSHRKAIKNVAEVKEYVSERVKEHHQSLDPNCPRDLTDCLLVEMEKEKHSAERLYTMDGITVTVADLFFAGTETTSTTLRYGLLILMKYPEIEEKLHEEIDRVIGPSRIPAIKDRQEMPYMDAVVHEIQRFITLVPSNLPHEATRDTIFRGYLIPKGTVVVPTLDSVLYDNQEFPDPEKFKPEHFLNENGKFKYSDYFKPFSTGKRVCAGEGLARMELFLLLCAILQHFNLKPLVDPKDIDLSPIHIGFGCIPPRYKLCVIPRS

SEQ ID NO:6

细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽9[智人]

MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIGIKDISKSLTNLSKVYGPVFTLYFGLKPIVVLHGYEAVKEALIDLGEEFSGRGIFPLAERANRGFGIVFSNGKKWKEIRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSIIFHKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIKILSSPWIQICNNFSPIIDYFPGTHNKLLKNVAFMKSYILEKVKEHQESMDMNNPQDFIDCFLMKMEKEKHNQPSEFTIESLENTAVDLFGAGTETTSTTLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVIGRNRSPCMQDRSHMPYTDAVVHEVQRYIDLLPTSLPHAVTCDIKFRNYLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFPNPEMFDPHHFLDEGGNFKKSKYFMPFSAGKRICVGEALAGMELFLFLTSILQNFNLKSLVDPKNLDTTPVVNGFASVPPFYQLCFIPV

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