2-氰基非那烯酮类化合物及其在白血病治疗中的应用

技术领域

本发明属于医药化学技术领域，涉及一类2-氰基非那烯酮类化合物，特别涉及6-环己基硫基-2-氰基非那烯酮类及其衍生物，具体涉及这些化合物在体外、活细胞内和活体内对热休克蛋白Hsp70和Bim蛋白二聚体的解离，从而特异性诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡，可作为慢性粒细胞白血病治疗药物的应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(CML)是一种以形成融合基因BCR-ABL为典型特征的恶性骨髓增殖性疾病。它的特点是产生大量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。目前,临床上针对BCR-ABL融合基因的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine KinaseInhibitor,TKI)的应用有效改善了CML患者的预后，但是耐药的产生仍是治愈CML的拦路虎。因此,寻找新型药物联合TKI协同治疗CML以期达到延缓疾病进程及逆转其对TKI产生耐药，一直是该领域研究者努力的方向。

Hsp70蛋白作为分子伴侣蛋白，在不同细胞环境和压力因素下通过招募不同的分子伴侣和辅助伴侣蛋白发生构象改变，结合并调控多种客户蛋白，以分子机器的形式和机制维持蛋白质组的稳定。由于其高表达不仅在正常细胞应激中发生，还与多种癌症(包括白血病)以及多种抗癌药的耐药性相关。新近的研究表面，Hsp70与某些辅助伴侣蛋白的复合物，而不是Hsp70的过量表达，是导致肿瘤发生的关键。热休克蛋白能够通过与不同的分子伴侣蛋白和辅助伴侣蛋白的蛋白蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPIs)，特异性结合并调控某些客户蛋白，激活了与肿瘤发生相关的信号通路。

近年来，凋亡的关键调控因子Bcl-2家族蛋白与Hsp70的相互作用开始被发现。其中，Bcl-2家族中的Bim被发现是Hsp70的辅助伴侣蛋白，结合于Hsp70蛋白NBD区的别构位点，抑制Hsp70的ATP酶活性，影响其SBD区(底物结合区)的构象和客户蛋白的折叠。尤其是，Hsp70/Bim二聚体水平在BCR-ABL阳性的慢性粒细胞白血病细胞中显著高于BCR-ABL阴性的其它白血病细胞和健康人外周血单个核细胞；通过干扰RNA技术下调慢性粒细胞白血病细胞中Hsp70和Bim的表达水平，结果下调了Hsp70的致癌客户蛋白Raf-1、AKT等并导致细胞大量凋亡，而在其它BCR-ABL阴性的白血病细胞中中却不能明显影响这些蛋白的水平，也无法导致明显凋亡。

综上所述，Hsp70/Bim二聚体通过稳定Hsp70的致癌客户蛋白Raf-1、AKT和EIF4e等保护慢性粒细胞白血病细胞逃避凋亡，是慢性粒细胞白血病的一个治疗靶点。因此，设计小分子摸拟Bim蛋白，竞争结合Hsp70蛋白表面与Bim发生PPI的结合区域，达到干扰Hsp70/Bim的PPI，杀伤肿瘤细胞的相关研究还未见报道。

发明内容

本发明旨在提供一类2-氰基非那烯酮类化合物，作为Hsp70/Bim蛋白-蛋白相互作用抑制剂，能够靶向性、高亲和力的抑制Hsp70/Bim蛋白相互作用，从而特异性诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡，可作为治疗慢性粒细胞白血病药物。

本发明提供一种2-氰基非那烯酮类化合物，具有如下通式I的结构：

其中：

R

R

所述的取代的C

所述的X选自(CH

进一步的，R

进一步的，所述的2-氰基非那烯酮类化合物，选自下述结构的化合物：

本发明进一步提供上述2-氰基非那烯酮类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)2,3-二氰基非那烯酮(合成方法的参考文献：1-Oxo-1H-phenalene-2,3-dicarbonitrile Heteroaromatic Scaffold:Revised Structure and MechanisticStudies,Romaric Lenk et al.,The Journal of Organic Chemistry,2014,79,9754-9761)与R

(2)化合物II与R

或者，化合物II与

化合物III与R

或者，化合物II与

本发明的另一目的是提供如上面定义的式I的化合物的立体异构体、可药用盐、溶剂合物、体内可水解的前体。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含前述至少一项化合物。

进一步的，所述化合物是组合物药物中唯一的活性成分或主要的活性成分。

进一步的，所述的药物组合物包括优选少于80％，更优选少于50％重量的本发明的化合物，以及混合有惰性可药用稀释剂、润滑剂或载体。

进一步的，对于片剂和锭剂，所述稀释剂、润滑剂和载体包括：乳糖、淀粉、滑石、硬脂酸；

进一步的，对于胶囊剂，所述稀释剂、润滑剂和载体包括：酒石酸或乳糖；

进一步的，对于注射液(液体剂)，所述稀释剂、润滑剂和载体包括：水、醇、甘油、植物油；

进一步的，对于栓剂，所述稀释剂、润滑剂和载体包括：天然或硬化油或蜡。

这些药物组合物可以经口服、胃肠道或通过局部施用于皮肤或粘膜局部给药，或经静脉内或肌内注射给药。

这些组合物可以为固体或液体，并且可以为通常在人类医学中使用的所有药物形式，例如简单的或糖包衣的片剂、锭剂、滴剂、可注射制剂、颗粒剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂或凝胶胶囊；它们是根据常规方法来制备的。在本申请中，可以将活性成分混合至通常用于这些药物组合物的辅料中，诸如阿拉伯胶、滑石、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、可可豆脂、动物或植物源性脂质、石蜡衍生物、水性或非水性载体、二醇、各种分散剂、润湿剂、乳化剂或防腐剂。

本发明进一步提供制备上述药物组合物的方法，该方法包括：将各成分混合或复合在一起，并且使混合的各成分形成片剂或栓剂，或将各成分装入胶囊，或将成分溶解以形成注射液。

本发明还提供所述化合物或所述组合物可以用于制备治疗或预防受益于调节Hsp70蛋白、Hsp70/Bim蛋白二聚体的疾病的药物中的应用。

进一步的，本发明的化合物在用于治疗疾病时，与体内的Hsp70蛋白结合，竞争性解离Hsp70/Bim蛋白二聚体，导致慢性粒细胞白血病细胞大量凋亡，从而达到抑制慢性粒细胞白血病细胞生长以及杀伤慢性粒细胞白血病细胞的效果。

进一步的，本发明的化合物可以为单独或联合使用用于治疗慢性粒细胞白血病。

进一步的，本发明的产品可以特别是单独给药或与化学治疗或放射治疗或者其组合联合给药，例如，与其它治疗药物联合给药，这样的其它治疗药物可以为通常使用的抗肿瘤药物。

在使用本发明的化合物治疗疾病时，给予患者治疗有效量的式I的化合物、其立体异构体、可药用盐、溶剂合物、体内可水解的前体或包含前述至少一项的组合物，其中所述治疗有效的量优选为0.01-10mg/kg，优选0.3-7mg/kg，更优选0.5-5mg/kg，更优选2-5mg/kg。

基于以上的发现，对于体重30千克至100千克的患者，可以将使用本发明的化合物制成单位剂量药物组合物。单位剂量的药物组合物包含0.3mg至1g的药物活性成分；优选单位剂量的药物组合物包含9mg至700mg。更优选单位剂量的药物组合物包含15mg至500mg的药物活性成分；更优选单位剂量的药物组合物包含60mg至500mg的药物活性成分。以上所述的剂量即为患者每日的剂量。然而，取决于所使用的药物化合物、所治疗的个体和出现问题的病症，该剂量式是可变的。

对于本申请所提及的用途、方法、药物和组合物，化合物的用量和给药的剂型当然可以随所使用化合物、给药模式和预期治疗目的而变化。当本发明的化合物以约0.01-10mg/kg体重的每日剂量给药时，通常得到满意的结果。这些剂量可以按分份剂量以每日1至4次给予，也可以以缓释的形式给予。对于人类，每日总剂量的可范围为9mg至700mg，更优选地为15mg至500mg，适于口服给药的单位剂型包括9mg至700mg化合物以及混有固态或液态可药用载体、润滑剂或稀释剂。

附图说明

图1.利用免疫共沉淀实验检测细胞中Hsp70/Bim二聚体的水平。

图2.K562细胞转染Hsp70和Bim干扰RNA后Hsp70和Bim蛋白表达水平相比野生型K562细胞的变化情况。

图3.小鼠急性毒性实验中三组小鼠平均体重变化趋势。

图4.化合物在荷瘤小鼠模型体内抑制慢性粒细胞白血病细胞生长活性实验，其中，(A)腹腔注射给药结束处死后小鼠照片；(B)腹腔注射给药结束后解剖剥取肿瘤组织照片；(C)腹腔注射给药结束后实验组和对照组的小鼠体重和瘤组织重量的对比。

具体实施方式

本发明以上所述及的所有技术方案中，使用的术语“烷基/烯基/炔基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。又如“C

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用原料和试剂等均可从化学或生物试剂公司购买或从已公开的方法制备。

实施例1：6-环己基硫基-2,3-二氰基非那烯酮(化合物1)的制备

(1)中间体A1的合成

分别取920mg(4.0mmol)2,3-二氰基非那烯酮，1162mg(10mmol)环己硫醇，加入100mL乙腈，室温反应6h，旋蒸除去溶剂。所的固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH

(2)化合物1的合成

取172mg(0.5mmol)中间体A1和3-氨基-1-丙醇(10mmol)溶于30mL乙腈，室温反应3h，旋蒸除去溶剂。所的固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH

化合物1的

实施例2：化合物2-27的制备

与实施例1类似，合成化合物2-27。其中化合物2-27的产率和表征数据等如下：

化合物2:产率14％。

化合物3:产率22％。

化合物4:产率20％。

化合物5：产率17％。

化合物6：产率12％。

化合物7：产率12％。

化合物8：产率21％。

化合物9：产率21％。

化合物10：产率18％。

化合物11：产率24％。

化合物12：产率22％。

化合物13：产率16％。

化合物14：产率19％。

化合物15：产率22％。

化合物16：产率22％。

化合物17：产率27％。

化合物18：产率25％。

化合物19：产率22％。

化合物20：产率23％。

化合物21：产率20％。

化合物22：产率14％。

化合物23：产率14％。

化合物24：产率18％。

化合物25：产率25％。

化合物26：产率21％。

化合物27：产率21％。

实施例3：化合物28的制备

取42mg(0.1mmol)化合物2溶于20mL甲醇，在0℃搅拌条件下滴加10mM浓度的NaOH水溶液2mL，室温反应12h。向反应液中加入50mL去离子水，用1M盐酸调节PH＝2，生成黄色固体。抽滤，所得固体用0℃甲醇(5mL)淋洗三次，得化合物28，为黄色固体，产率91％。

化合物28的

实施例4：化合物29的制备

分别取45mg(0.1mmol)化合物4、28mg(0.3mmol)溴代甲烷、69mg(0.5mmol)碳酸钾，溶于10mL DMF，在搅拌条件下85℃反应6h，旋蒸除去溶剂。所得固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH

化合物29的

实施例5：化合物30-34的制备

与实施例4类似，合成化合物30-34。化合物30-34的产率和表征数据等如下：

化合物30：产率71％。

化合物31：产率62％。

化合物32：产率60％。

化合物33：产率65％。

化合物34：产率74％。

实施例6：化合物35的制备

取21mg(0.1mmol)化合物28溶于10mL二氯甲烷，在0℃搅拌条件下依次加入57mg(0.15mmol)2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、26mg(0.2mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、13mg(0.12mmol)苯甲胺，室温反应2h，旋蒸除去溶剂。所得固体用硅胶柱层析分离，展开剂为CH

化合物35的

实施例7：化合物36-37的制备

与实施例6类似，合成化合物36-37。化合物36-37的产率和表征数据等如下：

化合物36：产率71％。

化合物37：产率64％。

实施例8：通过荧光偏振分析法检测上述化合物在体外解离Hsp70/Bim二聚体的能力

合成一个带有21个氨基酸的BimBH3肽段(氨基酸：79-99：QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标签(FAM-Bim)。竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Hsp70蛋白(300nM)，和FAM-Bim多肽(20nM)溶于反应缓冲液中(100mM K

按照上述相同的试验方法检测化合物1-37解离Hsp70/Bim二聚体的能力，以已知Hsp70抑制剂MKT-077、4-无取代和4-硫吗啉取代的非那烯化合物为对照。结果发现本发明的化合物1-37都能有效解离Hsp70/Bim二聚体，它们与Hsp70蛋白的竞争结合常数(K

表1.本发明的化合物解离Hsp70/Bim二聚体的能力实验结果

实施例9：通过流式细胞技术检测上述化合物诱导慢性粒细胞白血病细胞系的凋亡情况

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。膜联蛋白Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了FITC的膜联蛋白Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。而PI(碘化丙啶)是一种DNA染料，可在535nm左右的紫外光激发，在615nm处发出红色荧光。因此带有膜联蛋白V-FITC的细胞是发生了凋亡的细胞，而染上PI的细胞即为总的细胞量，通过统计不同的细胞数目，从而可以计算出发生凋亡的细胞比例。

本实验通过Annexin-V/propidium iodide staining by flow cytometry试剂盒(碧云天，苏州，中国C1063)检测化合物1-4、29-34(一系列不同浓度)用于人类慢性髓系白血病细胞株(K562、KCL22、BV173)、人乳腺癌细胞株MCF7、人子宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG2、人小细胞肺癌细胞株A549、人非小细胞肺癌细胞株H23、接近正常体细胞的人巨噬细胞株U937和人胚胎肾细胞株HEK293，24h后细胞凋亡情况。

主要的实验步骤如下：

1.细胞收集：上述化合物处理24小时后的悬浮细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为5×10

2.用孵育缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min；

3.用100μL的标记溶液(Annexin-V/PI)重悬细胞，室温下避光孵育10～15min；

4.500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次；

5.加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，通过流式细胞仪，检测化合物诱导细胞的凋亡情况。以未加入检测化合物的作为对照组。

流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。据此结果统计凋亡细胞占总细胞数的百分比，然后以log

表2.本发明化合物凋亡诱导半数起效浓度(EC

结果显示，本发明的化合物对于慢性粒细胞白血病细胞系如K562、KU812、KCL22等，能够高效的诱导肿瘤细胞凋亡(EC

实施例10：细胞中Hsp70/Bim二聚体的水平与本发明的化合物的关系

首先检测慢性粒细胞白血病细胞中Hsp70/Bim二聚体的水平。常规培养人慢性粒细胞白血病细胞(K562、KCL22、BV173、KU812)、人子宫颈癌细胞系Hela、人肝癌细胞株HepG2、人小细胞肺癌细胞株A549、人非小细胞肺癌细胞株H23、接近正常体细胞的人巨噬细胞株U937和人胚胎肾细胞株HEK293。达到10

将上述实验中不同肿瘤、正常细胞中免疫沉淀复合物里Bim的含量与实施例9中化合物1-4、29-34在相应细胞中诱导凋亡的EC

实施例11：化合物诱导细胞凋亡依赖Hsp70/Bim二聚体的存在

通过干扰RNA实验验证本发明的化合物诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡依赖于Hsp70和Bim。pGenesil质粒用来表达干扰RNA。干扰序列分别为靶向Hsp70：5’-GGGTTTCATCCAGGATCGA-3’，靶向Bim 5’-CAGGACACAGAGGAGGTTT-3’。干扰质粒转染利用Lipofectamine 2000。人慢性粒细胞白血病细胞K562经常规培养，密度达到10

人慢性粒细胞白血病细胞K562经常规培养，密度达到10

表3.本发明化合物对转染Hsp70和Bim干扰质粒后的人慢性粒细胞白血病细胞K562凋亡诱导半数起效浓度(EC

实验结果显示，Hsp70和Bim分别缺失的人慢性粒细胞白血病细胞K562中，化合物1-4、29-34诱导凋亡的能力相比野生型实验组均被阻碍。上述结果表明：本发明的化合物诱导凋亡依赖Hsp70和Bim两种蛋白，即化合物诱导细胞凋亡依赖Hsp70/Bim二聚体的存在。

实施例12：本发明化合物的安全性能

通过小鼠急性毒性试验考察本发明化合物的安全性能，本实验以最具代表性的化合物3为例，说明实验过程。

早晨9:00选取6只雄性Balb/C小鼠(体重在28.3-29.3g范围内)随机分为3组，分别称取体重，并计算平均值，当晚9点禁食，不禁水。

配制化合物3药物，分为3个剂量组，A组(给药终浓度3mg/kg)、B组(给药终浓度5mg/kg)和对照组C组(50％DMSO(溶剂))按体重腹腔注射药物，至实验终浓度。C组给予同等量DMSO溶液，各组加药条件如表4所示。

表4.小鼠急性毒性试验中各组小鼠体重和加药剂量

第二天早晨9:30注射药物完毕，并称取各组小鼠的体重，然后每天早晨9:30分别称量各组小鼠的体重并观察小鼠的状态，实验进行7天。

实验结果显示，给药后A，B，C组小鼠均出现状态萎靡，约1小时后均正常进食，实验过程中A、B、C组6只小鼠生活状态良好，皮毛齐整，眼睛红亮，无不良反应，无死亡，进食进水正常，体重有明显增加。小鼠每日体重变化数据如图3。

将上述称量完体重后的小鼠脱臼处死，解剖观察并取肝组织进行下一步实验。

解剖观察：对6只小鼠进行解剖，观察内脏的特点，发现加药组(A、B组)和对照组(C组)的小鼠，没有明显区别；肾脏、心脏的颜色正常，鲜红，无毒理表现；肝脏为正常颜色，形状正常，无畸变，没有发现毒理症状。如表5所示，三组小鼠肝脏平均重量无明显差别，肝脏重量与小鼠体重成正相关。A、B组小鼠肝脏组织石蜡包埋切片，HE染色未见炎症反应。

表5.腹腔注射后第7天解剖6只小鼠的肝脏重量和体重

小鼠急性毒性试验结论：一次性注射高达5mg/kg的化合物3对小鼠无明显毒副作用。解剖实验进一步证明，化合物3对小鼠的内脏没有毒理效应；体重监测，可以看出化合物3对小鼠的体重有没有明显的影响。

化合物1-2，4，29-34均使用相同方法测定小鼠急性毒性，结果显示化合物1-2，4，29-34对小鼠的内脏均没有毒理效应，且对小鼠的体重没有明显影响。

实施例13.化合物在荷瘤小鼠模型体内抑制慢性粒细胞白血病细胞生长活性

根据急性毒性测试结果，随机选取2组6周龄裸鼠(每组4只)，皮下移植人白血病细胞系K562细胞，一组作为对照，另一组每天注射0.3mg/kg化合物3。具体实验内容如表6所示。

表6.化合物对小鼠的体内抑制慢性粒细胞白血病活性的实验内容

小鼠试验结论：如图4所示，从本试验的数据看出，本发明的化合物3在5mg/kg的剂量以下对小鼠没有明显毒副作用，以0.3mg/kg的剂量给移植人慢性粒细胞白血病的裸鼠连续给药14天，发现用药组的小鼠的肿瘤块大小明显小于对照组，肿瘤抑制率达到50％(按瘤重计算)，而且相对于对照组体重没有明显变化。

化合物1-2，4，29-34均使用相同方法测定在小鼠模型体内抑制慢性粒细胞白血病细胞生长活性，结果显示化合物1-2，4，29-34的肿瘤抑制率均在50％以上(按瘤重计算)。上述结果表明：本发明中的化合物可以有效抑制慢性粒细胞白血病细胞的生长，且无明显毒副作用，可以有效用于慢性粒细胞白血病的预防和治疗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。